宮頸癌組織中Ang-2及其受體Tie-2的表達變化

任新萍，邵偉偉，薛金玲

(鹽城市第一人民醫院，江蘇鹽城224006)

宮頸癌組織中Ang-2及其受體Tie-2的表達變化

任新萍，邵偉偉，薛金玲

(鹽城市第一人民醫院，江蘇鹽城224006)

目的觀察宮頸癌組織中血管生成素-2(Ang-2)和其受體酪氨酸激酶受體2(Tie-2)表達變化，并探討其臨床意義。方法選擇2014年1月～2017年1月收治的86例宮頸癌患者的手術切除宮頸癌組織標本為觀察組，同期收治的86例子宮肌瘤患者的正常宮頸組織標本為對照組。采用免疫組化法定性檢測兩組Ang-2、Tie-2蛋白表達情況。采用RT-PCR法定量檢測兩組Ang-2、Tie-2 mRNA表達量，采用Western blotting法定量檢測兩組Ang-2、Tie-2蛋白表達量。分析宮頸癌組織Ang-2、Tie-2蛋白定性表達情況與宮頸癌臨床病理參數的關系。結果觀察組Ang-2、Tie-2 mRNA及蛋白表達量均高于對照組(P均<0.05)。免疫組化染色結果觀察組Ang-2表達陽性51例(59.30%)、Tie-2表達陽性54例(62.79%)，對照組Ang-2表達陽性35例(40.70%)、Tie-2表達陽性37例(43.02%)，觀察組Ang-2、Tie-2蛋白陽性表達率均高于對照組(P均<0.05)。宮頸癌組織Ang-2、Tie-2陽性表達與宮頸癌FIGO分期、淋巴結轉移有關(P均<0.05)，與年齡、組織學類型、分化程度無關(P均>0.05)。結論宮頸癌組織Ang-2和其受體Tie-2表達上調。檢測宮頸癌組織Ang-2和其受體Tie-2表達有助于判斷宮頸癌患者的FIGO分期和淋巴結轉移情況。

宮頸腫瘤宮頸癌；血管生成素-2；絡氨酸激酶受體2

宮頸癌為婦科臨床十分廠家的惡性腫瘤，對女性健康造成嚴重威脅。臨床研究發現，造成宮頸癌患者死亡的直接原因是腫瘤細胞自身增殖、浸潤以及轉移等，腫瘤新生是存在于以上過程的一個共同特征[1，2]。新生血管形成過程十分復雜，受到多種生長因子以及細胞因子的共同調控，并且此兩類因子保持動態平衡。如血管生長因子水平上升或血管生成抑制類因子減少，二者平衡狀態被打破，則會造成腫瘤新生血管大量生成。血管生成素能夠對腫瘤血管生成產生重要調控作用[3，4]。血管生成素家族成員血管生成素2(Ang-2)能夠和內皮細胞獨有的一種激酶受體絡氨酸激酶受體2(Tie-2)相結合，參與乳腺癌、肺癌的新生血管生成。但是宮頸癌組織中Ang-2及其受體Tie-2表達變化及其臨床意義尚不明確。本研究觀察了宮頸癌組織Ang-2和其受體Tie-2表達變化，并探討其臨床意義。現報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2014年1月～2017年1月收治的86例宮頸癌患者的手術切除宮頸癌組織標本為觀察組。納入標準：①符合WHO關于宮頸癌的有關診斷標準[5]；②年齡≥35歲；③入組前均未實施過放化療或生物免疫治療。排除標準：①有嚴重的心、肝、腎等有關臟器功能不全者；②有其他類型的惡性腫瘤者；③病歷資料缺失者。患者年齡35～64(46.81±2.13)歲，其中<40歲者29例，≥40歲者57例。FIGO分期Ⅰ～Ⅱ期51例，Ⅲ～Ⅳ期35例。鱗癌59例，腺癌27例。分化程度低分化22例，中分化36例，高分化28例。有淋巴結轉移者29例，無淋巴結轉移者57例。另選同期因子宮肌瘤接受手術治療的86例患者的正常宮頸組織標本為對照組。患者年齡35～62(46.84±2.05)歲。兩組患者年齡相比P>0.05。本研究已經我院醫學倫理委員會批準，入組患者均已簽署知情同意書。

1.2 Ang-2、Tie-2 mRNA檢測 采用RT-PCR法。用Trizol法提取總RNA，逆轉錄后行RT-PCR。用β-actin為內參照。Ang-2上游引物5′-CTTATGAGCGAGAATGGG-3′，下游引物5′-TAGGTTGTTGGGTTGTTT-3′，擴增產物長度181 bp。Tie-2上游引物5′-TGAACCTTGTAACGGATAG-3′，下游引物5′-TAGGTTGTTGGGTTGTTT-3′，擴增產物長度245 bp。內參照β-actin上游引物5′-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3′，下游引物5′-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3′，擴增產物長度250 bp。PCR反應條件95 ℃ 5min，然后94 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，進行28個循環。取5 μL的PCR產物行凝膠電泳，Ang-2/Tie-2 mRNA表達量用Ang-2/Tie-2 條帶與內參照β-actin條帶灰度值之比表示。

1.3 Ang-2、Tie-2蛋白檢測 ①定性檢測：采用免疫組化SP法。將兩組石蠟標本4 μm連續切片，65℃下烤片過夜，而后脫蠟水化，用3%的過氧化氫對其中的內源型過氧化物酶行10 min的滅活處理，再給予2 min的PBS沖洗，共沖洗3遍。再行抗原熱修復，pH=9.0條件下70℃孵育20 min，給予20 min的PBS沖洗。在室溫下用羊血清封閉約10 min，加入一抗在室溫下孵育1 h，PBS沖洗，加入二抗在室溫下孵育約25 min，PBS沖洗3遍。而后用DAB顯色液對其顯色7 min，PBS沖洗。用蘇木精復染，脫水、透明、并封固切片。顯微鏡下觀察，細胞質內出現棕黃色顆粒為陽性染色，隨機選擇10個高倍鏡視野，陽性染色細胞比例≥5%為陽性表達。②定量檢測：采用Western blotting法。將兩組標本勻漿，加入尿素裂解液冰上裂解1 h，4 ℃下3 000 r/min離心20 min，收集上清液用12%的SDSPAGE電泳分離蛋白，半干法轉印到PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉60 min，加入一抗4 ℃孵育過夜，加入二抗37 ℃孵育50 min，ECL顯影，凝膠成像系統成像。以β-actin為內參照，Ang-2/Tie-2 蛋白表達量用Ang-2/Tie-2 條帶與內參照β-actin條帶灰度值之比表示。

2 結果

2.1 兩組Ang-2、Tie-2 mRNA及蛋白表達比較 觀察組、對照組Ang-2、Tie-2 mRNA及蛋白表達量見表1。觀察組Ang-2、Tie-2 mRNA及蛋白表達量均高于對照組(P均<0.05)。免疫組化染色結果觀察組Ang-2表達陽性51例(59.30%)、Tie-2表達陽性54例(62.79%)，對照組Ang-2表達陽性35例(40.70%)、Tie-2表達陽性37例(43.02%)，觀察組Ang-2、Tie-2蛋白陽性表達率均高于對照組(P均<0.05)。

2.2 宮頸癌組織Ang-2、Tie-2陽性表達與宮頸癌病理病理參數的關系 見表2。宮頸癌組織Ang-2、Tie-2陽性表達與宮頸癌FIGO分期、淋巴結轉移有關(P均<0.05)，與年齡、組織學類型、分化程度無關(P均>0.05)。

表1 兩組Ang-2、Tie-2的mRNA及蛋白表達量比較

注：與對照組相比，*P<0.05。

表2 宮頸癌組織Ang-2、Tie-2陽性表達與宮頸癌病理病理參數的關系(例)

3 討論

伴隨宮頸細胞學類型檢查技術在臨床的推廣普及，宮頸癌的發病率以及病死率均明顯下降，但我國低齡人群宮頸癌發病率以及病死率仍不斷上升。宮頸癌目前仍然是威脅我國女性生命健康的重要殺手之一。有關宮頸癌預防及治療的相關研究仍需大力開展[6]。目前已經證實腫瘤細胞自身浸潤以及轉移等活動均依賴血管生成，且血管生成受到各項調節因子的精準調控[7，8]。新生血管既能夠為腫瘤組織供應營養，同時還為癌細胞順利進入血液循環系統進行血行擴散以及遠處轉移等創造必要條件。研究發現Ang和血管生成關系密切，并且其中Ang-2及其受體Tie-2對腫瘤組織血管生成及轉移等非常重要[9～11]。

本研究結果顯示，宮頸癌組織Ang-2、Tie-2蛋白陽性表達率、mRNA表達量和蛋白表達量均高于正常宮頸組織，這與戴珍珍等[12，13]的報道相符，提示宮頸癌組織內Ang-2、Tie-2表達上調，血管新生活躍。這可能與二者的形成及作用機制有關。具體來說，Ang家族包括4種蛋白，目前了解較多的為Ang-1和Ang-2。Ang-1為Tie-2的激活劑，有助于維持血管完整性，并對血管成熟起到關鍵作用。Ang-2為Ang-1的一種天然拮抗劑，能對Ang-1的穩定血管功能起到抑制作用。研究發現，Ang-2自身無刺激血管增殖功能，且其對血管生成所發揮的調節作用存在兩面性[14，15]。首先，Ang-2可和Tie-2受體相結合，進而抑制細胞內信號發生傳導，使得內皮細胞和血管外周細胞二者間相互作用遭到破壞。并且導致介導基質和原本存在的血管基底膜等破解，造成血管內皮以及基質等穩定狀態被打破。在此類不穩定狀態環境中，血管內皮細胞和其周圍基質均提升自身對生長因子所表現的敏感性，因此，當有生長因子存在情況下，Ang-2能夠促進血管形成，誘發血管出芽，進而使得血管重建。而Tie-2為Ang-2的受體，其能夠在胚胎時期于血管內皮中表達。當成年之后，Tie-2通常表達于人體肺臟以及卵泡等具備血管生成活躍特點的血管內皮上，并能夠幫助維護血管完整性。研究[16，17]證實，Ang-2/Tie-2系統會對腫瘤血管新生發揮關鍵調控作用，表現為當Ang-2與Tie-2相結合之后并不會引起Tie-2的磷酸化，而是使血管內皮細胞和其周圍細胞之間的連接發生離斷，進而參與新生血管生成。

本研究同時分析了宮頸癌組織Ang-2、Tie-2陽性表達與宮頸癌病理病理參數的關系，結果顯示宮頸癌組織Ang-2、Tie-2陽性表達與宮頸癌患者年齡、組織學類型、分化程度無關，與宮頸癌FIGO分期、淋巴結轉移有關，FIGO分期高者和有淋巴結轉移者Ang-2、Tie-2陽性表達率相對較高。這提示了病情嚴重的宮頸癌患者具有更高的Ang-2和Tie-2陽性表達率。原因考慮是因為Ang-2與Tie-2的陽性表達會對腫瘤組織以及其周圍組織等血管生成起到促進作用，利于癌細胞的增殖，因此可能會進一步加重癌癥病情[18～20]。這也提示檢測宮頸癌組織Ang-2和其受體Tie-2表達有助于判斷宮頸癌患者的FIGO分期和淋巴結轉移情況。

[1] 齊陽卓瑪.高原地區宮頸癌的臨床發病特點分析[J].臨床醫學研究與實踐,2017,2(1): 88-89.

[2] Biel NM, Siemann DW. Targeting the Angiopoietin-2/Tie-2 axis in conjunction with VEGF signal interference[J]. Cancer Lett, 2016,380(2):525-533.

[3] Li C, Fan J, Song X, et al. Expression of angiopoietin-2 and vascular endothelial growth factor receptor-3 correlates with lymphangiogenesis and angiogenesis and affects survival of oral squamous cell carcinoma[J]. PLoS One, 2013,8(9):75388-75389.

[4] Hong S, Jung HI, Ahn TS, et al. Expressions and clinical significances of Angiopoietin-1, Angiopoietin-2, and Tie-2 receptor in patients with colorectal cancer[J]. Ann Coloproctol, 2017,33(1):9-15.

[5] 陳秀慧,曲軍英.血管生成素及血管內皮生長因子在進展期宮頸癌中的表達及其與放化療相關性[J].中國臨床藥理學雜志,2014,30(6):490-492.

[6] Atanasov G, Hau HM, Dietel C, et al. Prognostic significance of TIE2-expressing monocytes in hilar cholangiocarcinoma[J].J Surg Oncol, 2016,114(1):91-98.

[7] Li C, Li Q, Cai Y, et al. Overexpression of angiopoietin 2 promotes the formation of oral squamous cell carcinoma by increasing epithelial-mesenchymal transition-induced angiogenesis[J]. Cancer Gene Ther, 2016,23(9):295-302.

[8] 趙宏敏,孫宇輝,鄭建華,等.促血管生成素-2對宮頸癌種植瘤血管形成的影響[J].中國實用婦科與產科雜志,2008,24(1):35-37.

[9] Yu X, Sha J, Xiang S, et al. Suppression of KSHV-induced angiopoietin-2 inhibits angiogenesis, infiltration of inflammatory cells, and tumor growth[J].Cell Cycle, 2016,15(15):2053-2065.

[10] Chen HH, Chai L, Wang SQ, et al. Angiopoietin-2 inhibits the growth of tongue carcinoma without affecting expression of vascular endothelial growth factor[J]. Int J Oral Maxillofac Surg, 2011,40(6):628-632.

[11] Konac E, Onen HI, Metindir J, et al. Lack of association between -460 C/T and 936 C/T of the vascular endothelial growth factor and angiopoietin-2 exon 4 G/A polymorphisms and ovarian, cervical, and endometrial cancers[J]. DNA Cell Biol, 2007,26(7):453-463.

[12] 戴珍珍,陳凱英,朱紅賢,等.Ang-2及Tie-2在宮頸癌組織中的表達及臨床意義[J].浙江醫學,2017,39(4):266-269.

[13] Chen HM, Tsai CH, Hung WC, et al. Foretinib inhibits angiogenesis, lymphangiogenesis and tumor growth of pancreatic cancer in vivo by decreasing VEGFR-2/3 and TIE-2 signaling[J]. Oncotarget, 2015,6(17):14940-14952.

[14] Kopczyńska E, Makarewicz R, Biedka M, et al. Plasma concentration of angiopoietin-1, angiopoietin-2 and Tie-2 in cervical cancer[J]. Eur J Gynaecol Oncol, 2009,30(6):646-649.

[15] 蘇秀馨,全松,王珊珊,等.促血管生成素-2在婦科腫瘤檢測中的應用[J].中國婦幼保健,2009,24(9):1271-1273.

[16] Sun Y, Liu JH, Pan L, et al. Modulatory effects of Beclin 1 on expression of angiopoietin and Tie-2 receptor in human cervical cancer cells[J].Asian Pac J Cancer Prev, 2011,12(11):2985-2990.

[17] 陳秀慧,曲軍英.Ang-2及VEGF在早期宮頸癌中的表達及與血管及淋巴管密度的相關性[J].福建醫藥雜志,2011,33(1):4-7.

[18] Chen HH, Weng BQ, Cheng KJ, et al. Effect of the vascular endothelial growth factor expression level on angiopoietin-2-mediated nasopharyngeal carcinoma growth[J].Vasc Cell, 2014,6(1):4-5.

[19] 王璇,侯建青,姜蕾,等.促血管生成素-2在宮頸癌及宮頸上皮內瘤變中的表達及其臨床意義[J].中國老年學雜志,2010,30(15):2128-2130.

[20] Yang P, Chen N, Yang D, et al. The ratio of serum Angiopoietin-1 to Angiopoietin-2 in patients with cervical cancer is a valuable diagnostic and prognostic biomarker[J]. Peer J, 2017,30(5):3387-3388.

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.35.016

R737.3

B

1002-266X(2017)35-0050-03

2017-07-12)

江蘇省科技計劃項目(BK2015113)。

薛金玲(E-mail：xuejinling_1964@papmedhos.club)。