杜仲補腎健骨顆粒對脛骨截骨兔Ilizarov脛骨延長手術效果的影響及其機制

王金國，房經武，鄭祺，閆秀中，丁林，王雨

(1日照市中醫醫院，山東日照276800；2日照市疾病預防控制中心)

杜仲補腎健骨顆粒對脛骨截骨兔Ilizarov脛骨延長手術效果的影響及其機制

王金國1，房經武1，鄭祺2，閆秀中1，丁林1，王雨1

(1日照市中醫醫院，山東日照276800；2日照市疾病預防控制中心)

目的探討杜仲補腎健骨顆粒對脛骨截骨兔Ilizarov脛骨延長手術后骨折愈合的影響及其機制。方法將64只新西蘭大白兔隨機分為觀察組和對照組，每組32只。兩組均建立左下肢脛骨截骨模型，建模5天行Ilizarov脛骨延長術，延長速度為每天1 mm，分兩次完成，連續延長20天(共延長20 mm)。延長結束后觀察組給予杜仲補腎健骨顆粒1.6 mL/(kg·d)灌胃，1次/d，共8周；對照組給予等量生理鹽水灌胃。兩組分別于延長結束即刻(給藥前)及給藥2、4、8周隨機選取8只兔，采用ELISA法檢測血清骨鈣素水平；處死后觀察延長區骨化情況、組織形態學改變，測量骨小梁面積百分比。采用雙能X線骨密度儀檢測兩組給藥8周左下肢骨密度(BMD)。結果兩組給藥2、4、8周血清骨鈣素水平、骨小梁面積百分比均較給藥前升高，且觀察組同時間點較對照組升高更明顯(P均<0.01)。兩組給藥前延長區均未見明顯骨化，其成分均為致密結締組織，未觀察到骨組織；給藥2、4、8周，觀察組成熟骨性骨痂形成時間早于對照組，骨化情況優于對照組。觀察組及對照組左下肢BMD分別為(0.134 8±0.007 2)、(0.079 5±0.004 7)g/cm2，兩組比較P<0.05。結論杜仲補腎健骨顆粒可促進骨折愈合，提高兔Ilizarov脛骨延長術的手術效果；提高血清骨鈣素水平及BMD、促進成骨細胞活性及骨痂礦化可能是其作用機制。

脛骨骨折；Ilizarov技術；骨延長；骨愈合；杜仲補腎健骨顆粒；中藥；骨痂礦化；骨鈣素；兔

Ilizarov技術為臨床常用的骨延長技術。Ilizarov外固定支架具有空間立體結構，可從多個方向調節骨折成角及移位，具有固定牢固、軸向加壓、早期允許適當負重的特點，廣泛應用于長骨骨折不愈合、骨折畸形愈合及骨缺損等疾病的治療[1]。但Ilizarov術后骨延長1.0 mm需要1～2個月，延長5.0 mm需要6個月左右，骨折愈合緩慢，導致并發癥發生率升高[2]。中醫認為，腎虛血瘀是骨折延遲愈合的重要病機，杜仲補腎健骨顆粒具有補腎益氣、活血化瘀的作用，但是關于其是否有助于Ilizarov骨延長術后骨折愈合的研究較少[3,4]。2016年8～12月，本研究觀察了杜仲補腎健骨顆粒對兔Ilizarov脛骨延長手術效果的影響，現分析結果并探討其可能的機制。

1 材料與方法

1.1 材料 動物：健康普通級新西蘭大白兔64只，雌雄各半，1歲齡左右，體質量2.2～3.8(3.03±0.52)kg，由濰坊醫學院實驗動物中心提供。主要藥品及試劑：杜仲補腎健骨顆粒(方劑組成：杜仲、熟地、骨碎補、補骨脂、黃芪各12 g，山茱萸、枸杞子、菟絲子、淫羊藿、當歸、白芍、丹參、桃仁、紅花、牛膝各9 g)由日照中醫醫院制劑室制成，按照每10副中藥加水6 000 mL，以煎藥機煎煮20 min后去藥渣濃縮至2 500 mL，制備成每100 mL含生藥60 g的溶劑，袋裝封存備用。骨鈣素ELISA檢測試劑盒購于丹麥Osteometer Bio Tech公司。主要儀器：lizarov外固定支架購于揚州市尖新醫療器械有限公司，雙能X線骨密度儀購于企晟(上海)醫療器械有限公司。

1.2 脛骨截骨模型制備及手術方法 64只新西蘭大白兔適應性喂養1周，制備脛骨截骨模型。制備方法：術前禁食，采用1%戊巴比妥3 mg/kg靜脈麻醉。以左下肢作為手術肢，使用電鉆在脛骨結節上方處交叉鉆入2枚直徑為1.2 mm的克氏針，脛骨遠端同樣交叉鉆入2枚克氏針；分別將克氏針固定于Ilizarov外固定架的環上，調整外固定支架使其固定平行。于上、下克氏針中間取脛骨前外側縱行切口，顯露脛骨上端，撬斷腓骨下端，完全截斷脛骨。調整Ilizarov外固定支架，使脛骨骨折斷端保持解剖復位，縫合骨膜，關閉切口。術后常規應用抗生素，刀口及針道采用安爾碘濕敷抗感染。 制模后采用隨機數字表法將64只模型兔分為觀察組和對照組，每組32只。兩組均于建模5 天行Ilizarov脛骨延長術[5]，延長速度為每天1 mm，分兩次完成，連續延長20天(共延長20 mm)。延長結束后固定。

1.3 杜仲補腎健骨顆粒干預 手術結束時觀察組給予杜仲補腎健骨顆粒1.6 mL/(kg·d)灌胃，1次/d，共8周(根據Meeh-Rubner公式按照體表面積計算給藥劑量)；對照組給予等量生理鹽水灌胃，1次/d，共8周。

1.4 相關指標觀察 ①血清骨鈣素水平：兩組分別于延長結束即刻(給藥前)及給藥2、4、8周時隨機選取8只兔，空腹12 h后心臟穿刺取血2 mL，離心后分離血清，采用ELISA法檢測血清骨鈣素水平，嚴格按照試劑盒說明書操作。②延長區骨化情況、組織形態學改變及骨小梁面積百分比：血清骨鈣素水平檢測完成后采用頸動脈放血法將隨機選出的8只兔處死，取出左下肢脛骨，對延長區組織常規進行石蠟包埋、切片、固定及HE染色，50倍顯微鏡下觀察組織形態學改變，采用IPP Mediaplayer形態計量軟件測量骨小梁面積百分比。③骨密度(BMD)：給藥8周處死后、分離左下肢脛骨前，采用雙能X線骨密度儀檢測兩組左下肢BMD。

2 結果

2.1 兩組血清骨鈣素水平比較 兩組給藥2、4、8周時血清骨鈣素水平均較給藥前升高，且觀察組同時間點較對照組升高更明顯(P均<0.01)。見表1。

表1 兩組血清骨鈣素水平比較

注：與同組給藥前比較，*P<0.01；與對照組同時間點比較，#P<0.01。

2.2 兩組延長區骨化情況、組織形態學改變比較 給藥前：兩組均未見明顯骨化，其成分均為致密結締組織，未觀察到骨組織。給藥2周：觀察組可見大量骨化，其成分為大量纖維性骨痂為主的類骨質；對照組可見少量骨化，其成分大部分為纖維組織，可見少量骨痂形成。給藥4周：觀察組可見完全骨化，其成分主要為成熟骨；對照組可見大量骨化，其成分主要為類骨質。給藥8周：觀察組可見完全骨化，其成分主要為成熟骨性骨痂；對照組可見完全骨化，其成分主要為纖維性骨痂和骨性骨痂，可見少量成熟骨陷窩及骨細胞。

2.3 兩組骨小梁面積百分比比較 兩組給藥2、4、8周骨小梁面積百分比均較給藥前升高，且觀察組同時間點較對照組升高更明顯(P均<0.01)。見表2。

表2 兩組骨小梁面積百分比比較

注：與同組給藥前比較，*P<0.01；與對照組同時間點比較，#P<0.01。

2.4 兩組左下肢BMD比較 觀察組左下肢BMD為(0.134 8±0.007 2)g/cm2，對照組為(0.079 5±0.004 7)g/cm2，兩組比較P<0.05。

3 討論

1969年，Ilizarov教授通過對骨和軟組織牽拉應力作用下的再生機制進行研究，提出了牽拉組織再生的生物學理論，認為在張力-應力刺激下，組織生長、細胞增殖、生物合成等功能更加旺盛[7]。根據Ilizarov原則，生物組織在持續穩定緩慢牽張過程中產生一定張力，激活組織細胞再生和活躍生長，骨和軟組織在緩慢牽拉產生的張應力作用下可發生再生和重建[8]。Ilizarov外固定支架具有空間立體結構，通過框架結構既可牢固固定，又可克服應力遮擋，在體外可通過調節螺母達到糾正側方移位、成角和旋轉畸形的目的，廣泛用于肢體畸形糾正和肢體延長[9]。但Ilizarov技術治療后存在骨愈合緩慢，術后帶架周期長，易發生感染、骨折延遲愈合等并發癥的缺點[10]。秦泗河[11]認為，在采用Ilizarov技術進行肢體延長及牽拉組織再生的過程中，促進局部組織血液循環和氧氣供應有助于骨組織再生。

中醫認為“腎主骨，生髓”，該理論居于中醫骨傷科診斷治療的核心地位；骨折多為本虛標實之證，瘀阻是病機的關鍵環節，腎虛是病理基礎，腎虛血瘀為骨折常見證型，宜補腎益氣、活血化瘀[12]。杜仲補腎健骨顆粒以杜仲補肝腎、強筋骨，熟地黃補血養陰、益精填髓，二者合用，陰陽并補，補益肝腎、壯筋健骨，共為君藥。淫羊藿補腎壯陽、祛除風濕；骨碎補溫補腎陽，強筋健骨，且能活血續傷；枸杞子滋補肝腎；山茱萸補肝養血、益腎澀精；菟絲子辛以潤燥，甘以補虛，為平補陰陽之品，補腎陽，益腎精，共為臣藥。當歸活血調經，養血補肝，與補腎之品合用共補精血；丹參、白芍養血活血，祛瘀止痛；桃仁、紅花活血祛瘀，消腫止痛；黃芪性微溫，味甘，歸脾肺經，可健脾補中，升陽舉陷，補益后天之精以滋養先天之精，且氣旺則血行，與活血藥相配，益氣活血，諸藥共為佐藥。牛膝歸肝腎經，補肝腎，強筋骨，活血利水，具有走而能補，性善下行之特點；與當歸、白芍、桃仁、紅花等活血藥相配，則引血下行，活血祛瘀；與諸補益肝腎之藥相配則能引藥歸經，既能活血祛瘀，又能補益肝腎，強筋健骨，是為使藥。全方共具補腎生骨、益肝健脾、活血通絡的作用。

本研究結果顯示，觀察組給藥2、4、8周骨化情況及組織學觀察結果均優于對照組，骨小梁面積百分比均高于對照組，說明杜仲補腎健骨顆粒可促進骨折愈合。本研究觀察組給藥8周左下肢BMD高于對照組，說明杜仲補腎健骨顆粒具有提高BMD、促進骨痂礦化的作用。骨鈣素為成骨細胞分化時分泌的非膠原蛋白質，是成骨細胞特異性產物，又稱骨鈣蛋白，可準確反映成骨細胞活性。骨鈣素可參與體內鈣調節，促進骨生成過程中基質鈣化，加速骨痂礦化，促進骨折愈合[13]。本研究結果顯示，兩組給藥2、4、8周時血清骨鈣素水平均較給藥前升高，且觀察組同時間點較對照組升高更明顯，說明提高血清骨鈣素水平以促進骨痂礦化可能是杜仲補腎健骨顆粒促進骨折愈合的重要作用機制之一。

綜上所述，杜仲補腎健骨顆粒可促進骨折愈合，提高兔Ilizarov脛骨延長術的手術效果；提高血清骨鈣素水平及BMD、促進成骨細胞活性及骨痂礦化可能是其作用機制。

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