殼聚糖降解衍生物的抗氧化活性及對藥物性肝損傷纖維化的預防作用Δ

張迪，邢宇，王楊，孔敏，李新莉

（大連醫科大學生物技術系，遼寧大連116044）

殼聚糖降解衍生物的抗氧化活性及對藥物性肝損傷纖維化的預防作用Δ

張迪＊，邢宇，王楊，孔敏，李新莉#

（大連醫科大學生物技術系，遼寧大連116044）

目的：研究殼聚糖（CTS）降解衍生物的體外抗氧化活性及對藥物性肝損傷纖維化的預防作用。方法：采用酸水解法制備不同水解時間（3、6、8、10 h）的CTS降解衍生物CTS-3、CTS-6、CTS-8、CTS-10，測定CTS及其降解衍生物的黏均分子量和脫乙酰度，通過檢測其對1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）和超氧負離子（O2－）自由基的體外清除能力評價其抗氧化活性。以CTS-10進行體內肝損傷纖維化的預防實驗，將小鼠隨機分為正常對照組（水）、模型組（水）和CTS-10高、中、低劑量組（100、50、25 mg/mL），每組8只，每天ig給藥0.2 mL，連續24 d后停藥；繼而連續ig鹽酸左氧氟沙星7 d建立藥物性肝損傷模型（正常對照組除外）。采用Western blot法檢測小鼠肝組織中腫瘤壞死因子α（TNF-α）、轉化生長因子β1（TGF-β1）和飾膠蛋白聚糖（Decorin）蛋白的表達。結果：CTS、CTS-3、CTS-6、CTS-8、CTS-10的黏均分子量分別為21.70×104、6.70×104、6.30×104、5.01×104、4.87×104，脫乙酰度分別為83.44%、74.62%、67.28%、64.83%、54.23%；對DPPH和O2－自由基均有一定的清除能力，其中CTS-10清除能力最強，分別為25.47%和56.31%。與正常對照組比較，模型組小鼠肝組織中TNF-α、TGF-β1和Decorin蛋白表達均增強（P＜0.05）；與模型組比較，CTS-10中、高劑量組小鼠肝組織中TNF-α、TGF-β1和Decorin蛋白表達均減弱（P＜0.01）。結論：CTS降解衍生物中CST-10的黏均分子量和脫乙酰度較低，具有較強的體外抗氧化活性，對小鼠藥物性肝損傷纖維化有一定的預防作用。

殼聚糖；降解衍生物；抗氧化活性；藥物性肝損傷；肝纖維化；小鼠

ABSTRACTOBJECTIVE：To study the in vitro antioxidant activity of chitosan（CTS）degradation derivatives and its preventive effects on drug-induced liver injury fibosis.METHODS：Acid hydrolysis method was used to prepare the CTS degradation derivatives CTS-3，CTS-6，CTS-8，CTS-10 for different hydrolysis time（3，6，8，10 h）.The viscosity-average relative molecular mass and deacetylation degree of CTS and its degradation derivatives were determined，and its antioxidant activity was evaluated by detecting its in vitro scavenging ability on 1，1-diphenyl-2-trinitrophenylhydrazine（DPPH）and superoxide anion（O2－）radicals.Using CTS-10 for in vivo liver injury fibosis prevention test，mice were randomly divided into normal control group（water），model group（water），CTS-10 high-dose，medium-dose，low-dose groups（100，50，25 mg/mL），8 in each group.Mice were intragastrically administrated 0.2 mL，then withdrawal after continuous 24 d.Then levofloxacin hydrochloride was intragastrically given for 7 d to establish drug-induced liver injury model（except for normal control group）.Western blot method was used to detect the expressions of tumor necrosis factor α（TNF-α），transforming growth factor β1（TGF-β1）and Decorin protein in liver tissue of mice.RESULTS：The viscosity-average relative molecular mass of CTS，CTS-3，CTS-6，CTS-8，CTS-10 were 21.70×104，6.70×104，6.30×104，5.01×104，4.87×104；and deacetylation degree were 83.44%，74.62%，67.28%，64.83%，54.23%，respectively.All of them had certain scavenging ability on DPPH and O2－，in which，CTS-10 was the strongest（25.47%and 56.31%）.Compared with normal control group，expressions of TNF-α，TGF-β1and Decorin protein in liver tissue in model group were enhanced（P＜0.05）.Compared with model group，expressions of TNF-α，TGF-β1and Decorin protein in liver tissue in CTS-10 medium-dose and high-dose groups were weakened（P＜0.01）.CONCLUSIONS：The viscosity-average relative molecular mass and deacetylation degree of CTS-10 in CTS degradation derivatives are lower with stronger antioxidant activity，and show certain preventive effects on drug-induced liver injury fibosis in mice.

KEYWORDSChitosan；Degradation derivatives；Antioxidant activity；Drug-induced liver injury；Liver fibosis；Mice

藥物性肝損傷（Drug-induced liver injury，DILI）是由藥物本身或其代謝產物所導致的肝臟損傷，是一種在中國乃至世界范圍內常見的疾病，藥物停用后自行緩解。DILI臨床類型分為肝細胞型、膽汁淤積型、混合型3種，主要以肝細胞型肝損傷為主[1]。肝承擔著藥物清除、生物轉化等功能，幾乎所有藥物都會對肝造成負擔，引起肝損傷。中草藥、中成藥所致DILI比例占40%，然后依次是抗生素、抗腫瘤藥和抗結核藥以及抗心血管病藥物[2]。由于抗生素濫用情況嚴重，由其所致的DILI具有發生率高、病死率高、可預測性低等特點。其中，喹諾酮類抗生素如左氧氟沙星、環丙沙星等，都可能導致暫時性DILI[3]，當其與一些藥物聯用時還可使毒性增加。

殼聚糖（Chitosan，CTS）化學名稱為聚合β-（1，4）-N-乙酰-D-葡萄糖胺，水解可生成水溶性殼聚糖（Water soluble chitosan，WCS）和低分子殼寡糖（Chitooligosaccharide，COS）。已有研究表明，CTS及其衍生物有抗腫瘤和增強機體免疫功能作用[4-5]，對1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基和羥自由基有一定的清除能力[6]，可以抑制真菌、酵母菌、細菌等的生長[7]，還具有降脂[8]、調節腸道菌群失調[9]等活性。本文研究了不同黏均分子量和脫乙酰度（DD）的CTS降解衍生物的體外抗氧化活性和對DILI纖維化的預防作用，初步探討了CTS降解衍生物的保肝護肝作用。

1 材料

1.1 儀器

奧氏黏度計（昆山廣測儀器設備有限公司）；UVS-1渦旋振蕩器（北京優晟聯合科技有限公司）；HC-3018R高速冷凍離心機（安徽中科中佳科學有限公司）；MV-Ⅱ垂直板電泳裝置、ST-Ⅰ半干式轉移電泳儀（大連競邁生物科技有限公司）；真空冷凍干燥機（北京博醫康實驗儀器有限公司）；全自動凝膠成像系統（美國Bio-Rad公司）。

1.2 藥品與試劑

CTS原料藥（濟南海得貝海洋生物工程有限公司，批號：050112，DD：≥80%）；鹽酸左氧氟沙星膠囊（海口奇力制藥股份有限公司，批號：H20055533，規格：每粒0.2 g）；兔源β肌動蛋白（β-actin）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、轉化生長因子β1（TGF-β1）、飾膠蛋白聚糖（Decorin）抗體和辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）多克隆抗體（武漢三鷹生物技術有限公司）；Pierce化學增強發光（ECL）試劑盒（美國Thermo公司）；甲基橙、RIPA裂解液（北京索萊寶科技有限公司）；DPPH（美國Sigma公司，批號：D9132-1G，純度：99%）；維生素C（天津市凱信化學工業有限公司，批號：XK13-2010344，分析純）；其他試劑均為市售分析純。

1.3 動物

SPF級KM小鼠，♀♂各半，體質量18～22 g，由大連醫科大學實驗動物中心提供，動物合格證號為：SCXK（遼）2008-0002。本實驗經大連醫科大學倫理委員會批準通過。

2 方法

2.1 CTS降解衍生物的制備

稱取2 g CTS 4份，分別裝于250 mL錐形瓶中，加入200 mL的1%醋酸溶液，充分溶解后，加入10 mL濃HCl，并用牛皮紙封口后放入80℃的恒溫水浴鍋中水解，4份溶液分別水解3、6、8、10 h。然后滴加1 mol/L的NaOH溶液中和，使CTS沉淀，4 000 r/min（離心半徑6 cm，下同）離心10 min，用蒸餾水清洗沉淀物2次，調pH至7左右；繼續4 000 r/min離心10 min，取沉淀物，冷凍干燥，得到CTS降解衍生物CTS-3、CTS-6、CTS-8、CTS-10。

2.2 黏均分子量的測定

將CTS、CTS-3、CTS-6、CTS-8、CTS-10各0.2 g分別溶于0.1 mol/L醋酸鈉-0.2 mol/L醋酸緩沖溶液中，于50 mL量瓶中定容制成樣品溶液。將奧氏黏度計固定在25℃的恒溫水浴中，吸取10 mL樣品溶液于奧氏黏度計中，平衡10 min，用秒表測定溶液的流出時間t，連續測3次，每次結果相差不得超過0.1 s。同時，測定空白溶劑（0.1 mol/L醋酸鈉-0.2 mol/L醋酸緩沖溶液）的流出時間t0。按一點法[10]計算各樣品的黏均分子量。

2.3 DD的測定

分別稱取約0.25 g 的CTS、CTS-3、CTS-6、CTS-8、CTS-10，加入20 mL 0.1 mol/L HCl溶液，室溫攪拌1 h至全部溶解，加入10 mL蒸餾水稀釋，再加入3滴1%甲基橙指示劑，用0.1 mol/L NaOH溶液滴定至溶液由黃色變為紅色，重復3次，按文獻[11]計算各樣品的DD。

2.4 體外抗氧化活性研究

2.4.1 DPPH自由基清除率的測定 稱取DPPH 1 mg溶于20 mL二甲基亞砜（DMSO）中，避光保存備用。CTS、CTS-3、CTS-6、CTS-8、CTS-10分別用DMSO配制成質量濃度為13.3、20.0、26.6、53.3、67.7 μg/mL的溶液，分別與DPPH溶液在室溫下避光反應30 min，于519 nm波長處測定吸光度。以1 mg/mL維生素C為陽性對照，重復測定 3次，計算 CTS、CTS-3、CTS-6、CTS-8、CTS-10對DPPH自由基的清除率。

2.4.2 超氧負離子（O2－）自由基清除率的測定 將0.1 mol/L HCl-Tris緩沖液（pH 8.2）和鄰苯三酚溶液（用10 mmol/L HCl配制成50 mmol/L）在25℃水浴中保溫備用。取4.5 mL HCl-Tris緩沖液加入4.4 mL蒸餾水、0.1 mL鄰苯三酚溶液，搖勻后于325 nm波長處測定吸光度，記為 A0。CTS、CTS-3、CTS-6、CTS-8、CTS-10 分別用Hcl-Tris緩沖液配制成質量濃度為14.43、16.89、18.87、18.95、22.57 μg/mL的溶液，分別加入0.1 mL鄰苯三酚溶液，搖勻，按上述方法測定吸光度，記為A1。以10 mmol/L HCl為空白對照、1 mg/mL維生素C為陽性對照，重復測定3次，計算CTS、CTS-3、CTS-6、CTS-8、CTS-10對O2－自由基的清除率。

2.5 對DILI纖維化的預防作用考察

2.5.1 分組與給藥 通過上述試驗，篩選黏均分子量和DD較低且具有一定抗氧化活性的CTS-10進行體內DILI的預防作用研究。將CTS-10和鹽酸左氧氟沙星分別溶于無菌水中制成水溶性CTS-10高、中、低濃度溶液（100、50、25 mg/mL）[12]和鹽酸左氧氟沙星溶液（60mg/mL）[13]。取小鼠隨機分為正常對照組、模型組和CTS-10高、中、低劑量組，每組8只。正常對照組和模型組小鼠每天ig水0.2 mL，各給藥組小鼠ig相應藥物0.2 mL，24 d后停藥；除正常對照組外其余各組小鼠繼而ig鹽酸左氧氟沙星溶液7 d，每天0.2 mL以建立DILI模型。第8天處死小鼠，迅速剝離肝臟，于－80℃保存備用。

2.5.2 肝組織蛋白質提取 取各組小鼠肝組織50～100 mg，剪碎，用預冷的生理鹽水洗滌2次，加入0.5 mL預冷的蛋白裂解液[RIPA-甲苯基磺酰氟（100∶1，V/V）]，勻漿至95%的細胞破碎，在冰浴中放置30 min，4℃下12 000 r/min離心15 min，將上清液轉移到新的離心管，分裝，－80℃保存。電泳前，使用考馬斯亮藍法檢測其中蛋白質濃度[14]。

2.5.3 Western blot法檢測肝組織中 TNF-α、TGF-β1、Decorin蛋白表達 取“2.5.2”項下肝組織蛋白，進行常規十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）。蛋白上樣量為80μg，分離膠濃度10%，濃縮膠濃度5%，待預染蛋白分子量標準品（Marker）充分被分開，停止電泳。用半干式電轉儀進行轉膜，脫脂奶粉封閉NC膜1 h，分別與兔源β-actin（1∶500稀釋）、TNF-α（1∶500稀釋）、TGF-β1（1∶500稀釋）、Decorin（1∶500稀釋）抗體結合，4℃過夜，TBST緩沖液洗膜，加入HRP標記的山羊抗兔IgG多克隆抗體（1∶5 000稀釋）孵育2 h，ECL發光，凝膠成像。以β-actin為內參，采用Quantity One 4.6.2軟件進行蛋白灰度值分析，以目標蛋白與內參的灰度值比值表示目標蛋白表達水平。

2.5.4 統計學方法 采用SPSS 10.0軟件進行統計分析，正態計量指標采用x±s表示，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05表示差異有統計學意義。

3 結果

3.1 黏均分子量和DD

CTS、CTS-3、CTS-6、CTS-8、CTS-10的黏均分子量分別為 21.70×104、6.70×104、6.30×104、5.01×104、4.87×104，DD 分別為 83.44%、74.62%、67.28%、64.83%、54.23%。結果表明，隨著水解時間的延長，CTS降解衍生物的黏均分子量減小，DD也相應減小。由于DD高的CTS分子內氨基和羥基含量較多，易形成較強的氫鍵，不溶于水；且由于氫鍵的存在，CTS分子具有一定規整性，易形成結晶區，也使其難溶于水[15]。因此，當DD為50%時CTS具有水溶性，DD＞60%時CTS則不溶于水。綜上，CST-10的DD為54.23%，黏均分子量為4.87×104，具有較好的水溶性；其他CTS降解衍生物的水溶性均相對較差。

3.2 抗氧化活性

維生素C對DPPH自由基和O2－自由基的清除能力很強，清除率分別為93.89%和100%。在試驗范圍內，CTS、CTS-3、CTS-6、CTS-8、CTS-10對DPPH自由基和O2－自由基均有一定的清除能力，但相對于維生素C，其清除能力低很多，其中67.7 μg/mL的CTS-10對DPPH自由基的清除率為25.47%，22.57 μg/mL的CTS-10對O2－自由基的清除率為56.31%，表明CTS-10具有一定的抗氧化活性。6種樣品對DPPH和O2－自由基的清除率-質量濃度曲線見圖1。

圖1 6種樣品對DPPH和O2－自由基的清除率-質量濃度曲線Fig 1 Scavenging rate-mass concentration curves ofsix samples on DPPH and O2－radicals

3.3 肝組織中TNF-α、TGF-β1、Decorin蛋白表達

與正常對照組比較，模型組小鼠肝組織中TNF-α、TGF-β1、Decorin蛋白表達均明顯增強（P＜0.05）；與模型組比較，CTS-10中、高劑量組小鼠肝組織中TNF-α、TGF-β1、Decorin蛋白表達均明顯減弱（P＜0.01）。各組小鼠肝組織中TNF-α、TGF-β1、Decorin蛋白表達的電泳圖見圖2，測定結果見圖3。

圖2 各組小鼠肝組織中TNF-α、TGF-β1、Decorin蛋白表達的電泳圖Fig 2 Electrophoresis chart of expressions of TNF-α，TGF-β1，Decorin protein in liver tissue of mice in each group

圖3 各組小鼠肝組織中TNF-α、TGF-β1、Decorin蛋白表達的測定結果Fig 3 Determination results of expressions of TNF-α，TGF-β1，Decorin protein in liver tissue of mice in each group

4 討論

藥物具有二重性，一方面其能夠防病治病，另一方面其也可危害機體，引起生理、生化功能的紊亂和組織結構發生病理改變。抗生素是臨床治療感染性疾病的主要藥物，但長期大量使用抗生素會導致胃腸道反應、過敏反應、多器官損傷等[16]。鹽酸左氧氟沙星主要用于治療革蘭氏陰性菌引起的炎癥感染，臨床應用較廣。自2001年Karim A等[17]報道首例由左氧氟沙星致肺損傷的病例之后，陸續有類似病例出現。

在肝損傷的發生發展過程中，肝細胞線粒體和肝細胞膜被損傷，產生大量炎癥介質并激活TNF-α和TGF-β1，促進肝星狀細胞分泌眾多細胞外基質（Extracellular matrix，ECM），導致了肝纖維化的發生和發展。Decorin作為ECM的一個主要組分，在正常肝臟中是微量的，其含量隨纖維化進展而穩定增加，具有突出的抑制膠原纖維合成以及調控TGF-β1活性的功能，在TGF-β1功能調節中起重要作用。

CTS為甲殼素完全或部分脫乙酰化產物，是一種有生物相容性、生物降解性、生物活性且無毒的高聚物，具有廣泛的開發前景[18]。但是較大黏均分子量的CTS導致其溶解度較低，限制了其在醫學和食品工業中的應用。因此，低黏均分子量CTS的制備引起了人們的關注。

本研究結果表明，隨著水解時間的加長，CTS水解產物的黏均分子量減小，DD也相應減小。其中CTS-10的黏均分子量和DD較低，具有較強的抗氧化活性，對小鼠DILI纖維化有一定的預防作用。

綜上推測，CTS降解衍生物對DILI纖維化的預防作用機制可能與增強機體抗氧化能力，抑制TNF-α、TGF-β1和Decorin蛋白的表達有關。由于腸道與肝之間有著重要聯系[19]，腸血液回流到門靜脈，腸道菌群的組成會影響肝功能；反之，肝通過膽汁分泌也可影響腸道菌群功能，因此后續將開展腸道菌群與肝損傷的相關研究。

[1] Figueira-Coelho J，Pereira O，Picado B.et al.Acute hepatitis associated with the use of levofloxacin[J].Clin Ther，2010，32（10）：1733-1737.

[2] 徐麗紅，張蕾，陳衛剛，等.急性藥物性肝損傷臨床特點及預后分析[J].實用醫學雜志，2013，29（22）：3668-3671.

[3] 林圣生，雷招寶.25例左氧氟沙星致肝損傷患者的相關因素分析[J].抗感染藥學，2014，11（4）：350-352.

[4] 周艷芬，韓紹芳，倪志華，等.殼寡糖對HeLa細胞和A549細胞自噬性死亡的影響[J].科學技術與工程，2015，15（7）：24-29.

[5] 張沛，韓寶芹，陳列歡，等.用酶解法制備殼寡糖及其對機體免疫功能的調節作用[J].中國免疫學雜志，2013，29（2）：191-196.

[6] 姚倩，孫濤，徐軼霞，等.殼聚糖/殼寡糖衍生物的制備及其抗氧化性能研究[J].食品與生物技術學報，2009，28（2）：188-191.

[7] Hosseinnejad M，Jafari SM.Evaluation of different factors affecting antimicrobial properties of chitosan[J].Int J Biol Macromol，2016，doi：10.1016/j.ijbiomac.2016.01.022.

[8] Zhang HL，Tao Y，Guo J，et al.Hypolipidemic effects of chitosan nanoparticles in hyperlipidemia rats induced by high fat diet[J].Int Immunopharmacol，2011，11（4）：457-461.

[9] Muanprasat C，Wongkrasant P，Satitsri S，et al.Activation of AMPK by chitosan oligosaccharide in intestinal epithelial cells：mechanism of action and potential applications in intestinal disorders[J].Biochem Pharmacol，2015，96（3）：225-236.

[10] Halal CY，Moura JM，Pinto LAA.Evaluation of molecula weight of chitosan in thin-layer and spouted bed drying[J].J Food Process Eng，2011，34（1）：160-174.

[11] Thevarajah JJ，van Leeuwen MP，Cottet H，et al.Determination of the distributions of degrees of acetylation of chitosan[J].Int J Biol Macromol，2017，doi：10.1016/j.ijbiomac.2016.10.056.

[12] Xu Y，Shi B，Yan S，et al.Effects of chitosan on body weight gain，growth hormone and intestinal morphology in weaned pigs[J].Asian-Australas J Anim Sci，2013，26（10）：1484-1489.

[13] Li X，Yang G，Zhang C，et al.Improvement of intestinal microflora balance by polysaccharide from Physalis alkekengi var.francheti[J].Mol Med Rep，2014，9（2）：677-682.

[14] 周琪，曹雪姣，劉麗坤，等.冬瓜粗提物對小鼠紫外線曬傷皮膚的修復作用[J].天然產物研究與開發，2016，28（9）：1475-1478.

[15] Hosseinnejada M，Jafari SM.Evaluation of different factors affecting antimicrobial properties of chitosan[J].Int J Biol Macromol，2016，doi：10.1016/j.ijbiomac.2016.01.022.

[16] 李新莉，吳大暢，張翠麗，等.鹽酸林可霉素和頭孢拉定對BALB/c小鼠腸道菌群影響的比較[J].中國藥房，2012，23（33）：3089-3091.

[17] Karim A，Ahmed S，Rossoff LJ，et al.Possible levofloxacin induced acute hepatocellular injury in a patient with chronic obstructive lung disease[J].Clin Infect Dis，2001，33（12）：2088-2090.

[18] Xia Z，Wu S，Chen J.Preparation of water soluble chitosan by hydrolysis using hydrogen peroxide[J].Int J Biol Macromol，2013，doi：10.1016/j.ijbiomac.2013.04.034.

[19] Dhiman RK.Gut microbiota and hepatic encephalopathy[J].Metab Brain Dis，2013，28（2）：321-326.

Antioxidant Activity and Preventive Effects of Chitosan Degradation Derivatives on Drug-induced Liver Injury Fibosis

ZHANG Di，XING Yu，WANG Yang，KONG Min，LI Xinli
（Dept.of Biotechnology，Dalian Medical University，Liaoning Dalian 116044，China）

R285.5

A

1001-0408（2017）25-3498-04

2016-11-09

2017-01-19）

（編輯：鄒麗娟）

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.25.12

遼寧省教育廳科學研究一般項目（No.L2016004）

＊本科生。研究方向：生物制藥。電話：0411-86110296。E-mail：2711395747@qq.com

#通信作者：講師。研究方向：藥物與腸道微生態。電話：0411-86110296。E-mail：lixinlibio@163.com