小干擾RNA與反義寡核苷酸技術抑制肝星狀細胞RhoA表達的效果比較

張玉峰，葉坤英，鐘丹

(1河南中醫藥大學第二臨床醫學院，鄭州450002；2井岡山大學醫學院)

小干擾RNA與反義寡核苷酸技術抑制肝星狀細胞RhoA表達的效果比較

張玉峰1，葉坤英1，鐘丹2

(1河南中醫藥大學第二臨床醫學院，鄭州450002；2井岡山大學醫學院)

目的對比觀察小干擾RNA(siRNA)和反義寡核苷酸(ASODN)技術抑制肝星狀細胞RhoA表達的效果。方法將培養的大鼠肝星狀細胞株HSC-T6隨機分為siRNA組和ASODN組，兩組又分別分為A、B、C、D各4個亞組；siRNA組和ASODN組中的A亞組不轉染質粒， C、D、B亞組分別采用siRNA、ASODN技術轉染大鼠RhoA特異性Rat1 、Rat2質粒及HK-A陰性對照質粒。轉染48 h取各組細胞，以RT-PCR技術檢測細胞中的RhoA、Ⅰ型膠原(Col Ⅰ) mRNA，酶聯免疫吸附法檢測細胞上清液中的透明質酸(HA)及層粘連蛋白(LN)。結果siRNA組與ASODN組中RhoA、Col Ⅰ mRNA均以C亞組表達量最低，組內A、C亞組比較差異有統計學意義(P均<0.05)，組內其余亞組間比較差異無統計學意義(P均>0.05)；siRNA組C亞組RhoA、Col Ⅰ mRNA相對表達量低于ASODN組(P均<0.05)，兩組A、B、D同亞組間比較差異無統計學意義(P均>0.05)。siRNA組與ASODN組細胞上清液HA、LN水平均以C亞組最低，組內A、C亞組比較差異有統計學意義(P均<0.05)，組內其余亞組間比較差異無統計學意義(P均>0.05)；siRNA組C亞組細胞上清液HA、LN水平低于ASODN組(P均<0.05)，兩組A、B、D同亞組間比較差異無統計學意義(P均>0.05)。結論siRNA和ASODN均可抑制大鼠HSC-T6細胞的RhoA表達，但siRNA下Rat1質粒所介導的 RNA干擾技術相對于ASODN能更有效抑制HSC-T6細胞外基質HA、Col Ⅰ、LN的生成。

小干擾RNA；反義寡核苷酸；RhoA；透明質酸；Ⅰ型膠原；層粘連蛋白；肝星狀細胞

肝纖維化是肝臟疾病慢性發展的一個重要病理特征，也是肝硬化發生的中間環節。研究[1～4]發現，肝星狀細胞(HSC)在肝纖維化過程中明顯存在增殖活化，增殖活化的HSC可產生大量的細胞外基質，如透明質酸(HA)、Ⅰ型膠原(Col Ⅰ)及層粘連蛋白(LN)等，這些物質沉淀最終可導致肝纖維化。Rho家族蛋白能參與多種信號通路，調節細胞功能。有研究[5～8]顯示，Rho參與了多種器官組織的纖維化。因此，理論上認為抑制Rho信號傳導途徑可阻止肝纖維化的進程。小干擾RNA(siRNA)和反義寡核苷酸(ASODN)是目前常用的端粒酶抑制劑，常用于基因的靶向治療。2015年6月～2016年6月，我們對比觀察了這兩種靶向技術對大鼠HSC中Rho表達的抑制效果，為肝纖維化的基因治療提供一定參考依據。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 大鼠HSC-T6細胞購自上海中醫藥大學，表達綠色熒光蛋白(EGFP)的大鼠RhoA特異性Rat1及Rat2質粒、HK-A陰性對照質粒由上海中醫藥大學合成；DMEM高糖培養基、新生牛血清(Gibco公司)，TaqDNA聚合酶及M-MLV逆轉錄酶、Rnasin核酸酶抑制劑(Promega公司)；大鼠HA、Col Ⅰ及LN聯免疫吸附法檢測試劑盒(上海生物科技有限公司)。離心機(BECKMAN公司)，恒溫培養箱(Thermo Forma公司)，PCR擴增儀(MJ Research公司)，酶聯免疫檢測儀(Thermo Labsysterm公司)，紫外分光光度儀(Bechman公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養 取DMEM高糖培養基與新生牛血清，配制成含10%新生牛血清培養液；將HSC-T6細胞在5%CO2、飽和濕度、37 ℃下培養，細胞生長80%～90%融合時進行傳代；傳代過程中以10%新生牛血清培養基終止消化，獲取實驗所需的HSC-T6細胞。

1.2.2 細胞分組與轉染 將HSC-T6細胞隨機分為siRNA組和ASODN組，兩組又分別分為A、B、C、D各4個亞組，均接種于6孔板，每組接種2孔(0.5×106/孔)，同時每組另設6個復孔為對照。siRNA組和ASODN組中的A亞組不轉染質粒， C、D、B亞組分別采用siRNA、ASODN技術轉染大鼠RhoA特異性Rat1 、Rat2質粒及HK-A陰性對照質粒。24 h后熒光倒置顯微鏡下觀察細胞熒光，轉染48 h后收集細胞和上清。兩組中A亞組細胞生長良好，形態輪廓清楚；B、C、D組細胞中均見綠色熒光，細胞生長狀態較差，細胞轉染成功。

1.2.3 細胞中RhoA、Col Ⅰ mRNA檢測 采用RT-PCR技術。取各組細胞，經RNA的提取、mRNA逆轉錄為cDNA、PCR反應、電泳等步驟，電泳產物最終在圖像分析儀中進行灰度掃描；用圖像分析儀采集圖像，以擴增目的片段與β-actin的灰度比值表示所擴增的目的基因片段相對表達水平。RhoA上游引物為5′-GTAGAGTTGGCTTTATGGG-3′，下游引物為5′-CTCACTCCGTCTTTGGTC-3′，擴增的片段長度為347 bp。擴增條件：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性1 min，53 ℃退火50 s，72 ℃延伸40 s，32個循環；最后72 ℃延伸8 min。Col Ⅰ上游引物為5′-TGGCGTTCGTGGCTCTCAGGGTAG-3′，下游引物為5′-GCATGTGCGGGCAGGGTTCTTTC-3′，擴增的片段長度為259 bp；擴增條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性1 min，5 ℃退火50 s，72 ℃延伸40 s，32個循環；最后72 ℃延伸8 min。

1.2.4 細胞上清液中HA、LN檢測 采用酶聯免疫吸附法。經前述細胞培養、分組及轉染，以3 000 r/min，4 ℃離心10 min，取上清液，檢測細胞上清液中HA、LN。檢測過程包括建立標準孔及對照孔、各孔加待測液及一抗、酶標抗體工作液、底物抗體工作液、終止液等步驟，最終產物以紫外分光光度儀在492 nm處測定吸光值，計算出HA及LA含量。

2 結果

2.1 各組細胞中RhoA、Col Ⅰ mRNA相對表達量比較 siRNA組與ASODN組中RhoA、Col Ⅰ mRNA均以C亞組表達量最低，組內A、C亞組比較差異有統計學意義(P均<0.05)，組內其余亞組間比較差異無統計學意義(P均>0.05)；siRNA組C亞組RhoA、Col Ⅰ mRNA相對表達量低于ASODN組(P<0.05)，兩組A、B、D同亞組間比較差異無統計學意義(P均>0.05)。見表1。

表1 各組細胞中RhoA、Col Ⅰ mRNA相對表達量

注：與同組內A亞組比較，*P<0.05；與ASODN組同亞組比較，#P<0.05。

2.2 各組細胞上清液HA、LN水平比較 siRNA組與ASODN組細胞上清液HA、LN水平均以C亞組最低，組內A、C亞組比較差異有統計學意義(P均<0.05)，組內其余亞組間比較差異無統計學意義(P均>0.05)；siRNA組C亞組細胞上清液HA、LN水平低于ASODN組(P均<0.05)，兩組A、B、D同亞組間比較差異無統計學意義(P均>0.05)。見表2。

表2 各組細胞上清液HA、LN水平比較

注：與同組內A亞組比較，*P<0.05；與ASODN組同亞組比較，#P<0.05。

3 討論

HSC被認為是肝纖維化過程中的關鍵細胞，也是導致肝細胞發生纖維化及膠原產生的主要原因。HSC被激活后可分泌腫瘤壞死因子、血小板源性生長因子等細胞因子，從而引起細胞外基質在肝內沉積，導致肝纖維化發生。Col Ⅰ、HA及LN是細胞外基質的主要成分，臨床研究也顯示在肝纖維化時Col Ⅰ、HA及LN的表達均明顯升高[9～11]。在肝細胞受損時，內皮細胞對HA的降解能力下降，因此在細胞及血清中HA升高。Col Ⅰ則為細胞基底膜的組成成分，在肝內合成及代謝。肝細胞受損可引起Col Ⅰ破壞，LA主要參與肝竇毛細血管化形成。因此，以上指標往往作為判斷有無纖維化及纖維化嚴重程度的指標被臨床應用。

Rho家族蛋白已經臨床證實參與了多種器官組織的纖維化進程，其介導的信號通路一直是臨床纖維化研究中的新靶點。有研究[5～8]顯示，RhoA是重要的促纖維化因子，采用RNA干擾技術對HSC-T6細胞進行轉染能抑制RhoA基因的表達，同時阻斷RhoA對HSC激活，降低Col Ⅰ、HA及LN等細胞外基質的生成，起到阻斷纖維化過程。反義技術是根據核酸間堿基配對結合原理從基因水平上干擾核酸向蛋白質的傳遞，siRNA和ASODN兩組技術均屬于反義技術[12～16]，以mRNA為靶點，對靶基因表達進行調節。本研究采用以上兩種方法抑制HSC-T6細胞中的RhoA表達，結果顯示兩種方法均能抑制RhoA的表達，證實抑制HSC-T6細胞中的RhoA表達采用以上技術是可行的。觀察兩種方法下Col Ⅰ、HA及LN的表達，均表現為以上細胞外基質指標的下調；但是，進一步比較兩種技術下具體下調效果，siRNA相對于ASODN對細胞外基質的下調效果更為明顯，說明以上兩種技術可能有不同的反義作用機制。一般認為，ASODN主要是通過與細胞核內的mRNA前體相互作用形成雙鏈DNA最終阻斷蛋白質的翻譯，siRNA與ASODN存在差別可能在于mRNA前體和成熟mRNA一級結構，因此導致最終抑制效應也存在不同。但是，由于ASODN在研究過程中更為穩定，并且研究較為成熟，這也是臨床尚未放棄研究ASODN機制的原因。但是，siRNA也已經成為臨床新的研究熱點，值得進一步深入研究其機制。

綜上所述，siRNA和ASODN均可抑制HSC-T6細胞中RhoA的表達，siRNA下Rat1質粒所介導的 RNA干擾技術相對于ASODN能更有效抑制HSC-T6細胞外基質HA、Col Ⅰ、LN的生成，為肝纖維化的基因治療提供了方向。

[1] Pradere JP, Kluwe J, Minicis S, et al. Hepatic macrophages but not dendritic cells contribute to liver fibrosis by promoting the survival of activated hepatic stellate cells in mice[J]. Hepatology, 2013,58(4):1461-1473.

[2] Tan Z, Qian X, Jiang R, et al. IL-17A plays a critical role in the pathogenesis of liver fibrosis through hepatic stellate cell activation[J]. J Immunol, 2013,191(4):1835-1844.

[3] Kong X, Feng D, Wang H, et al. Interleukin-22 induces hepatic stellate cell senescence and restricts liver fibrosis in mice[J]. Hepatology, 2012,56(3):1150-1159.

[4] Troeger JS, Mederacke I, Gwak GY, et al. Deactivation of hepatic stellate cells during liver fibrosis resolution in mice[J]. Gastroenterology, 2012,143(4):1073-1083.

[5] Knipe RS, Tager AM, Liao JK. The Rho kinases: critical mediators of multiple profibrotic processes and rational targets for new therapies for pulmonary fibrosis[J]. Pharmacol Rev, 2015,67(1):103-117.

[6] Riches DWH, Backos DS, Redente EF. ROCK and Rho: promising therapeutic targets to ameliorate pulmonary fibrosis[J]. Am J Pathol, 2015,185(4):909-912.

[7] Tsou PS, Haak AJ, Khanna D, et al. Cellular mechanisms of tissue fibrosis. 8. Current and future drug targets in fibrosis: focus on Rho GTPase-regulated gene transcription[J]. Am J Physiol Cell Physiol, 2014,307(1):2-13.

[8] Satoh K, Suzuki K, Sunamura S, et al. Crucial roles of rho-kinase, cyclophilin a and its receptor, basigin, for cardiac hypertrophy, fibrosis and failure-novel therapeutic targets[J]. J Card Fail, 2015,21(10):158.

[9] Iredale JP, Thompson A, Henderson NC. Extracellular matrix degradation in liver fibrosis: Biochemistry and regulation[J]. Biochim Biophys Acta, 2013,1832(7):876-883.

[10] Leeming DJ, Byrjalsen I, Jimenez W, et al. Protein fingerprinting of the extracellular matrix remodelling in a rat model of liver fibrosis-a serological evaluation[J]. Liver Int, 2013,33(3):439-447.

[11] Zhang Z, Guo Y, Zhang S, et al. Curcumin modulates cannabinoid receptors in liver fibrosis in vivo and inhibits extracellular matrix expression in hepatic stellate cells by suppressing cannabinoid receptor type-1 in vitro[J]. Eur J Pharmacol,2013,721(1):133-140.

[12] Wagner A, Bock CT, Fechner H, et al. Application of modified antisense oligonucleotides and siRNAs as antiviral drugs[J]. Future Med Chem, 2015,7(13):1637-1642.

[13] Prakash TP, Lima WF, Murray HM, et al. Lipid nanoparticles improve activity of single-stranded siRNA and gapmer antisense oligonucleotides in animals[J]. ACS Chem Biol, 2013,8(7):1402-1406.

[14] Bolduc V, Zou Y, Lindow M, et al. GP 216: Allele-specific silencing of a dominant-negative mutation using siRNA or LNA antisense oligonucleotides alleviates the phenotype of a cellular model of Ullrich congenital muscular dystrophy[J]. Neurom Dis,2014,24(9):881-882.

[15] Lima WF, De Hoyos CL, Liang X, et al. RNA cleavage products generated by antisense oligonucleotides and siRNAs are processed by the RNA surveillance machinery[J]. Nucleic Acids Res, 2016,44(7):3351-3363.

[16] Jarver P, Coursindel T, Andaloussi SEL, et al. Peptide-mediated cell and in vivo delivery of antisense oligonucleotides and siRNA[J]. Mol Ther Nucleic Acids, 2012,1(6):e27.

Effect comparison of small interfering RNA and antisense oligonucleotide in inhibition of RhoA expression of rat hepatic stellate cells

ZHANGYufeng1,YEKunying,ZHONGDan

(1TheSecondClinicalMedicalCollegeofHenanUniversityofTraditionalChineseMedicine,Zhengzhou450002,China)

ObjectiveTo compare the effects of small interfering RNA (siRNA) and antisense oligonucleotide (ASODN) in inhibition of RhoA expression of rat hepatic stellate cells.MethodsRat hepatic stellate cell line HSC-T6 was divided into the siRNA group and ASODN group, respectively, and then each group was separately divided into subgroups A, B, C, and D. Cells in the subgroup A of the siRNA group and ASODN group were cultured normally, subgroup B was transfected with HK-A negative control plasmid, subgroup C with Rat1, and subgroup D with Rat2. After transfection for 48 h, the mRNA expression of RhoA and ColⅠin HSC-T6 cells of each group was detected by reverse-transcription polymerase chain reaction (RT-PCR), respectively; the content of hyaluronic acid (HA) and laminin (LN) in culture serum was measured by specific ELISA.ResultsThe expression of RhoA mRNA and Col I mRNA in the subgroup C of siRNA group and ASODN group was the lowest, and significant difference was found between subgroup A and subgroup C (bothP<0.05), but no significant difference was found between the rest of subgroups (allP>0.05). The mRNA expression of RhoA and Col Ⅰ in the subgroup C of the siRNA group was lower than that in the ASODN group (P<0.05). There was no significant difference in the subgroups A, B, and D between the siRNA group and ASODN group (allP>0.05). The levels of HA and LN in the supernate of subgroup C of the siRNA group and ASODN group were the lowest, and significant difference was found between subgroup A and subgroup C (bothP<0.05), but no significant difference was found between the rest of subgroups (allP>0.05). The levels of HA and LN in the supernate of subgroup C of the siRNA group were lower than those in the ASODN group (bothP<0.05). There was no significant difference in the subgroups A, B, and D between the siRNA group and ASODN group (allP>0.05).ConclusionBoth siRNA and ASODN can inhibit RhoA expression of rat HSC-T6 cells, and RNA interference mediated by Rat1 plasmids targeting RhoA can more effectively inhibit the formation of extracellular matrix HA, Col Ⅰ, and LN than that of ASODN.

small interfering RNA; antisense oligonucleotide; RhoA; hyaluronic acid; collagenⅠ; laminin; hepatic stellate cells

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.34.002

R365；Q522

A

1002-266X(2017)34-0005-04

2017-01-03)

河南省中醫藥科學研究專項課題(2014ZY02027)。

張玉峰(1969-)，男，碩士，副教授，副主任醫師，主要研究方向為消化系統疾病的中西醫治療。E-mail: zhouyihb@163.com