食管鱗癌組織miR-106b、Smad7表達變化及其與患者臨床病理特征和預后的關系

韓東，杜煒，劉東海，林慶祿

(1 單縣中心醫院，山東菏澤274300；2 濟寧市第一人民醫院；3 中國人民解放軍第88醫院)

食管鱗癌組織miR-106b、Smad7表達變化及其與患者臨床病理特征和預后的關系

韓東1，杜煒1，劉東海2，林慶祿3

(1 單縣中心醫院，山東菏澤274300；2 濟寧市第一人民醫院；3 中國人民解放軍第88醫院)

目的探討組織微小RNA-106b (miR-106b)、信號轉導分子7(Smad7)在食管鱗癌發生、發展中的作用。方法選擇食管鱗癌組織及其配對的癌旁正常組織各97例份。采用qRT-PCR法檢測食管鱗癌組織及癌旁正常組織miR-106b、Smad7 mRNA表達，分析二者的關系及其與患者臨床病理參數和預后的關系。結果食管鱗癌組織miR-106b相對表達量高于癌旁正常組織，Smad7 mRNA相對表達量低于癌旁正常組織(P均<0.05)。相關性分析顯示，食管鱗癌組織miR-106b與Smad7表達呈負相關(r=-0.778，P<0.05)。miR-106b、Smad7表達與食管鱗癌患者臨床分期、組織分化程度、淋巴結轉移均有關(P均<0.05)，與性別、年齡、腫瘤直徑及浸潤深度均無關(P均>0.05)。生存分析顯示，miR-106b高表達、Smad7低表達患者預后較差(P均<0.05)。結論miR-106b、Smad7異常表達與食管鱗癌的發生、發展及預后有關，Smad7可能是miR-106b的負性調控靶基因。

食管腫瘤；鱗狀細胞癌；微小RNA-106b；信號轉導分子7

食管癌是臨床常見的惡性腫瘤之一，在我國以食管鱗狀細胞癌(以下稱食管鱗癌)為主[1]。目前，食管癌的治療主要是以手術、化療、放療等為主的綜合治療，雖然已經取得了長足的進步，但患者預后仍然較差[2]，絕大多數患者死于腫瘤的復發與遠處轉移。近年來，分子靶向治療在惡性腫瘤的治療中取得了一定成果，但迄今為止尚無對食管癌有效的靶向藥物。信號轉導分子7(Smad7)是抑制性信號轉導分子(Smad)蛋白，可抑制轉化生長因子β(TGF-β)/Smad信號通路介導的生物學效應，在細胞和組織生長發育過程中具有重要作用[3]，其異常表達可能參與多種惡性腫瘤的發生、發展。近年研究發現，Smad7與微小RNA(miRNA)關系密切[4，5]。miR-106b是miRNA家族成員之一，有研究證實，miR-106b可通過作用于Smad7調控腫瘤細胞的惡性生物學行為[6，7]。但miR-106b、Smad7在食管鱗癌組織中的表達情況目前研究甚少。本研究探討miR-106b、Smad7在食管鱗癌發生、發展中的作用。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2009年1月～2010年12月濟寧市第一人民醫院收治的食管鱗癌患者97例。所有患者行食管癌根治術，術后組織病理檢查明確診斷，臨床資料及術后隨訪資料完整。排除術前接受過任何抗腫瘤治療者或合并有其他器官惡性腫瘤者。其中，男70例、女27例，年齡(64.11±4.59)歲，腫瘤直徑：≥5 cm 46例、<5 cm 51例，臨床分期：Ⅰ期4例、Ⅱ期50例、Ⅲ期43例；組織分化程度：低分化40例、中高分化57例；浸潤深度：黏膜或黏膜下層9例、肌層或外膜88例；有淋巴結轉移35例，無淋巴結轉移62例。本研究經濟寧市第一人民醫院倫理委員會批準，患者及家屬均知情同意。

1.2 食管鱗癌組織及其癌旁正常組織miR-106b、Smad7 mRNA表達檢測 采用qRT-PCR法。取食管鱗癌患者術后癌組織及其配對的癌旁正常組織(距腫瘤邊緣3～5 cm)石蠟包埋標本，按照RNeasy石蠟包埋組織RNA提取試劑盒說明書提取組織總RNA，紫外分光光度計檢測總RNA濃度和純度，A260/A280為1.9～2.1。根據RNA逆轉錄試劑盒說明書逆轉錄為cDNA，然后進行PCR擴增。PCR引物序列：miR-106b上游引物：5′-TTTTCGCCCTTAGC-GTGAAGA-3′，下游引物： 5′-GAGGCAGTCGAAGCT-CTCG-3′；內參U6上游引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物： 5′-AACGCTTCACGAATTTGCG-T-3′；Smad7上游引物：5′-TGAGGGUGACCCAATUG-TTTAG-3′，下游引物：5′-GACAGUUUATGTUGTTGGT-3′；內參GAPDH上游引物： 5′-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3′，下游引物：5′-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3′。PCR反應體系共15 μL：cDNA 1 μL，上下游引物各0.5 μL、Ultra SYBR Mixture 7.5 μL，DEPC水5.5 μL；反應條件：95 ℃、10 min，95 ℃、15 s，60 ℃、60 s，共40個循環。分別以U6、GAPDH為內參，采用2-ΔΔCt法計算miR-106b、Smad7 mRNA相對表達量。實驗重復3次，取平均值。分析miR-106b與Smad7表達的關系及其與患者臨床病理參數的關系。

1.3 預后情況 所有患者術后接受隨訪，隨訪截至2016年12月。以手術日開始至末次隨訪時間計算生存時間，研究結束、失訪及其他原因死亡作為終點事件。以食管鱗癌組織miR-106b、Smad7 mRNA相對表達量的均值為臨界值，采用Kaplan-Meier法分析miR-106b、Smad7高表達及低表達者的預后情況。

2 結果

2.1 食管鱗癌組織及其癌旁正常組織miR-106b、Smad7 mRNA表達比較 食管鱗癌組織miR-106b、Smad7 mRNA相對表達量分別為3.98±0.15、0.28±0.09，癌旁正常組織分別為1.02±0.03、1.03±0.02，二者比較P均<0.05。

2.2 食管鱗癌組織miR-106b與Smad7表達的關系 食管鱗癌組織miR-106b相對表達量與Smad7 mRNA相對表達量呈負相關(r=-0.778，P<0.05)。

2.3 miR-106b、Smad7表達與食管鱗癌患者臨床病理參數的關系 見表1。

2.4 miR-106b、Smad7表達與食管鱗癌患者預后的關系 97例患者中miR-106b高表達55例、低表達42例，Smad7高表達40例、低表達57例。Kaplan-Meier生存分析顯示，miR-106b高表達、Smad7低表達患者預后較差(P均<0.05)。

3 討論

miRNA是一組高度保守的非編碼單鏈小RNA分子，長度為18～25個核苷酸,可特異性與下游靶基因mRNA的3′-UTR區結合，調節靶基因表達，參與機體炎癥反應、免疫應答及細胞增殖、凋亡等生理及病理過程[8,9]。已有研究證實，食管鱗癌的發生、發展與某些miRNA關系密切[10,11]。miR-106b是miR-106b～25基因簇家族成員之一，其定位于人染色體7q22，在多種惡性腫瘤中具有癌基因作用，如肝癌、胃癌、喉癌等[12～14]。Smad蛋白家族是TGF-β信號通路途徑中的中心轉導物質[15]，而TGF-β信號通路是EMT中最關鍵的信號通路[16]。Smad7是Smads家族的主要成員之一，是TGF-β/Smad信號通路負性調控的主要承擔者，與多種惡性腫瘤的發生密切相關[4,5,17,18]。Salot等[19]研究發現，提高TGF-β通路的關鍵負性調控因子Smad7的表達能夠明顯抑制乳腺癌的浸潤和轉移。但目前miR-106b、Smad7在食管鱗癌組織中表達的研究甚少。

表1 miR-106b、Smad7表達與食管鱗癌患者臨床病理參數的關系

注：miR-106b、Smad7表達與食管鱗癌患者臨床分期、組織分化程度、淋巴結轉移有關(P均<0.05)，與患者性別、年齡、腫瘤直徑及浸潤深度無關(P均>0.05)。

本研究結果顯示，食管鱗癌組織miR-106b相對表達量均高于癌旁正常組織，與Xiao等[20]研究結果一致； 進一步分析發現，miR-106b表達與患者臨床分期、組織分化程度、淋巴轉移有關。提示miR-106b與食管鱗癌的發生、發展及轉移可能有關。miR-106b參與腫瘤的發生、發展涉及多個信號通路。有研究證實，miR-106b在乳腺癌中可通過SIX1抑制Smad7，從而激活下游TGF-β通路，導致上皮細胞間質轉化的發生，促進腫瘤發展[7]。Yu等[6]研究證實，胃癌組織中miR-106b表達與Smad7表達呈負相關關系，共同參與胃癌的發生、發展和轉移。目前，關于食管癌組織miR-106b與Smad7表達的關系尚不明確。本研究結果顯示，食管鱗癌組織miR-106b與Smad7表達呈負相關關系；進一步分析發現，Smad7表達與患者臨床分期、組織分化程度、淋巴轉移有關。提示miR-106b與Smad7共同參與了食管鱗癌的發生、發展和轉移；miR-106b有可能通過負性調控Smad7在食管鱗癌的發生、發展中起調節作用，有可能成為食管鱗癌發生、發展的分子標志物及可能的基因治療靶點。

有研究發現，miR-106b高表達的乳腺癌、肝癌等患者生存時間較短，預后較差[21，22]；Smad7低表達的前列腺癌患者生存時間較短，預后較差[23]。本研究結果顯示，miR-106b高表達、Smad7低表達者預后較差。提示miR-106b、Smad7表達與惡性腫瘤患者的預后有關，可作為預測食管鱗癌患者預后的相關指標。

綜上所述，食管鱗癌組織中miR-106b高表達、Smad7低表達，二者呈負相關關系；miR-106b、Smad7表達與食管鱗癌組織分化程度、臨床分期、淋巴轉移及預后密切相關；二者可能共同參與食管鱗癌的發生、發展及轉移，Smad7可能是miR-106b的負性調控靶基因。

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林慶祿(E-mail: lin_1011peony@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.32.032

R571

B

1002-266X(2017)32-0095-03

2017-02-12)