宮頸鱗癌患者宮頸液基脫落細胞中P16、P53蛋白及HPVE6/E7 mRNA的表達

童婷婷,馬 杰,董麗杰,王 莉#

1)鄭州大學附屬腫瘤醫院婦瘤科 鄭州 450000 2)鄭州大學附屬腫瘤醫院分子病理科 鄭州 450000

宮頸鱗癌患者宮頸液基脫落細胞中P16、P53蛋白及HPVE6/E7mRNA的表達

童婷婷1),馬 杰2),董麗杰1),王 莉1)#

1)鄭州大學附屬腫瘤醫院婦瘤科 鄭州 450000 2)鄭州大學附屬腫瘤醫院分子病理科 鄭州 450000

宮頸鱗癌；P16；P53；HPV E6/E7mRNA；宮頸液基細胞學

目的：探討宮頸液基脫落細胞中P16、P53蛋白及HPV E6/E7 mRNA的表達情況。方法采用支鏈DNA技術及細胞涂片免疫組化的方法檢測182例宮頸鱗癌患者宮頸液基脫落細胞中P16、P53蛋白及HPV E6/E7 mRNA的表達水平。結果宮頸液基脫落細胞中P16表達與淋巴結轉移、病理分級有關(P<0.05)，P53表達與淋巴結轉移、臨床分期、病理分級有關(P<0.05)，HPV E6/E7 mRNA表達與患者臨床分期、淋巴結轉移有關(P<0.05)；HPV E6/E7 mRNA與P16蛋白表達呈正關聯(rP=0.444，P<0.001)，與P53蛋白表達不具有關聯性(P=0.125)；P53蛋白與P16蛋白表達呈正關聯(rP=0.505，P<0.001)。結論宮頸液基脫落細胞中HPV E6/E7 mRNA、P16、P53檢測可能對宮頸癌預后評估有重要價值。

宮頸癌是威脅婦女健康的常見惡性腫瘤之一，據統計有超過85%的病例發生在發展中國家。在我國宮頸癌發病率居女性惡性腫瘤的第二位，死亡率卻居于首位[1-2]。因此評估影響宮頸癌預后的相關因素尤為重要。結合臨床可知影響宮頸癌預后的臨床病理因素有很多，如年齡、臨床分期、病理類型、病理分級、腫瘤大小、淋巴結轉移情況等。宮頸癌的發生發展與許多生物學標志物密切相關，其中HPV E6/E7蛋白為宮頸上皮細胞內瘤變或癌變發生發展的主要轉化蛋白[3]，P16和P53蛋白也在宮頸癌發生發展進程中起著至關重要的作用。該研究擬在宮頸鱗癌患者宮頸脫落細胞中采用支鏈DNA技術檢測HPV E6/E7 mRNA，采用細胞涂片免疫組化方法檢測P16、P53蛋白的表達情況，現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料回顧性分析鄭州大學附屬腫瘤醫院婦科2014年1月至2016年1月間182例宮頸癌患者的臨床病理資料。患者28～80歲，中位年齡50歲；均經病理學確診為鱗癌，排除腺癌、神經內分泌等其他組織學類型；其中Ⅰ期91例，ⅡA期29例，ⅡB期41例，Ⅲ期18例，Ⅳ期3例；術前均未接受過放化療；術后病理或放療前影像學示盆腔淋巴結轉移者82例，無淋巴結轉移者100例；病理分級為G1 40例，G2 88例，G3 54例。

1.2宮頸液基薄層細胞學取樣窺陰器充分暴露宮頸，用棉拭子將宮頸過多的分泌物擦去，將宮頸刷置于宮頸口鱗柱交界區，輕輕搓動宮頸刷使其順時針旋轉3～5圈，停留10秒以上，取出宮頸刷，將其放入裝有細胞保存液的樣本管中。在管口處將多余的刷柄折斷，將刷頭留在樣本管中，旋緊管蓋，填寫基本信息并保持樣本管直立放置，送檢。一部分用于HPV E6/E7 mRNA檢測，另一部分制成細胞涂片檢測P16和P53蛋白的表達水平。

1.3P16、P53蛋白的檢測取宮頸液基薄層細胞學標本5 mL制成細胞涂片，于體積分數85%乙醇中固定15 min，10 g/L吐溫稀釋液細胞打孔5 min，以體積分數3%雙氧水洗滌3 min以去除過氧化物酶，PBS沖洗3次后加入一抗P16、P53鼠抗人單克隆抗體(上海基因科技有限公司)，37 ℃孵育1 h，PBS緩沖液沖洗3次，加辣根過氧化物酶標記的二抗37 ℃孵育30 min，PBS沖洗3次，DAB(上海基因科技有限公司)顯色，顯微鏡(BX51，Olympus)下觀察，蘇木精染色，梯度乙醇脫水，封片。P16陽性細胞表現為胞核或胞漿棕黃色著色，P53陽性細胞表現為胞核棕黃色著色。每例制備2張切片，每張切片選擇10個高倍視野，共計數100個細胞，計算陽性細胞百分率；由兩名經驗豐富的病理科醫師同時讀片，取其平均值。評判標準參見文獻[4]。P53：無陽性細胞為陰性表達，有陽性細胞為陽性表達。P16：陽性細胞百分率<10%為陰性表達，≥10%為陽性表達。

1.4HPVE6/E7mRNA的檢測采用支鏈DNA技術檢測。具體操作步驟：裂解細胞以釋放總RNA，雜交捕獲目的RNA后分別與預放大分子、放大分子結合，雜交結合標記有堿性磷酸酶的支鏈DNA探針，添加底物與標記探針上的堿性磷酸酶結合生成化學發光信號，在冷光儀(QuantiVirusTM，新鄉科蒂亞生物技術有限公司)上進行檢測，讀取實驗結果。檢測結果值≥1.0為陽性。

1.5統計學處理采用SPSS 21.0進行數據處理。不同臨床病理特征患者3個指標陽性表達率的比較采用χ2檢驗，3個指標表達的關聯性應用列聯系數評估，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1不同臨床病理特征宮頸鱗癌患者宮頸脫落細胞中P16、P53蛋白和HPVE6/E7mRNA的表達

見圖1、表1。宮頸脫落細胞中P16陽性表達率為66.5%(121/182)，其表達與淋巴結轉移、病理分級有關(P<0.05)；P53陽性表達率為65.4%(119/182)，其表達與臨床分期、淋巴結轉移、病理分級有關(P<0.05)；HPV E6/E7 mRNA陽性表達率為89.0%(162/182)，其表達與患者臨床分期、淋巴結轉移有關(P<0.05)。

2.2宮頸鱗癌患者宮頸脫落細胞中P16、P53蛋白及HPVE6/E7mRNA表達之間的關系HPV E6/E7 mRNA與P16表達呈正關聯,與P53表達無關聯性，見表2。P53與P16蛋白表達呈正關聯，見表3。

圖1 P53(A)、P16(B)蛋白的表達(SP,×400)

*：校正χ2檢驗。

表2 宮頸鱗癌患者宮頸脫落細胞中HPV E6/E7 mRNA與P16、P53表達的關系 例

*：rp=0.444，P<0.001；#：rp=0.113，P=0.125。

表3 宮頸脫落細胞中P16與P53表達的關系 例

rp=0.505，P<0.001。

3 討論

HPV基因的E區有6個開放性閱讀框架，其中E6、E7基因對宮頸癌的發生發展意義重大，其編碼蛋白是使宮頸正常細胞發生惡變的主要轉化蛋白。P53基因是迄今為止發現的與人類腫瘤相關性最高的抑癌基因。野生型P53蛋白半衰期短、含量低，普通免疫組化法檢測到的P53蛋白多為其突變體。p16是一種抑癌基因。研究[3]發現HPV E6可與P53相互作用，使P53蛋白降解而失去抑癌作用，使得宿主細胞發生惡變的機會增加。HPV E7則作用于Rb，使其失去活性，失活后的Rb基因可反向激活多種轉錄因子，其中與DNA順式作用元件的結合可激活p16基因轉錄，造成P16蛋白的高度活化[3]，使得P16和Ki-67表達水平上升，進而引起細胞周期紊亂，導致細胞惡變。E6蛋白還可促進端粒逆轉錄酶活性，穩定和修復染色體端粒末端的重復DNA序列，從而引起細胞無限制增殖[5]。

目前國內外對P16、P53蛋白的檢測大多采用組織蠟塊免疫組化法，此方法需要進行宮頸活檢、錐切或手術切除以獲取標本，給患者造成了不同程度的損傷。采用細胞涂片免疫組化法，只需取患者的宮頸液基脫落細胞即可進行檢測，標本的獲取比較方便且無創。該研究利用支鏈DNA技術檢測了宮頸鱗癌患者宮頸液基脫落細胞中HPV E6/E7 mRNA的表達，采用細胞涂片免疫組化法檢測P16、P53蛋白的表達。結果顯示：臨床分期晚、有淋巴結轉移的患者宮頸液基脫落細胞中HPV E6/E7 mRNA陽性率較高；病理學分級差(分化程度低)，有淋巴結轉移的患者P16蛋白陽性表達率較高，與Lin等[6]、朱鳳琴等[7]、Queiroz等[8]的研究結果相似；臨床分期晚、病理學分級差、有淋巴結轉移的患者P53蛋白陽性表達率較高，與Liu及陳曉露等[9-10]的研究結果相似。但是樓朝霞等[11]發現宮頸癌組織中P53及P16的表達與臨床分期及病理分級有關，與年齡、淋巴結轉移無關。研究之間存在的這些差異值得進一步的探討，但結果還是提示宮頸液基脫落細胞中HPV E6/E7 mRNA、P16、P53蛋白的表達與宮頸鱗癌預后的相關臨床病理因素之間有著密切聯系。

該研究還發現，宮頸鱗癌患者宮頸液基脫落細胞中HPV E6/E7 mRNA與P16蛋白表達呈正關聯，P53與P16蛋白的表達呈正關聯。提示宮頸液基脫落細胞中P16的表達與HPV感染關系密切，與Chew等[12]、傅小一等[13]的研究結果一致；P53與P16蛋白的聯合檢測可能對預后的評估更有意義。該研究未發現HPV E6/E7 mRNA與P53蛋白表達之間存在關聯。有學者[14]研究發現p53及E6基因都存在許多變體，二者不同變體之間的相互作用不盡相同，從而導致它們對宮頸癌的作用存在個體差異。這些變體的分布可能與地域因素有關。R8Q和R10Q的變化可以減弱E6對P53的降解能力，但是其他變體的作用目前還不明確。

綜上所述，宮頸液基脫落細胞中HPV E6/E7 mRNA及P16、P53蛋白的表達與宮頸鱗癌關系密切，可在非創傷情況下檢測，可能對宮頸癌患者預后的評估和指導臨床治療意義重大。

[1] 趙旭曄,崔勇,姜淑芳,等.高危型人乳頭瘤病毒E6/E7 mRNA檢測在宮頸癌篩查中的意義[J].中華醫學雜志,2014,94(43):3432

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[11]樓朝霞,梅麗娜.宮頸癌組織中突變型p53基因的表達及其臨床意義[J].海南醫學,2013,24(9):1272

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(2016-11-01收稿 責任編輯王 曼)

Expressions of P16, P53 proteins and HPV E6/E7 mRNA in cervical liquid-based cells from cervical squanmous cell carcinoma patients

TONGTingting1)，MAJie2)，DONGLijie1)，WANGLi1)1)DepartmentofFemaleTumor,theAffiliatedTumorHospital，ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450000

2)DepartmentofMolecularPathology,theAffiliatedTumorHospital，ZhengzhouUniversity，Zhengzhou450000

cervical squamous cell carcinoma;P16;P53;HPV E6/E7 mRNA;cervical liquid-based cytology

Aim: To investigate the value of detection of P16, P53 proteins and HPV E6/E7 mRNA in liquid-based cells of cervical squanmous cell carcinoma patients. Methods: The expressions of HPV E6/E7 mRNA, P16 and P53 proteins were detected by branch-DNA and immunohistochemical method in liquid-based cells from 182 patients with cervical squamous cell carcionma. Results: The expression of HPV E6/E7 mRNA in liquid-based cells was related with lymph node metastasis and clinical stage(P<0.05),the expression of P16 was related with lymph node metastasis and histology classification(P<0.05),and that of P53 was related with lymph node metastasis,clinical stage and histology classification(P<0.05). HPV E6/E7 mRNA in liquid-based cells was positively associated with the expression of P16(rP=0.444,P<0.001),but not with P53(P=0.125). The expression of P53 protein was positively associated with that of P16(rP=0.505,P<0.001). Conclusion: HPV E6/E7 mRNA,P16 and P53 protein detection in liquid-based cells may be valueable for predicting the prognosis of cervical cancer.

10.13705/j.issn.1671-6825.2017.05.030

R737.33

，女，1964年8月生，學士，主任醫師，研究方向：婦科腫瘤的基礎與臨床，E-mail：2082772078@qq.com