GPR56基因在骨肉瘤組織中的表達變化及其對骨肉瘤細胞增殖、遷移、侵襲能力的影響

夏海，楊瑜瑜，孫英華，焦兆德，張玉德

(濰坊市益都中心醫院，山東濰坊262500)

GPR56基因在骨肉瘤組織中的表達變化及其對骨肉瘤細胞增殖、遷移、侵襲能力的影響

夏海，楊瑜瑜，孫英華，焦兆德，張玉德

(濰坊市益都中心醫院，山東濰坊262500)

目的探討G蛋白偶聯受體56(GPR56)基因在骨肉瘤發生、發展中的作用。方法選取擬行手術治療的骨肉瘤患者53例，術中留取骨肉瘤組織及其癌旁正常組織，采用實時熒光定量PCR法檢測組織GPR56 mRNA相對表達量，并分析其與患者臨床病理參數的關系。將對數生長期人骨肉瘤細胞株MG-63隨機分為三組，其中siRNA-GPR56組轉染GPR56干擾序列，siRNA-對照組轉染siRNA對照序列，空白對照組不作任何處理。采用實時熒光定量PCR法檢測各組細胞GPR56 mRNA相對表達量，CCK-8法和克隆形成試驗檢測細胞增殖能力(分別以培養24、48、72、96 h的吸光度值及克隆形成率表示)，Transwell法檢測細胞遷移、侵襲能力(以遷移、侵襲細胞數表示)。結果骨肉瘤組織GPR56 mRNA相對表達量為1.86±0.14，癌旁正常組織為1.39±0.12，二者比較P<0.01。骨肉瘤組織GPR56 mRNA相對表達量與患者年齡、性別、發病部位、腫瘤直徑、組織類型、血清堿性磷酸酶水平均無關(P均>0.05)，與Enneking分期、肺部轉移、軟組織浸潤均有關(P均<0.05)。siRNA-GPR56組GPR56 mRNA相對表達量明顯低于siRNA-對照組及空白對照組(P均<0.01)。siRNA-GPR56組培養48、72、96 h吸光度值及克隆形成率、遷移細胞數、侵襲細胞數均低于siRNA-對照組及空白對照組(P<0.05或<0.01)。結論骨肉瘤組織中GPR56基因表達升高，GPR56基因可能通過影響細胞增殖、遷移和侵襲能力而參與骨肉瘤的發生與發展。

骨肉瘤；G蛋白偶聯受體56；小分子RNA干擾；細胞增殖；細胞侵襲

骨肉瘤好發于青少年，惡性程度高，易轉移和(或)復發[1]，患者5年生存率不足70%，若出現肺部轉移則預后更差[2]。研究發現，多種基因表達變化參與了骨肉瘤的復發及轉移過程[3]。G蛋白偶聯受體56(GPR56)為黏附性G蛋白偶聯受體家族成員，在細胞生長、分化、黏附及行為調控中發揮關鍵作用，與多種惡性腫瘤的發生、轉移密切相關[4，5]。本研究探討骨肉瘤組織GPR56基因表達變化及其對人骨肉瘤細胞株MG-63增殖、侵襲能力的影響，以期為骨肉瘤發生、發展機制的研究提供依據。

1 資料與方法

1.1 GPR56基因在骨肉瘤組織中的表達檢測

1.1.1 臨床資料 選取2013年2月～2017年3月于濰坊市益都中心醫院行手術切除的骨肉瘤患者53例，男31例、女22例，年齡7～45(23.6±10.7)歲；均經影像學及術后病理檢查確診，術前均未接受放、化療及免疫治療。腫瘤發生部位：軀干14例，肢體39例；腫瘤直徑：>8 cm 31例，≤8 cm 22例；組織類型：骨母細胞型25例，纖維母細胞型12例，軟骨母細胞型16例；Enneking分期：Ⅱa期11例，Ⅱb期26例，Ⅲ期16例；發生肺部轉移17例，軟組織浸潤38例，血清堿性磷酸酶升高19例。所有患者術中留取骨肉瘤組織及其癌旁正常組織(距離腫瘤邊緣>3 cm)，迅速置于液氮中，-70 ℃保存備檢。本研究通過醫院倫理委員會批準，患者及其家屬均知情同意。

1.1.2 骨肉瘤組織及其癌旁正常組織GPR56基因表達 采用實時熒光定量PCR法。取凍存的骨肉瘤及其癌旁正常組織，研磨后加入細胞裂解液，采用TRIzol總RNA提取試劑盒提取細胞總RNA。紫外分光光度計檢測總RNA純度和濃度合格后，逆轉錄為cDNA，以cDNA為模板進行PCR反應。GPR56及內參引物均由上海生工生物工程有限公司合成。引物序列：GPR56上游引物：5′-ATCAGCCAGCAGTTACAG-3′，下游引物： 5′-GAAGCAACAGCGAGTAT-G-3′，引物長度400 bp；β-actin上游引物：5′-TCCTGGCCTCACTGTCCA-3′， 下游引物：5′-GTCCGCCTAG-AAGCACTTGC-3′，引物長度548 bp。PCR反應條件：95 ℃預變性5 min，94℃變性30 s，58 ℃退火30 s，73 ℃延伸30 s，連續進行38次循環。每個樣品均設3個平行反應復孔，以β-actin為內參，采用2-ΔΔCt法計算骨肉瘤組織及其癌旁正常組織GPR56 mRNA相對表達量。

1.1.3 骨肉瘤組織GPR56基因表達與患者臨床病理參數的關系 收集患者的臨床資料，分析骨肉瘤組織GPR56 mRNA相對表達量與患者性別、年齡、發生部位、腫瘤直徑、組織類型、Enneking分期、肺部轉移、軟組織浸潤及血清堿性磷酸酶水平的關系。

1.2 GPR56基因對人骨肉瘤細胞株MG-63增殖、侵襲能力影響的觀察

1.2.1 細胞培養及分組處理 取人骨肉瘤細胞株MG-63，置于含10%胎牛血清的DMEM培養基中，37 ℃條件下置于含5% CO2的恒溫培養箱中培養。取對數生長期細胞，胰酶消化后接種于6孔板中，調整細胞密度為2×106個/孔，過夜恒溫培養。將細胞隨機分為siRNA-GPR56組、siRNA-對照組及空白對照組，siRNA-GPR56組、siRNA-對照組分別采用Lipfectamine 2000脂質體轉染試劑盒轉染GPR56干擾序列及siRNA對照序列。GPR56干擾序列：5′-AGAUUACAUCUUCUCUAUGGCAAGC-3′，siRNA對照序列：5′-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3′。空白對照組不作任何處理。各組轉染后繼續恒溫培養。

1.2.2 GPR56基因表達檢測 取各組轉染后培養48 h細胞，加入細胞裂解液進行裂解，采用實時熒光定量PCR法檢測GPR56 mRNA相對表達量，具體步驟參照1.1.2。

1.2.3 細胞增殖能力檢測 ①CCK-8法。取各組細胞，胰酶消化后收集、重懸細胞，調整細胞密度為1×105個/mL。各組取200 μL細胞懸液接種于96孔板，每組設6個平行反應復孔。分別于培養24、48、72、96 h，棄去培養基，加入100 μL無血清培養基及10 μL CCK-8溶液，以無血清培養基作為空白對照，孵育12 min后停止培養。采用酶標儀檢測450 nm波長處的吸光度(A)值[6]。②克隆形成試驗。取各組細胞，胰酶消化后收集、重懸細胞，調整細胞密度為1×104個/mL。各組取40 μL細胞懸液接種于培養皿中，常規培養14 d，將培養液棄去，4%多聚甲醛固定15 min，結晶紫染色后對接種細胞數及克隆數進行計數，以≥50個細胞記為1個克隆。克隆形成率=克隆數/接種細胞數×100%。

1.2.4 細胞遷移能力檢測 采用Transwell法。取各組轉染后培養48 h細胞，胰酶消化后，用400 μL無血清培養液制備單細胞懸液，接種于24孔板中，調整細胞密度為1×105個/孔。將各組細胞加入Transwell小室上室，取600 μL含10%胎牛血清的培養液加入小室下室，37 ℃條件下置于含5% CO2的恒溫培養箱中培養24 h。取出小室，PBS沖洗3次，4%甲醛固定15 min，結晶紫染色20 min，將小室內散落的細胞輕輕擦去。光學顯微鏡下觀察并拍照，隨機選取10個高倍視野計數遷移細胞數。

1.2.5 細胞侵襲能力檢測 采用Transwell法。取Matrigel膠50 μL，稀釋后平鋪于Transwell小室上室，4 ℃風干以備用。其余步驟同1.2.4。光學顯微鏡下觀察并拍照，隨機選取10個高倍視野計數侵襲細胞數。

2 結果

2.1 骨肉瘤組織GPR56基因表達及其與患者臨床病理參數的關系 骨肉瘤組織及其癌旁正常組織GPR56 mRNA相對表達量分別為1.86±0.14、1.39±0.12，二者比較P<0.01。骨肉瘤組織GPR56 mRNA相對表達量與患者年齡、性別、發病部位、腫瘤直徑、組織類型、血清堿性磷酸酶水平均無關(P均>0.05)，與Enneking分期、肺部轉移、軟組織浸潤均有關(P均<0.05)。見表1。

表1 骨肉瘤組織GPR56基因表達與患者臨床病理參數的關系

2.2 GPR56基因對人骨肉瘤細胞株MG-63增殖、侵襲能力的影響

2.2.1 各組GPR56基因表達比較 siRNA-GPR56組、siRNA-對照組及空白對照組GPR56 mRNA相對表達量分別為1.06±0.14、1.91±0.10、1.88±0.09，siRNA-GPR56組明顯低于siRNA-對照組及空白對照組(P均<0.01)。

2.2.2 各組細胞增殖能力比較 各組培養24 h吸光度值比較差異無統計學意義(P>0.05)，siRNA-GPR56組培養48、72、96 h A值及克隆形成率均低于siRNA-對照組及空白對照組(P均<0.01)。見表2。

表2 各組細胞增殖能力比較

注：與siRNA-對照組同時間點比較，*P<0.01；與空白對照組同時間點比較，△P<0.01。

2.2.3 各組細胞遷移、侵襲能力比較 siRNA-GPR56組遷移、侵襲細胞數均少于siRNA-對照組及空白對照組(P均<0.05)。見表3。

表3 各組遷移、侵襲細胞數比較(個

注：與siRNA-對照組比較，*P<0.05；與空白對照組比較，△P<0.05。

3 討論

骨肉瘤細胞侵襲、轉移能力強，目前尚無特效的臨床治療手段，患者預后較差，是骨科亟待解決的難題[7]。研究表明，腫瘤細胞增殖、遷移、侵襲過程是多步驟、多基因共同作用的結果[8,9]。GPR56為非典型G蛋白偶聯受體，也是一種新型的黏附受體，在細胞間及細胞-基質黏附、粘連中發揮重要作用[10]。研究發現，GPR56參與了多種惡性腫瘤生長及轉移過程[11,12]；敲除裸鼠GPR56基因則前列腺癌細胞的生長受到抑制[13]。本研究結果顯示，骨肉瘤組織GPR56 mRNA相對表達量高于癌旁組織，說明GPR56基因在骨肉瘤組織中呈高表達，其可能作為癌基因參與骨肉瘤的發生。本研究結果顯示，骨肉瘤組織GPR56 mRNA相對表達量與Enneking分期、肺部轉移、軟組織浸潤有關，Enneking分期為Ⅲ期、發生肺部轉移和軟組織浸潤的患者骨肉瘤組織GPR56 mRNA相對表達量顯著升高，進一步說明GPR56基因高表達可能參與了骨肉瘤的發生與發展。

為進一步探討GPR56基因對骨肉瘤細胞生物學特性的影響，本研究利用小分子RNA干擾技術特異性沉默骨肉瘤細胞中GPR56基因表達。結果顯示，與空白對照組和siRNA-對照組比較，siRNA-GPR56組細胞GPR56 mRNA相對表達量顯著降低，說明成功特異性沉默骨肉瘤細胞GPR56基因表達。本研究結果顯示，siRNA-GPR56組培養48、72、96 h A值及克隆形成率、遷移細胞數、侵襲細胞數均低于siRNA-對照組及空白對照組；說明特異性沉默骨肉瘤細胞GPR56基因表達可抑制細胞增殖、遷移及侵襲能力。分析原因，細胞黏附在腫瘤發生、轉移中發揮重要作用[14]，包括細胞間黏附和細胞-基質黏附兩種類型，前者是細胞間直接接觸，后者則是細胞與細胞外基質間的相互作用；GPR56已被證實是新型的黏附受體，可能同時在細胞間黏附和細胞-基質黏附中共同發揮重要作用[15]。

綜上所述，骨肉瘤組織GPR56基因表達升高，GPR56基因可能通過影響細胞增殖、遷移及侵襲能力而參與骨肉瘤的發生與發展。GPR56基因有望成為臨床治療骨肉瘤的一個新靶點。

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孫英華(E-mail： qzydsyh@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.32.010

R738.1

A

1002-266X(2017)32-0036-04

2017-06-13)