丁苯酞對大鼠心肌缺血再灌注損傷的預防作用及機制研究

周 菲，張敬文，王 衛

（海南省人民醫院心血管內科，海口 570311）

丁苯酞對大鼠心肌缺血再灌注損傷的預防作用及機制研究

周 菲＊，張敬文，王 衛

（海南省人民醫院心血管內科，海口 570311）

目的：研究丁苯酞對大鼠心肌缺血再灌注損傷的預防作用及機制。方法：將SD大鼠隨機分為假手術組、模型組和丁苯酞低、中、高劑量組（50、75、100 mg/kg），每組10只，各組大鼠每天ig相應藥物1次，假手術組及模型組大鼠ig等量生理鹽水，連續3 d。末次給藥后除假手術組外其余各組大鼠再灌注120 min后檢測各組大鼠心肌梗死面積比例、細胞凋亡率、凋亡相關蛋白[促凋亡蛋白（Caspase-3、Fas、Caspase-9）、抑制凋亡蛋白（Bcl-2）]表達、左室射血分數（LVEF）和血清中血管內皮生長因子（VEGF）含量。結果：與假手術組比較，模型組大鼠的心肌梗死面積、心肌細胞凋亡率均明顯升高，心肌細胞中Caspase-3、Fas、Caspase-9蛋白表達明顯增強，Bcl-2蛋白表達明顯減弱，LVEF和血清VEGF含量明顯降低（P＜0.01）。與模型組比較，除丁苯酞低劑量組大鼠的LVEF無明顯變化（P＞0.05）外，其余各給藥組大鼠的上述指標均明顯改善（P＜0.05）。與丁苯酞低劑量組比較，丁苯酞高劑量組大鼠的心肌梗死面積、細胞凋亡率均明顯降低（P＜0.05）；丁苯酞中、高劑量組大鼠心肌細胞中Caspase-3、Fas、Caspase-9蛋白表達明顯減弱，Bcl-2蛋白表達明顯增強（P＜0.05）。結論：丁苯酞可有效減輕大鼠心肌缺血再灌注損傷，保護心功能，其機制可能與上調VEGF有關。

丁苯酞；心肌缺血再灌注損傷；細胞凋亡；大鼠

ABSTRACTOBJECTIVE：To study the preventive effect and mechanism of butylphthalide on myocardial ischemia-reperfusion injury in rats.METHODS：SD rats were randomly divided into sham operation group，model group，butylphthalide low-dose，medium-dose，high-dose groups（50，75，100 mg/lg），10 in each group.All rats were intragastrically administrated related drugs once a day，sham operation group and model group were intragastrically administrated equal amount of normal saline，for 3 d.After last administration，except for sham operation group，120 min of repertusion was conducted.Ratio of myocardial infarction area，apoptosis rate of myocardial cells，expressions of apoptosis-related protein[proapoptotic proteins（Caspase-3，Fas，Caspase-9），apoptotic protein（Bcl-2）]，left ventricular ejection fraction（LVEF），and content of vascular endothelial growth factor（VEGF）in serum of rats in other groups were detected.RESULTS：Compared with sham operation group，myocardial infarction area and apoptosis rate of myocardial cells in model group were obviously increased；expressions of Caspase-3，Fas，Caspase-9 protein in myocardial cells were obviously enhanced，Bcl-2 protein expression was obviously weakened；LVEF and serum VEGF content were obviously reduced（P＜0.01）.Compared with model group，except that LVEF in butylphthalide low-dose group didn’t changed obviously（P＞0.05），above indexes in other administration groups improved obviously（P＜0.05）.Compared with butylphthalide low-dose group，myocardial infarction area and apoptosis rate of myocardial cells in butylphthalide high-dose group were obviously decreased（P＜0.05）；expressions of Caspase-3，Fas，Caspase-9 protein in myocardial cells in butylphthalide medium-dose，high-dose groups were obviously weakened，and Bcl-2 protein expression was obviously enhanced（P＜0.05）.CONCLUSIONS：Butylphthalide can effectively reduce myocardial ischemia-reperfusion injury in rats，protect cardiac functions，and its mechanism may be related with up-regulating VEGF.

KEYWORDSButylphthalide；Myocardial ischemia-reperfusion injury；Cell apoptosis；Rats

心血管疾病是中老年人群的常見病，每年因患該疾病致死人群數量在逐漸上升，其中包括心肌梗死在內的缺血性心臟病是主要的死因[1]。一系列的研究結果表明，造成心肌組織損傷的主要原因，除了缺血所致損傷之外，在恢復血液再灌注后會對缺血心肌造成更嚴重的傷害，該現象稱為缺血再灌注損傷（Ischemia-reperfusion，I/R），通過抑制心肌細胞凋亡保護I/R帶來的心肌損傷已成為當前研究的熱點[2]。丁苯酞臨床上用于治療腦I/R，其作用廣泛，且口服同樣有效，近年來發現丁苯酞也有保護心肌細胞的效果[3]。本研究用丁苯酞預處理大鼠，考察丁苯酞對大鼠心肌I/R的預防作用及機制。

1 材料

1.1 儀器

Cobas8000全自動生化分析儀（美國羅氏制藥有限公司）；MK3酶標儀（美國Thermo公司）；H-7650透射電子顯微鏡（日本Hitachi公司）；Z323K低溫高速離心機（德國Hermle公司）；RM-6240B/C多道生理信號采集處理系統（成都儀器廠）。

1.2 藥品與試劑

丁苯酞對照品（上海源葉生物科技有限公司，批號：20160329，純度：≥98%）；原位末端轉移酶標記（TUNEL）試劑盒（美國Roche公司）；兔抗人細胞凋亡抑制因子（Fas）、B細胞淋巴瘤2（Bcl-2）、半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶9（Caspase-9）、Caspase-3 Western blot試劑盒和辣根過氧化物酶（HRP）標記的二抗（上海拜力生物科技有限公司）；牛血清蛋白（德國Merck Millipore公司）；血管內皮生長因子（VEGF）試劑盒（上海信帆生物科技有限公司）。

1.3 動物

SPF級SD大鼠，8周齡，♂，體質量290～320 g，由鄭州大學實驗動物中心提供，動物合格證號為：SCXK（豫）2016-0005。本實驗過程中對大鼠的處理已通過本院動物倫理委員會同意。

2 方法

2.1 心肌I/R模型的建立

按照文獻[4]方法建立心肌I/R模型。大鼠術前禁食不禁水12 h后，以3%戊巴比妥鈉（70 mg/kg）ip麻醉3～5 min后仰臥位固定于手術臺，氣管插管，連接呼吸機。胸骨正中切口，鈍性分離皮下組織及肌肉，于胸骨左緣3～4助間開胸，打開心包膜，分離脂肪，于左心耳下緣1 mm處以7號針線在冠狀動脈左前降支（LAD）下方穿縫合線，將充水（0.5 mL）的球囊置于血管與結扎線間。結扎造成心肌缺血，心電圖監測顯示ST段抬高0.2 mV為心肌缺血建模成功。持續30 min后打開結扎線，抽出球囊，關胸再灌注120 min。

2.2 分組與給藥

參照文獻[3]選擇丁苯酞的給藥劑量。將大鼠適應性喂養1周后，隨機分為假手術組、模型組和丁苯酞低、中、高劑量組（50、75、100 mg/kg），每組10只。將丁苯酞對照品溶于0.5%聚山梨酯80溶液中，質量濃度為8 mg/mL，各組大鼠ig相應劑量的藥物，假手術組和模型組大鼠ig等量生理鹽水，每天1次，連續3 d。然后除假手術組外，其余各組大鼠按“2.1”項下方法建立心肌I/R模型。

2.3 心肌梗死面積的測定

按照文獻[5]方法測定。各組大鼠再灌注后用3.6%水合氯醛以0.15 mL/10 g麻醉后用肝素抗凝，取出心臟后用心臟灌流液經冠狀動脈灌流沖洗，結扎LAD，用1%Evans Blue生物染色劑灌注。灌注結束后分離心房和心室組織，將心室放入特制容器內，加冷卻至4℃的瓊脂糖固定心臟。垂直心室長軸橫行切片，每片1～2 mm，將切片放入培養皿中，加入含2%2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）的磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.4），37℃閉關孵育30 min，置于10%甲醛溶液中過夜，封片。切片中藍色為非缺血區心肌，紅色和灰紅相間為缺血區心肌（AAR），灰白色為梗死心肌（IS）。用掃描儀成像，Image Pro Plus 6.0圖片分析軟件計算各部分面積和梗死面積比例，梗死面積比例＝梗死面積/缺血面積×100%。

2.4 TUNEL法測定心肌細胞凋亡率

將各組大鼠心臟放入PBS中，剪下缺血區心肌，洗凈，用4%多聚甲醛于4℃固定24 h。將固定好的心肌組織用乙醇和二甲苯脫水及透明后，石蠟包埋，切片，按TUNEL試劑盒說明書操作進行染色。在光學顯微鏡下觀察凋亡細胞的細胞核呈棕黃色。根據凋亡細胞分布，每張切片拍攝5張圖片，每個標本切片隨機選取5個400倍視野，計算平均每100個細胞中的凋亡細胞數，計算細胞凋亡率，細胞凋亡率＝凋亡細胞數/總細胞數×100%。

2.5 Western blot法測定凋亡相關蛋白表達

取各組大鼠缺血區心肌組織10 mg，按每10 mg組織加入200 μL的RIPA裂解液及PMSF蛋白抑制劑，研磨后將心肌細胞勻漿轉移至預冷的1.5 mL的EP管中，置于冰上15 min充分裂解，離心后棄上清液，－20℃保存。用10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），轉膜，封閉，加入稀釋1 000倍的一抗液，封口，4℃孵育過夜，用PBS洗膜3次；再加入稀釋5 000倍的HRP標記的二抗，封口，PBS洗膜3次；將膜浸泡于增強化學發光試劑中5 min，除去多余液體后壓片，在暗盒中于X-光底片上曝光5 min后顯影，檢測灰度值。以目標蛋白與內參β肌動蛋白（β-actin）灰度值的比值表示Caspase-3（促凋亡蛋白）、Fas（外在途徑促凋亡蛋白）、Caspase-9（促凋亡蛋白）和Bcl-2（內在途徑抑制凋亡蛋白）的相對表達水平。

2.6 心臟功能評估

將10%水合氯醛麻醉后的大鼠置于自制木板上，用超聲診斷儀進行大鼠心臟超聲檢查，并讀取左心室射血分數（LVEF），用以評估大鼠心臟功能。

2.7 血清中VEGF含量測定

各組大鼠再灌注后取眼眶內眥動脈血4 mL，常溫靜置30 min，3 000 r/min（離心半徑13.5 cm）離心20 min，取上清液按VEGF試劑盒的說明書操作，采用酶聯免疫吸附試驗（ELISA）法檢測血清中VEGF含量。

2.8 統計學方法

用SPSS 22.0軟件進行統計分析。計量資料以x±s表示，采用單因素方差分析進行組間比較，細胞凋亡率采用卡方檢驗。P＜0.05表示差異有統計學意義。

3 結果

3.1 心肌梗死面積比例與細胞凋亡率

與假手術組比較，模型組大鼠的心肌梗死面積比例和細胞凋亡率均明顯升高（P＜0.01）。與模型組比較，各給藥組大鼠的心肌梗死面積比例和細胞凋亡率均明顯降低（P＜0.05）。與丁苯酞低劑量組比較，丁苯酞高劑量組大鼠的心肌梗死面積比例和細胞凋亡率均明顯降低（P＜0.05）。各組大鼠心肌梗死面積比例和細胞凋亡率的測定結果見表1。

表1 各組大鼠心肌梗死面積比例和細胞凋亡率的測定結果（x±s，n＝10）Tab 1 Determination results of myocardial infarction area ratio and cell apoptosis rate of rats in each group（x±s，n＝10）

3.2 心肌細胞凋亡情況

在400倍光鏡下可見細胞核為棕黃色的凋亡細胞、細胞核為藍色的正常細胞。假手術組大鼠心肌細胞中絕大部分細胞核為藍色；模型組大鼠心肌細胞中大部分細胞核為棕黃色；而丁苯酞低、中、高劑量組大鼠心肌細胞中均可觀察到細胞核為棕黃色的凋亡細胞，但凋亡細胞數目明顯少于模型組，其凋亡細胞數目排序為丁苯酞高劑量組＜丁苯酞中劑量組＜丁苯酞低劑量組。各組大鼠心肌細胞凋亡的顯微鏡圖見圖1。

圖1 各組大鼠心肌細胞凋亡的顯微鏡圖（×400）Fig 1 Microscope figure of myocardial cell apoptosis of rats in each group（×400）

3.3 凋亡相關蛋白的表達

與假手術組比較，模型組大鼠心肌細胞中Caspase-3、Fas、Caspase-9蛋白表達均明顯增強，Bcl-2蛋白表達明顯減弱（P＜0.01）。與模型組比較，各給藥組大鼠心肌細胞中Caspase-3、Fas、Caspase-9蛋白表達均明顯減弱，Bcl-2蛋白表達明顯增強（P＜0.05）；其中，丁苯酞中、高劑量組改善效果明顯強于丁苯酞低劑量組（P＜0.05）。各組大鼠心肌細胞中凋亡相關蛋白表達的電泳圖見圖2，測定結果見表2。

圖2 各組大鼠心肌細胞中凋亡相關蛋白表達的電泳圖Fig 2 Electrophoresis chart of expressions of apoptosis-related proteins in myocardial cells in each group

表2 各組大鼠心肌細胞中凋亡相關蛋白表達的測定結果（x±s，n＝10）Tab 2 Determination results of expressions of apoptosis-related proteins in myocardial cells in each group（x±s，n＝10）

3.4 心臟LVEF及血清中VEGF含量測定結果

與假手術組比較，模型組大鼠心臟LVEF和血清中VEGF含量均明顯降低（P＜0.01）。與模型組比較，除丁苯酞低劑量組大鼠的LVEF無明顯變化外（P＞0.05），其余各給藥組大鼠心臟的LVEF和血清中VEGF含量均明顯升高（P＜0.05）。各組大鼠的LVEF和血清VEGF含量的測定結果見表3。

表3 各組大鼠的LVEF和血清VEGF含量的測定結果（x±s，n＝10）Tab 3 Determination results of LVEF，serum VEGF contents of rats in each group（x±s，n＝10）

4 討論

溶栓治療、冠狀動脈介入手術和冠狀動脈搭橋等是臨床治療急性心肌梗死的常用手段，可恢復心肌細胞血液灌注，但后來發現療效沒有達到預期值。經過多位學者的研究提出了心肌I/R的概念[6]。心肌I/R是指心肌細胞發生缺血性損傷后，恢復血液灌注后反而更加重了原來受損細胞的功能和代謝障礙[7]。心肌細胞凋亡是心肌I/R發生的重要標志，因此采取有效手段減少心肌I/R，抑制細胞凋亡，可達到保護心臟的目的。

關于心肌細胞凋亡的誘因有很多，主要通過兩條途徑實現：第一條稱為外在途徑，主要利用細胞間的死亡配基活化相關受體實現。Fas配體屬于介導宿主防御和免疫反應的腫瘤壞死因子（TNF）超家族，通過與配體FasL結合活化，進一步與Caspase-8形成復合物，激活凋亡執行因子Caspase-3、Caspase-5、Caspase-7，最終啟動凋亡程序[8]。第二條稱為內在途徑或線粒體途徑，Bcl-2/Bax家族相關蛋白是此途徑研究最多的一系列蛋白。大量的細胞內信號包括各種應激、DNA損失和異常的細胞信號都可以引起Bcl-2家族促凋亡相關蛋白的活化，進而誘導線粒體釋放細胞色素c、凋亡小體或促使Caspase-9活化，最終導致 Caspase-3、Caspase-5、Caspase-7活化，通過蛋白酶水解使細胞崩潰[9]。目前研究發現心肌I/R促細胞凋亡主要與激活Bcl-2通路有關[10]。

丁苯酞是從芹菜籽中提取的天然產物，起初由于其顯著的神經保護作用被關注。有研究結果顯示，丁苯酞可抑制神經細胞凋亡、改善細胞功能、減少細胞梗死面積、改善線粒體功能和抑制氧化損傷等[11]。而丁苯酞對心臟的作用研究較少。丁苯酞主要的作用靶點在血管內皮細胞，其作用范圍廣泛，可對多種器官起作用。近年對丁苯酞研究范圍逐漸擴大，其對心臟的作用慢慢為人所知[12]。Moghadam MH等[13]最早發現了芹菜籽提取物對高血壓大鼠模型的作用，并指出丁苯酞是發揮療效的主要物質；Wang W等[14]對上述現象的機制進一步研究，提出丁苯酞通過雙孔鉀離子通道TREK-1作用于心肌細胞的機制；Wang YG等[15]應用丁苯酞作用于心肌梗死再灌注損傷大鼠，觀察到丁苯酞抑制細胞凋亡的現象，但未對其機制作進一步解析。

在缺血缺氧等特定條件的刺激作用下可引發人體血管的新生。在血管新生的過程中，受到多種體內外因素包括促進與抑制VEGF、神經-內分泌-免疫系統等，其中，VEGF作為一類對血管生長調節具有重要作用的細胞因子，是血管的再生及形成過程中的重要信號關聯蛋白之一。本研究發現，丁苯酞可改善大鼠LVEF，提示其可改善心肌損傷大鼠心室收縮和舒張功能；還可通過上調血清VEGF的表達水平，從而對心肌缺血疾病起到一定的保護作用。

本研究發現，丁苯酞可有效預防大鼠心肌I/R，保護心功能；其機制可能是同時通過細胞凋亡外在途經及內在途經起作用，并與VEGF的表達有關。本研究結果為急性缺血性心臟病的治療提供了新的研究思路。

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（編輯：鄒麗娟）

Study on the Preventive Effect and Mechanism of Butylphthalide on Myocardial Ischemia-reperfusion Injury in Rats

ZHOU Fei，ZHANG Jingwen，WANG Wei
（Dept.of Cardiovascular Medicine，Hainan Provincial People’s Hospital，Haikou 570311，China）

R965

A

1001-0408（2017）25-3518-04

2017-01-19

2017-06-07）

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.25.17

＊主治醫師，碩士。研究方向：冠心病介入治療。E-mail：13379950245@163.com