COPD大鼠原代肺動脈平滑肌細胞中MCP-1、TGF-β1和TLR4蛋白的檢測*

蔣 明 ，王昌明，韓旭惠，楊 丹，馬禮兵，陳 峰，呂 倩

桂林醫學院附屬醫院呼吸內科 廣西桂林 541001

COPD大鼠原代肺動脈平滑肌細胞中MCP-1、TGF-β1和TLR4蛋白的檢測*

蔣 明 ，王昌明#，韓旭惠，楊 丹，馬禮兵，陳 峰，呂 倩

桂林醫學院附屬醫院呼吸內科 廣西桂林 541001

慢性阻塞性肺疾病；Toll樣受體4；單核細胞趨化蛋白-1；轉化生長因子-β1；大鼠

目的：探討慢性阻塞性肺疾病(COPD)大鼠遠端原代肺動脈平滑肌細胞(PASMCs)中單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)、轉化生長因子-β1(TGF-β1)的分泌情況及其與Toll樣受體4 (TLR4)信號通路的相關性。方法通過脂多糖(LPS)誘導建立大鼠COPD模型，分離培養、鑒定原代大鼠PASMCs，以LPS誘導PASMCs，然后分組(對照組、LPS組、TAK-242組，LPS+TAK-242組)培養細胞，用Western blot法檢測各組PASMCs中TLR4的表達，ELISA法檢測細胞培養上清液MCP-1、TGF-β1的濃度，并進行相關性分析。結果LPS組較對照組PASMCs中TLR4的表達水平上調(P<0.05)，細胞培養上清液中MCP-1、TGF-β1的含量升高(P<0.05)；TAK-242組PASMCs中TLR4的表達水平下調(P<0.05)，上清液中MCP-1、TGF-β1與TLR4無相關性。結論LPS可誘導大鼠原代PASMCs合成分泌MCP-1、TGF-β1，同時上調TLR4表達水平。

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)主要的病理特征為血管炎癥反應和血管重塑。肺動脈平滑肌細胞(pulmonary artery smooth muscle cells，PASMCs)是肺血管重塑的主要效應細胞。研究[1-3]表明，當受到有害因素刺激時，PASMCs表型發生轉化，合成、分泌炎癥因子及基質蛋白的活性增加，募集炎癥細胞聚集和炎癥級聯放大，并促進PASMCs的增殖和遷移，促進肺血管重塑。單核細胞趨化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1， MCP-1)是一種趨化性細胞因子，可趨化激活巨噬細胞，參與介導繼發性炎癥反應[4]。轉化生長因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)屬于TGF-β家族，是近年來新發現的調節細胞生長、分化的活性多肽類物質，對細胞的生長和分化等多種病理、生理過程有重要調節作用[5]。有研究[6]報道，與正常人比較，急性加重期和緩解期COPD患者血清MCP-1、TGF-β1的水平明顯升高。Toll樣受體4 (Toll-like receptor 4，TLR4)是第一個被發現的哺乳動物TLR，可被肽聚糖及脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)等激活來調節炎癥反應[7]。作者通過建立COPD大鼠模型，分離培養大鼠原代PASMCs，探究COPD大鼠PASMCs合成、分泌MCP-1、TGF-β1的水平同TLR4信號通路的關系。

1 材料與方法

1.1實驗動物、主要試劑和儀器SPF級Wistar大鼠24只，雌雄各半，體重(200±20)g，6～8周齡，購自桂林醫學院動物實驗中心，大鼠在室溫、安靜和避強光環境中自由飲水和進食。實驗動物合格證號：SCXKG 2014-0001。LPS(美國 Sigma 公司)，翻蓋紅色金牌黃果樹香煙(貴陽卷煙廠出品，焦油量15 mg，煙氣煙堿量1.2 mg)，DMEM培養基、胎牛血清(美國Gibco公司)，TLR4鼠單克隆抗體(美國Abcam公司)，辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠二抗、β-actin小鼠單克隆抗體(北京中杉金橋生物技術有限公司)，總蛋白提取試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司)，DAB顯色試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)，ELISA 試劑盒(美國 BENDER 公司)，自制91 cm×42 cm×62 cm有機玻璃艙，倒置相差顯微鏡(日本 Olympus)，美國Bio-Rad公司蛋白電泳及轉膜儀、450型全自動酶標儀。

1.2動物模型的建立Wistar大鼠適應環境1周后，模型組于實驗第1、14天經氣道內注入LPS，每次200 μg/只，予自制有機玻璃艙內煙熏1 h/d，共8周，艙內有小孔可與外界空氣相通，保持艙內氣壓與外界相等，艙內放置適量無水氯化鈣吸收水分、保持干燥。對照組于實驗第1、14天經氣道注入等量生理鹽水，其他不做任何處理，與模型組大鼠在同等條件下飼養8周。

1.3大鼠遠端原代PASMCs分離、培養及鑒定采用酶消化法結合組織塊貼壁法。Wistar 大鼠腹腔注射100 g/L水合氯醛麻醉，體積分數75%乙醇浸泡大鼠5 min，開胸取心肺，取肺動脈3級以下分支，分離血管中膜，Ⅰ型膠原酶37 ℃水浴消化15～20 min，離心、吸出消化酶，加入含體積分數25%胎牛血清的DMEM高糖培養液，置 37℃、體積分數5%CO2培養箱內培養，4 d左右可見細胞從組織塊周圍萌出，10 d左右細胞生長融合達培養瓶的90%以上時即消化傳代，選用第3～6代(達對數生長期)細胞用于該實驗。PASMCs細胞爬片行免疫細胞化學染色鑒定。

1.4PASMCs中TLR4蛋白含量的Westernblot檢測用LPS、TAK-242干預細胞后按如下方法進行分組(每組均設6個復孔)：對照組不做任何處理；LPS組加入LPS(終質量濃度為1 mg/L)，TAK-242組(終濃度為1 μmol/L)、LPS+TAK-242組(LPS終質量濃度為1 mg/L，TAK-242終濃度為1 μmol/L)培養24 h。提取PASMCs總蛋白，測定總蛋白濃度，計算上樣量后上樣，使每孔蛋白總量一致，然后進行SDS-PAGE凝膠電泳約120 min；轉膜，將PVDF膜用封閉液封閉2 h，加入TLR4單抗(按11 000稀釋)4 ℃過夜，TBST漂洗膜3次， 10 min/次；二抗山羊抗鼠IgG(按15 000稀釋)室溫孵育2 h，最后發光，所得圖像用Imag J軟件進行灰度值分析。

1.5各組細胞培養上清液中MCP-1、TGF-β1水平的ELISA法檢測細胞培養、分組和樣本量同1.4。采用450型 ELISA 酶標儀，于波長595 nm處測定光密度值，利用 Revelation Spectra MR軟件繪制標準曲線，通過標本的光密度值在標準曲線上得到標本的MCP-1、TGF-β1濃度。具體操作步驟按照試劑盒說明。

1.6統計學處理采用SPSS 18.0統計軟件分析數據，應用2×2析因設計的方差分析比較各組PASMCs中TLR4蛋白含量和細胞培養上清液中MCP-1、TGF-β1水平的差異，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1大鼠COPD建模的HE染色判斷及PASMCs免疫細胞化學染色法鑒定見圖1(箭頭所標處為肺動脈)。對照組肺組織(圖1A)肺泡結構完整，無炎細胞浸潤；模型組肺組織(圖1B)肺泡壁斷裂、肺泡融合肺大泡形成，肺動脈平滑肌層明顯增厚，大量炎細胞浸潤，符合COPD大鼠肺組織病理改變。Α-SM-actin 免疫組織化學染色，光鏡下見胞質內大部分肌動蛋白染成棕黃色，呈現與細胞長軸平行的絲狀物，證實為 PASMCs(圖1C)。

A：對照組；B：模型組；C：肌動蛋白免疫細胞化學染色。 圖1 大鼠COPD建模的HE染色判斷及PASMCs免疫細胞化學染色法鑒定(×200)

2.2各組PASMCs中TLR4蛋白含量的比較見圖2及表1。LPS組細胞TLR4表達較對照組明顯升高(P<0.05)；TAK-242組細胞TLR4的表達較對照組降低(P<0.05)；TAK-242組細胞較LPS組中TLR4的表達明顯降低(P<0.01)。

A：對照組；B：LPS組；C：TAK-242組；D：LPS+TAK-242組。 圖2 各組PASMCs中TLR4的表達

組別TLR4對照組0.917±0.019LPS組2.912±0.079TAK-242組0.623±0.006LPS+TAK-242組1.899±0.003

FLPS=43 461.403，FTAK-242=19 213.336，F交互=16 174.815;P均<0.001。

2.3各組細胞培養上清液中MCP-1、TGF-β1水平的比較見表2。

表2 各組細胞培養上清液中MCP-1、TGF-β1水平變化比較(n=6)

2.4MCP-1、TGF-β1表達水平與TLR4含量相關性分析COPD大鼠PASMCs上清液中MCP-1、TGF-β1表達水平與TLR4含量無關(rP=0.471和0.352，P>0.05)。

3 討論

COPD是一種以氣流受限為特征的肺部疾病，主要表現為加速下降的肺功能，嚴重影響患者生活質量，并帶來沉重經濟負擔的疾病[8-9]。血管炎癥反應和肺血管重塑是其主要病理特征。

TLRs是一類天然的免疫受體，促進細胞因子的合成與釋放,引發炎癥反應。TLR4是第一個被發現的哺乳動物TLR，屬于Ⅰ型跨膜蛋白受體，可被病原微生物、肽聚糖(PGN)、LPS等激活，產生趨化因子、黏附分子、急性期蛋白及細胞因子來調節炎癥反應。氣道注入LPS和被動吸煙可能通過NF-κB信號通路引起肺損傷繼而引發COPD，而TLR4在這一過程中起到重要作用[10]。該實驗采用氣道內注入LPS及香煙煙霧暴露方法建立COPD大鼠模型。COPD患者氣道炎性細胞的浸潤主要為淋巴細胞和巨噬細胞[11]。MCP-1是一種重要的趨化因子，與巨噬細胞的激活和趨化明顯相關[12]。TGF-β1能夠刺激成纖維細胞合成細胞外基質并抑制其降解，致使氣道管壁增厚進而引發氣道重塑，導致肺功能的進行性損害[13]。MCP-1和TGF-β1在COPD的發生、發展中起重要作用，與正常人比較，COPD患者急性加重期和緩解期MCP-1、TGF-β1的水平明顯升高[6]。有研究[14]證實，在血管平滑肌細胞中TLR4/NF-κB信號通路可介導MCP-1的表達。該實驗通過分離培養原代PASMCs，LPS誘導體外培養的細胞，發現TLR4的表達明顯升高，細胞上清液中合成分泌MCP-1、TGF-β1的水平也明顯升高用。為進一步探究PASMCs合成分泌MCP-1、TGF-β1的水平與TLR4之間的關系，以TLR4特異性抑制劑TAK-242干預細胞，發現可明顯下調TLR4的表達，但細胞培養上清液中MCP-1、TGF-β1的水平并不隨之降低。有研究[15]報道，COPD患者急性加重期組織因子(tissue factor，TF)和MCP-1、TGF-β1的水平明顯高于正常人，且TF與MCP-1、TGF-β1之間有明顯正相關性。由此推測大鼠原代PASMCs合成分泌MCP-1、TGF-β1的水平除了受TLR4的影響外可能還有其他信號途徑的參與，但其具體機制目前仍不十分清楚，作者將在接下來的研究中做進一步的探討。

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(2016-11-27收稿 責任編輯趙秋民)

Detection of MCP-1,TGF-β1 and TLR4 protein in primary pulmonary artery smooth muscle cells of COPD rats

JIANGMing,WANGChangming,HANXuhui,YANGDan,MALibing,CHENFeng,LYUQian

DepartmentofRespiratoryMedicine,GuilinMedicalUniversityAffiliatedHospital,Guilin,Guangxi541001

chronic obstructive pulmonary disease;Toll like receptor-4;monocyte chemoattractant protein 1;transforming growth factor β1;rat

Aim: To probe into the secretion of monocyte chemoattractant protein 1(MCP-1),transforming growth factor β1(TGF-β1) in primary pulmonary artery smooth muscle cells(PASMCs) of chronic obstructive pulmonary disease(COPD) rats and the correlation with toll-like receptor 4(TLR4) signaling pathways. Methods: The COPD rat model was established, and the PASMCs were separated, induced by LPS, and then divided into control group,LPS group,TAK-242 group,and LPS+TAK-242 group. The expression of TLR4 in PASMCs of each group was detected by Western blot, and the concentrations of MCP-1 and TGF-β1 in cell culture fluid were determined by ELISA, and at last a correlation analysis was conducted.Results: In contrast with the control group, the expression of TLR4 in PASMCs of the LPS group was inecreased(P<0.05) and the concentrations of MCP-1 and TGF-β1 in cell culture fluid were increased(P<0.05). The expression of TLR4 in PASMCs of the TAK-242 group was down-regulated(P<0.05) and the concentrations of MCP-1 and TGF-β1 in cell culture fluid showed no correlation with the expression of TLR4.Conclusion: LPS can induce PASMCs of rats to synthesize and secrete MCP-1 and TGF-β1, and the TLR4 is up-expressed at the same time.

10.13705/j.issn.1671-6825.2017.05.031

R563.3

*國家自然科學基金資助項目 81360010；廣西省衛生廳自然科學基金資助項目 S201603

#通信作者，男，1963年11月生，博士，教授，主任醫師，研究方向：慢性阻塞性肺疾病，E-mail：wcm@glmc.edu.cn