早竹叢枝病的調(diào)查及病原菌的分子鑒定

耿顯勝，張 威，仲建平，張守科，舒金平

(1.中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院亞熱帶林業(yè)研究所，浙江 杭州 311400；2.浙江省德清縣林業(yè)技術(shù)推廣站，浙江 德清 313200)

早竹叢枝病的調(diào)查及病原菌的分子鑒定

耿顯勝1，張 威1，仲建平2，張守科1，舒金平1

(1.中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院亞熱帶林業(yè)研究所，浙江 杭州 311400；2.浙江省德清縣林業(yè)技術(shù)推廣站，浙江 德清 313200)

目的對(duì)早竹叢枝病進(jìn)行調(diào)查及病原菌分子鑒定，為早竹叢枝病的病害診斷和防治提供科學(xué)依據(jù)。方法采用單株水平和單枝盤水平的2種病害分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)早竹叢枝病進(jìn)行調(diào)查。使用植原體16S rDNA和真菌rDNA-ITS序列的特異性PCR引物，對(duì)早竹叢枝病的病原菌進(jìn)行分子鑒定。結(jié)果調(diào)查的6塊樣地早竹叢枝病的平均發(fā)病率為18.59%，平均病情指數(shù)為6.67。感病的早竹DNA樣品能夠擴(kuò)增出真菌的rDNA-ITS序列，而不能夠擴(kuò)增出植原體的16S rDNA序列；擴(kuò)增出的序列與報(bào)道的竹針孢座囊菌的序列同源性達(dá)到99.00%，與其它真菌的序列同源性最高僅為94.00%。結(jié)論浙江省德清縣早竹叢枝病的病原菌為竹針孢座囊菌。

早竹；竹子叢枝病；竹針孢座囊菌；分子鑒定；病情指數(shù)

Abstract:[Objective]In this study, the witches’ broom disease ofPhyllostachyspraecoxwas assessed, and the pathogen of the disease was identified through molecular biology techniques. [Method]The disease severity was assessed by grading witches’ broom disease at individual level and branch level. The pathogen of witches’ broom disease ofPh.praecoxwas identified by specific PCR primers of phytoplasmal 16S rDNA and fungal rDNA-ITS sequences. [Result]Disease assessment data showed that the average incidence of the 6 plots was 18.59%, and the average disease index was 6.67. PCR results indicated that all the samples infected were able to amplify rDNA-ITS sequence of fungus, and could not amplify 16S rDNA of phytoplasma. Comparative BLAST analysis determined that the amplicons shared 99.00% similarity with sequences fromAciculosporiumtake, and the highest similarity with other fungi was only 94.00%. [Conclusion]A.takewas the causal agent of witches’ broom disease ofPh.praecoxof Deqing County, Zhejiang Province.

Keywords:Phyllostachyspraecox; bamboo witches’ broom;Aciculosporiumtake; molecular identification; disease index

早竹(PhyllostachyspraecoxC. D. Chu et C. S. Chao)筍期早、產(chǎn)量高、筍味美、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，是我國(guó)南方的重要筍用竹種[1-2]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)南方早竹的種植面積在6.7萬(wàn)hm2以上，年產(chǎn)值達(dá)10億多元[3]；浙江省是早竹的主要種植區(qū)，僅德清縣種植的早竹就有0.7萬(wàn)hm2，年產(chǎn)值近億元。早竹在浙江省林業(yè)經(jīng)濟(jì)發(fā)展中發(fā)揮著重要作用，種植早竹已經(jīng)成為林農(nóng)增收致富的重要手段。然而，早竹卻是叢枝病的易感竹種，絕大多數(shù)早竹林地都有叢枝病發(fā)生，發(fā)病嚴(yán)重林地的發(fā)病率高達(dá)52.2%[4-5]。

竹子叢枝病是竹類植物上的重要病害，發(fā)生普遍，危害嚴(yán)重，造成竹子長(zhǎng)勢(shì)衰弱、出筍減少、嚴(yán)重者整株枯死[6-7]，影響竹子生長(zhǎng)和竹林的可持續(xù)經(jīng)營(yíng)。引起竹子叢枝的原因眾多，有病原菌侵染造成的，有昆蟲(chóng)取食引起的，也有自然發(fā)生的[8-9]。在我國(guó)，已報(bào)道的病原菌有竹針孢座囊菌(AciculosporiumtakeMiyake)、植原體(CandidatusPhytoplasma)、竹異香柱菌屬(Heteroepichloё Tanaka)和竹暗球腔菌(PhaeosphaeriabambusaeMiyake et Hara)4類，并且在不同竹種上引起叢枝病的病原菌不同，同一竹種上也可能存在多種病原菌混合侵染[9-11]。這些因素增加了竹子叢枝病病原研究的難度和復(fù)雜性，導(dǎo)致當(dāng)前早竹叢枝病的研究止步不前。本研究采用單株水平和單枝盤水平的病害分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)浙江省德清縣的早竹叢枝病進(jìn)行了調(diào)查；利用叢枝病病原細(xì)菌和真菌的特異性PCR引物，采用分子生物學(xué)的方法對(duì)該地區(qū)的早竹叢枝病病原菌的保守序列進(jìn)行擴(kuò)增、克隆和序列分析，明確了引起早竹叢枝病的病原菌。本文研究結(jié)果可為早竹叢枝病的病害診斷和防治提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1供試植物材料 早竹叢枝病的樣品采集于浙江省德清縣的萬(wàn)畝早竹林。使用高枝剪剪取具有叢枝癥狀的小枝，每株早竹上只取1份樣品，每?jī)煞輼悠分g間隔50m以上。剪取的樣品裝于自封袋中，每個(gè)自封袋裝1份，樣品采集完后立即帶回實(shí)驗(yàn)室，保存于-80℃超低溫冰箱待用。同時(shí)在沒(méi)有叢枝病發(fā)生的地塊采集早竹小枝作為陰性對(duì)照材料。在中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院亞熱帶林業(yè)研究所試驗(yàn)林場(chǎng)，使用高枝剪剪取具有叢枝癥狀的泡桐(Paulowniaspp.)枝條作為陽(yáng)性對(duì)照材料。

1.1.2試劑和引物 植物基因組DNA提取試劑盒、普通DNA產(chǎn)物純化試劑盒、DNA克隆試劑盒、TOP10感受態(tài)細(xì)胞和2×PCR MasterMix購(gòu)于天根生化科技(北京)有限公司；DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000購(gòu)于寶生物工程(大連)有限公司。試驗(yàn)用到的引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，DNA測(cè)序由鉑尚生物技術(shù)(上海)有限公司完成。

1.2早竹叢枝病的調(diào)查方法

早竹叢枝病發(fā)生嚴(yán)重期，在浙江省德清縣選取6塊樣地進(jìn)行病害調(diào)查。參照陳建寅等[5]的方法在每塊樣地中設(shè)置3個(gè)小樣方，采用人眼觀察法對(duì)每個(gè)樣方的每株竹子進(jìn)行調(diào)查，記錄樣方中竹子總株數(shù)、發(fā)病株數(shù)、發(fā)病株總枝盤數(shù)、感病枝盤數(shù)和感病枝盤的病情等級(jí)。

參照陳建寅[5]的方法將竹子單株水平的病情分為5級(jí)，依據(jù)觀察和文獻(xiàn)描述的竹子叢枝病病害癥狀的發(fā)展規(guī)律[12-13]，將單枝盤水平上的病情分為5級(jí)，具體分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表1。早竹發(fā)病率和病情指數(shù)的計(jì)算公式如下：

1.3早竹叢枝病材料的總DNA提取

將保存于超低溫冰箱的樣品取出，使用干凈的剪刀剪碎，置于研缽中，添加液氮研磨成粉末。稱取0.1g左右的粉末，依據(jù)天根生化科技(北京)有限公司的植物材料DNA提取試劑盒的操作步驟進(jìn)行DNA提取。以具有叢枝癥狀的泡桐枝條作為陽(yáng)性對(duì)照樣品，無(wú)叢枝癥狀的早竹小枝作為陰性對(duì)照樣品。提取的總DNA采用凝膠電泳法檢測(cè)其質(zhì)量。

1.4早竹叢枝病病原菌的分子鑒定

1.4.1早竹叢枝病植原體病原的16SrDNA序列擴(kuò)增 以提取的總DNA為模板，采用Duduk等[14]報(bào)道的引物對(duì)R16mF2/R16mR1(5’-CATGCAAGTC-GAACGGA-3’/5’-TTAACCCCAATCATCGAC-3’)和R16F2n/R16R2(5’-GAAACGACTGCTAAGACTGG-3’/5’-TGACGGGCGGTGTGTACAAACCCCG-3’)進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增的植原體16SrRNA基因片段大小約為1200bp。擴(kuò)增使用的反應(yīng)體系為：2×PCRMix10μL，10mmol·L-1的正、反向引物各0.6μL，模板1μL，加ddH2O補(bǔ)足20μL。巢式PCR第1輪的反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，

表1 竹子叢枝病的病情分級(jí)

60℃退火30 s，72℃延伸90 s；72℃下延伸10 min，循環(huán)數(shù)為30。第1輪PCR的產(chǎn)物稀釋20倍后取1 μL作為第2輪PCR的模板，PCR擴(kuò)增的體系同上。第2輪PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸70 s；72℃延伸10 min，循環(huán)數(shù)為38。取5 μL第2輪PCR產(chǎn)物，使用0.9%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分析。電泳結(jié)束后在凝膠成像儀上照相記錄結(jié)果。

1.4.2 早竹叢枝病真菌病原的rDNA-ITS序列擴(kuò)增 以提取的總DNA為模板，采用報(bào)道的引物對(duì)ITS1-F/ITS4(5’- CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA -3’/5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)進(jìn)行PCR擴(kuò)增[15-16]，擴(kuò)增的真菌rDNA-ITS序列片段大小約為600 bp。擴(kuò)增時(shí)使用的反應(yīng)體系為：2 × PCR Mix 10 μL，10 mmol·L-1的正、反向引物各0.4 μL，模板1 μL，加ddH2O 補(bǔ)足20 μL。PCR的反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5 min；95℃變性35 s，55℃退火55 s，72℃延伸60 s；72℃下延伸10 min，循環(huán)數(shù)為35。取5 μL的PCR產(chǎn)物，使用1.5%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分析。電泳結(jié)束后在凝膠成像儀上照相記錄結(jié)果。

1.4.3 PCR產(chǎn)物的純化、克隆和序列分析 PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳檢測(cè)，陽(yáng)性擴(kuò)增子使用普通DNA產(chǎn)物純化試劑盒純化。純化的PCR產(chǎn)物連接到pLB載體，連接的反應(yīng)體系為：pLB載體0.5 μL、Insert DNA 0.6 μL、2 × Reaction Solution 0.5 μL、Blunting Enzyme 0.25 μL、T4 DNA Ligase 0.5 μL，最后加ddH2O補(bǔ)足至5 μL。全部連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到50 μL的感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化的試驗(yàn)程序參照感受態(tài)細(xì)胞使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.5數(shù)據(jù)處理

病害調(diào)查的原始試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用Excel2010和SPSS13.0軟件進(jìn)行計(jì)算和處理。測(cè)定的序列采用NCBI上的BlastN軟件進(jìn)行在線比對(duì)，利用DNAMAN6.0軟件進(jìn)行多重序列比對(duì)和同源性分析。多重比對(duì)時(shí)使用的其它序列來(lái)源于GenBank，其登陸號(hào)如下：AB066292、AB066293、AB086846、AB065423、EF363682、EF363683。

2 結(jié)果與分析

2.1早竹叢枝病的調(diào)查結(jié)果

本試驗(yàn)在浙江省德清縣的萬(wàn)畝早竹林共調(diào)查了6塊樣地的18個(gè)樣方，病害調(diào)查結(jié)果見(jiàn)表2。6塊樣地叢枝病發(fā)病率變化較大，最高發(fā)病率為43.23%，最低為6.08%，平均發(fā)病率為18.59%。樣地病情指數(shù)最高為14.99，最低為1.52，平均病情指數(shù)為6.67。各樣方感病株平均病情指數(shù)最高為31.15，最低為0，平均病情指數(shù)為11.86。

從表2中也可看出，在相同樣方中其樣方病情指數(shù)與感病株平均病情指數(shù)存在差異，絕大多數(shù)樣方病情指數(shù)小于感病株平均病情指數(shù)。而不同樣方間進(jìn)行比較時(shí)，即使樣方病情指數(shù)相同，其感病株平均病情指數(shù)也不同。如6號(hào)樣地的樣方2、4號(hào)樣地的樣方2和2號(hào)樣地的樣方2的樣方病情指數(shù)都為11.36，但其感病株的平均病情指數(shù)分別為31.15、11.16和14.34，表明6號(hào)樣地的樣方2與4號(hào)樣地的樣方2和2號(hào)樣地的樣方2相比，其感病株上的小枝發(fā)病更為嚴(yán)重。故將單株水平和單枝盤水平的病情分級(jí)同時(shí)用于叢枝病的調(diào)查，能更好的反映叢枝病在樣地中發(fā)生情況。

表2 早竹叢枝病的病害調(diào)查結(jié)果

2.2早竹叢枝病材料的總DNA提取結(jié)果

本研究提取了表現(xiàn)叢枝癥狀的早竹材料、健康的早竹材料和表現(xiàn)叢枝癥狀的泡桐材料的總DNA。提取的總DNA樣品進(jìn)行凝膠電泳檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)樣品的總DNA帶大小一致、清晰明亮，無(wú)明顯拖尾現(xiàn)象，亦無(wú)蛋白質(zhì)和RNA污染(圖1)。因此，本研究提取的總DNA濃度高、純度好、降解少，可以用于后續(xù)的分子生物學(xué)試驗(yàn)。

M：DL2000；122：表現(xiàn)叢枝癥狀的小枝；23：健康的小枝Lane M: DL2000; lane 122: The twigs showing symptoms of witches' broom disease; lane 23:healthy twigs圖1 早竹小枝提取的總DNA電泳圖Fig.1 Totle DNA extracted from the twigs of Ph. praecox

2.3早竹叢枝病植原體病原的分子鑒定

采用引物對(duì)R16mF2/ R16mR1和R16F2n/ R16R2對(duì)提取的DNA樣品進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析。結(jié)果表明，泡桐叢枝病材料的DNA樣品能夠擴(kuò)增出約1200bp的條帶，而所有早竹的DNA樣品均不能夠擴(kuò)增出清晰的1200bp的條帶(圖2)。表明樣品中沒(méi)有植原體DNA存在，即收集的早竹叢枝病材料的病原菌非植原體。

M: DL2000；122: 感病的早竹小枝；23: 健康的早竹小枝；24: 感病的泡桐小枝Lane M: DL2000; lane 122: Infected Ph. praecox; lane 23: Healthy Ph. praecox; lane 24: Infected paulownia圖2 巢式PCR擴(kuò)增植原體16S rRNA基因的片段Fig.2 Nested PCR amplification of the partial fragment of 16S rRNA gene

2.4早竹叢枝病真菌病原的rDNA-ITS序列擴(kuò)增

采用引物對(duì)ITS1-F/ITS4對(duì)提取的DNA樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析。從結(jié)果可以看出，所有表現(xiàn)叢枝癥狀的早竹樣品都能夠擴(kuò)增出約600bp的DNA條帶，而表現(xiàn)健康的早竹樣品不能夠擴(kuò)增出相同大小的條帶(圖3)，表明在感病的早竹樣品中存在真菌病原物。

M: DL2000；122: 表現(xiàn)叢枝癥狀的早竹小枝；23: 健康的早竹小枝Lane M: DL2000; lane 122: Infected Ph. praecox; lane 23: Healthy Ph. praecox圖3 PCR擴(kuò)增病原真菌的ITS序列Fig.3 PCR amplification of rDNA-ITSsequences of fungus

2.5PCR產(chǎn)物的純化、克隆和序列分析

3 討論

竹子叢枝病是廣泛發(fā)生于亞洲東部竹產(chǎn)區(qū)的重要病害，早在20世紀(jì)初，日本學(xué)者就對(duì)其病原物進(jìn)行研究，到目前已經(jīng)鑒定的竹子病原菌有植原體、竹針孢座囊菌、竹暗球腔菌、竹異香柱菌等[9-10]，并且這些病原菌還會(huì)以混合侵染的形式存在于某一竹種上。這不僅造成竹林經(jīng)營(yíng)中的產(chǎn)量損失，也會(huì)給竹子叢枝病病原物的鑒定、致病性研究、抗病育種、病害防治等科學(xué)研究帶來(lái)困難。而本研究使用植原體16SrDNA和真菌rDNA-ITS序列特異性的引物對(duì)竹子叢枝病材料的病原菌進(jìn)行分子鑒定，能夠全面、準(zhǔn)確地鑒定發(fā)病材料的病原菌。

植原體是一類能夠引起1000多種植物發(fā)病的病原細(xì)菌，而叢枝癥狀是植原體侵染時(shí)產(chǎn)生的典型癥狀之一，故植物出現(xiàn)叢枝癥狀，常被懷疑為植原體侵染。事實(shí)上，在中國(guó)、韓國(guó)、印度、日本等國(guó)均有植原體引起的竹子叢枝病的報(bào)道[17-20]。本研究在浙江省德清縣萬(wàn)畝早竹林采集到28份表現(xiàn)叢枝癥狀的早竹材料，使用試劑盒提取總DNA。利用植原體檢測(cè)時(shí)使用的引物進(jìn)行植原體保守序列16SrDNA的擴(kuò)增，檢測(cè)樣品中的植原體病原物。然而，作者只在感病的泡桐DNA樣品(陽(yáng)性對(duì)照)中擴(kuò)增出了目的片段，在所有感染叢枝病的早竹樣品中均沒(méi)有擴(kuò)增出目的片段，表明早竹叢枝病材料中不存在植原體，即本研究的早竹叢枝病不是由植原體引起。

細(xì)胞核DNA中的轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(InternalTranscribedSpacer，ITS)既具有保守性，又在科、屬、種水平上具有特異性的自身優(yōu)點(diǎn)；并且在基因庫(kù)中存放有超過(guò)172000條全長(zhǎng)的真菌ITS序列，可以通過(guò)在線比對(duì)快速確定要鑒定物種的分類信息，故ITS廣泛地用于單個(gè)真菌和環(huán)境中的真菌混合物的物種鑒定[21-22]。在本研究中，使用rDNA-ITS序列特異引物對(duì)ITS1-F/ITS4進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)，所有感病的早竹DNA樣品均能夠擴(kuò)增出約600bp的目的條帶，而健康的早竹樣品在該位置沒(méi)有擴(kuò)增出條帶，只在約700bp處出現(xiàn)一條較弱的雜帶，該雜帶可能由竹子內(nèi)生菌污染造成。擴(kuò)增出的目的條帶克隆到載體pLB并進(jìn)行測(cè)序、序列分析和在線比對(duì)，發(fā)現(xiàn)其與報(bào)道的竹針孢座囊菌的序列同源性為99.00%，確證早竹叢枝病的病原物為麥角菌科(Clavicipitaceae)的竹針孢座囊菌。竹針孢座囊菌的主要傳播方式是分生孢子通過(guò)春雨傳播[23-24]，因此，可在其分生孢子散發(fā)之前鏟除發(fā)病的竹株，防止病原菌的擴(kuò)散和蔓延。

通過(guò)樣方法對(duì)浙江省德清縣的早竹進(jìn)行叢枝病病害調(diào)查，6塊樣地18個(gè)樣方的平均發(fā)病率為18.59%，平均病情指數(shù)6.67，表明調(diào)查的早竹林輕度發(fā)生叢枝病。本次的早竹叢枝病的調(diào)查結(jié)果與陳建寅等[5]和劉軍等[25]的調(diào)查結(jié)果相比，浙江德清的早竹發(fā)病較輕，這可能與目前的早竹林地的經(jīng)營(yíng)方式有關(guān)。通過(guò)比較樣方的病情指數(shù)與各樣方感病株的平均病情指數(shù)，發(fā)現(xiàn)兩者之間并不完全一致。樣方的病情指數(shù)反映的是樣方的感病水平，表現(xiàn)為樣方的總體感病情況，其在調(diào)查統(tǒng)計(jì)時(shí)只考慮發(fā)病枝條的數(shù)量多少，而忽略了發(fā)病株不同枝條上的叢枝病的嚴(yán)重程度的差異性。而本研究依據(jù)竹叢枝病的病害表觀癥狀的發(fā)展進(jìn)行分級(jí)，對(duì)感病株的各盤枝條的發(fā)病程度進(jìn)行逐一統(tǒng)計(jì)，并計(jì)算樣方中感病株的病情指數(shù)，詳細(xì)地記錄病害在單株早竹上的嚴(yán)重程度。故兩種病情分級(jí)的綜合能夠更全面地反映叢枝病在早竹上的危害狀況和嚴(yán)重程度。

4 結(jié)論

本研究采用細(xì)菌和真菌保守序列的PCR引物對(duì)早竹叢枝病的病原物進(jìn)行分子鑒定，結(jié)果表明，早竹叢枝病的病原物為竹針孢座囊菌；通過(guò)對(duì)病害進(jìn)行調(diào)查和統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)叢枝病在浙江德清集約經(jīng)營(yíng)林地的早竹上輕度危害，尚不會(huì)對(duì)生產(chǎn)經(jīng)營(yíng)造成重大的經(jīng)濟(jì)損失。本文研究結(jié)果可為早竹叢枝病的病害調(diào)查、診斷、防治以及防治效果的評(píng)價(jià)提供科學(xué)依據(jù)。

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(責(zé)任編輯：金立新)

DiseaseSeverityAssessingandMolecularIdentificationofPathogenAssociatedwithWitches’BroomDiseaseofPhyllostachyspraecox

GENGXian-sheng1,ZHANGWei1,ZHONGJian-ping2,ZHANGShou-ke1,SHUJin-ping1

(1.Research Institute of Subtropical Forestry, Chinese Academy of Forestry, Hangzhou 311400, Zhejiang, China;2.Forestry Technology Extension Station of Deqing County, Zhejiang Province, Deqing 313200, Zhejiang, China)

S795.9

A

1001-1498(2017)05-0805-07

10.13275/j.cnki.lykxyj.2017.05.014

2016-12-15

中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金項(xiàng)目(CAFYBB2014QA006)。

耿顯勝(1982—)，男，河南信陽(yáng)人，助理研究員，博士，研究方向?yàn)樯直Ｗo(hù)學(xué).