建立基于脫氧次黃嘌呤核苷修飾等位基因PCR方法檢測EGFR基因熱點突變*

楊永輝，李輝，朱桂云，李秀武，陳寧，任雪飛

[河北省胸科醫院（河北省肺癌防治研究中心），河北 石家莊 050041]

建立基于脫氧次黃嘌呤核苷修飾等位基因PCR方法檢測EGFR基因熱點突變*

楊永輝，李輝，朱桂云，李秀武，陳寧，任雪飛

[河北省胸科醫院（河北省肺癌防治研究中心），河北 石家莊 050041]

目的建立基于脫氧次黃嘌呤修飾等位基因特異熒光聚合酶鏈反應（dI-AS-PCR）方法，檢測表皮生長因子受體（EGFR）基因熱點突變L858R和19del（2235～2249，2236～2250）。方法設計包含擴增EGFR基因L858R和19del熱點突變在內的特異性引物、熒光探針和內參體系；且特異檢測基因突變的等位基因PCR引物3’-末端n-1或n-2位置采用脫氧次黃嘌呤（dI）修飾。建立標準品和質控樣品，應用熒光PCR檢測，并分析結果。結果dI-AS-PCR能夠在野生型背景下檢測低于0.1%的突變，對50例肺癌臨床樣本進行檢測，有9例（18%）EGFR基因發生L858R突變，14（28%）例19del基因突變。EGFR基因熱點突變率為46%，其檢測結果與DNA測序完全一致。結論基于dI-AS-PCR技術的特異熒光PCR檢測EGFR基因熱點突變，敏感性高，特異性強，可以應用于臨床EGFR基因突變檢測，指導個性化用藥及酪氨酸激酶抑制劑（TKI）治療耐藥監測。

EGFR熱點突變；等位基因PCR；脫氧次黃嘌呤；肺癌

Abstract:ObjectiveTo establish a method to test the mutations ofEGFRgene hotspots L858R and 19 del (2235-2249,2236-2250)based on deoxyinosine-modified allele-specific PCR (dI-AS-PCR).MethodsA dI-ASPCR primer system was designed to detect the mutations ofEGFRgene hotspots(L858R and 19 del),which included specific primers modified by deoxyinosine at the n-1 or n-2 position of the primer 3'-terminal,fluorescent probe and internal control primers.Standard substance and quality control samples were built and analyzed by the dI-AS-PCR system.ResultsThe detection limit of dI-AS-PCR was less than 0.1%under the background of wild type template.The dI-AS-PCR system was used to screen 50 lung cancer samples,in which 9 samples(18%)had L858R mutation ofEGFRgene and 14 cases(28%)had 19 del mutation.The hotspot mutation rate ofEGFRgene was 46%,which was consistent with the results of DNA sequencing(P＞0.05).ConclusionsThe dI-AS-PCR is a sensitive and specific assay,which could be widely used to detectEGFRmutations,guide patient-specific treatment and monitor the drug resistance of TKI-therapy in clinic.

Keywords:EGFRgene hotspot mutation;allele specific PCR;deoxyinosine;lung cancer

肺癌是當今最常見的惡性腫瘤之一，也是高致死率的癌癥之一，其中80%～85%的患者為非小細胞肺癌（non-small cell lung cancers，NSCLC）[1-2]。《2012中國腫瘤登記年報》報道，我國癌癥發病率和死亡率分別為286/10萬和181/10萬，相當于每分鐘就有5、6個人確診為癌癥，平均每5位癌癥患者3個人死亡。在所有的腫瘤類別中，肺癌發病率和死亡率在我國高居第一，高達54/10萬和45/10萬，換句話說，每分鐘確診的6位癌癥患者中，就有一個是肺癌，死亡率極高；而且我國癌癥的發病率持續升高，2003～2009年6年間，癌癥的發病率上升一半以上（57%）[3]。

大多數肺癌患者被確診時已經是晚期，采用傳統化療方案以化學藥物實現腫瘤細胞的殺傷或抑制，在治療過程中不可避免會對正常組織和器官造成極大地損傷[4]。同時給患者帶來極大的身心痛苦，也增加了患者的醫療負擔，臨床的治療成功率以及治療后5年存活率效果并不佳[3-5]。表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）為靶點的酪氨酸激酶抑制劑（Tyrosine kinase inhibitor，TKI）在非小細胞肺癌治療中日漸突出[6-9]；TKI能特異的殺傷腫瘤細胞，效果顯著。但并非所有的患者都能從TKI治療中獲益，研究表明，攜帶EGFR基因18～21外顯子基因突變患者接受TKI治療效果顯著[10-11]。因此，TKI治療前檢測EGFR基因突變十分必要。

目前檢測EGFR基因突變方法很多，等位基因特異聚合酶鏈反應（allele specific PCR，AS-PCR）、突變擴增系統（amplification refractory mutation system，ARMS）又稱等位基因特異性擴增法（allele specific amplification，ASA）、高分辨率溶解曲線分析（high-resolution melting，HRM）和基因測序等[12-15]。本文建立基于脫氧次黃嘌呤修飾的等位基因聚合酶鏈反應（deoxyinosine modified specific allele PCR，dI-AS-PCR）方法檢測EGFR基因突變，在等位基因PCR引物3'-末端n-1或n-2位置采用脫氧次黃嘌呤（dI）修飾替代。dI為天然存在的堿基，常用于簡并性引物中，在DNA聚合酶作用下能與A、G、C和T堿基結合；但共價結合力很弱。本研究探討在等位基因PCR引物中引入dI修飾后對其檢測能力的影響，從而驗證dI-AS-PCR檢測EGFR基因熱點突變的可行性。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

dNTP（美國Promega公司），AmpliTaq Gold?DNA Polymerase（美國ABI公司），T-載體（PMD18-T Vector，日本TaKaRa公司）,DH5α（日本TakaRa公司），TB-DNA定量標準品（1×107～1×104個/ml，中山大學達安基因股份有限公司），DNA定量試劑盒（熒光法）（美國Sigma公司），人EGFR基因突變檢測試劑盒（中國雅康博生物科技有限公司），Eppendorf核酸蛋白定量儀（D30，德國Eppendorf公司），實時熒光定量聚合酶鏈反應（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）儀（LightCycler?480II qRT-PCR系統，瑞士Roche公司）。

1.2 dI-AS-PCR引物及探針設計

等位基因PCR引物和探針采用Beacon Designer 8.0設計；構建質粒引物用primer 5設計，引物探針由上海輝睿生物技術有限公司合成（見表1）。

1.3 質粒構建

選用經 DNA測序明確EGFR基因 19del（2235～2249，2236～2250）和L858R突變樣本克隆質粒。50μl PCR體系包含：50 ng DNA，1×PCR buffer，200 nmol dNTP，3 mmol Mg2+，200 nmol正反向引物（19-Seq-F/R，或21-Seq-F/R），1U AmpliTaq Gold?DNA Polymerase。PCR擴增程序為：①酶激活，95℃10 min；②擴增：95℃30 s，55℃50 s，72℃50 s，8個循環；隨后95℃50 s，72℃ 50 s擴增5個循環；最后30個循環，95℃30 s，55℃50 s，72℃50 s；③延伸，72℃延伸5 min。PCR產物經凝膠成像鑒定后經產物純化連接至T-載體中，然后經DH5α轉化、搖菌、質粒提取、酶切和測序鑒定后保存備用。

1.4 構建標準品

1.4.1 建立質粒標準品Ⅰ 質粒濃度首先應用Eppendorf核酸蛋白定量儀初步定量，計算濃度稀釋至105個/μl備用。然后使用TB-DNA定量標準品應用熒光PCR對質粒進行定量，按照熒光PCR定量濃度稀釋突變質粒為1×104、1×103、1×102、10、5、3和1個/μl建立敏感性標準品I。野生型質粒依次稀釋至1×106、4×105、1×105、4×104、1×104、4×103和1×103個/μl建立耐受標準品I備用。

1.4.2 建立質粒標準品Ⅱ 將DNA定量試劑盒中的標準品稀釋至200、100、50、30、15和10 ng/μl構建耐受標準品Ⅱ。敏感性標準品Ⅱ：10 ng/μl耐受標準品Ⅱ中分別加入1 000、100、10和5個突變質粒，即相當于1萬個野生背景下含有10%、1%、0.1%和0.05%突變。

1.4.3 測試標準品 購置的10例EGFR突變樣品來源于北京雅康博生物科技有限公司，其中19del和L858R各5例構建測試標準品。測試標準品分為3份用于測試結果的重復性。

表1 檢測EGFR熱點突變的引物和探針

1.5 qRT-PCR

50μl熒光 PCR體系：1×buffer，2.5 mmol Mg2+，250 nmol dNTP，1U DNA聚合酶，2μl DNA模板，80 nmol Ctrl-F，80 nmol Ctrl-R，60 nmol Ctrl-P及各150 nmol的EGFR突變引物和探針。熒光PCR擴增條件：95℃，10 min預變性，95℃30 s，60℃30 s，72℃25 s，循環15次；再按95℃30 s，64℃40 s，72℃20 s，循環30次，并于64℃40 s時采集熒光信號分析。

1.6 DNA測序

敏感性標準品Ⅱ DNA測序：標準品中含有突變質粒，因此采用2種方式進行測序驗證：①采用19-Seq-F/R和21-Seq-F/R測序，該方法同時可以擴增野生型DNA和突變質粒（Normal-PCR/DNA測序）；②特異擴增耐受標準品中突變質粒，采用引物19-Seq-F/Marker-Seq-R和21-Seq-F/Marker-Seq-R（Marker-PCR/DNA測序）進行擴增，產物經凝膠成像分析純化后送往上海生工生物工程股份有限公司測序。臨床樣本測試，采用 19-Seq-F/R和21-Seq-F/R引物擴增后進行測序。

1.7 臨床樣本檢測

NSCLC石蠟切片標本來自河北省胸科醫院，且經臨床、影像以及病理診斷為非小細胞肺癌患者，共50例。其中男性27例，女性23例；腺癌45例，鱗癌5例。標本使用經過患者及家屬知情同意，遵循醫院的患者隱私保密規矩并經過醫院倫理委員會批準。

1.8 統計學方法

采用SPSS 17.0統計軟件進行數據分析，結果以均數±標準差（±s）表示，采用t檢驗，P＜0.05為有差異有統計學意義。

2 結果

2.1 敏感性及耐受范圍

2.1.1 敏感性 為了方便評價dI-AS-PCR方法檢測基因突變，以EGFR基因L858R突變為研究對象，同時設計dI-AS-PCR引物（L858R-F）、AS-PCR引物（L858R-F1）和ARMS引物（L858R-F2）進行對比分析。采用敏感性標準品I測試dI-AS-PCR、AS-PCR和 ARMS，同時質粒熒光 PCR體系（PMD-18-F/R/P）作為陽性對照，PCR陰性對照為水。研究結果表明，dI修飾等位基因PCR引物敏感性與AS-PCR基本一致，可以檢測低至5個突變，對于3和1個檢測效果并不好；而ARMS的敏感性則只能檢測10個左右的突變。因此，AS-PCR引物經dI修飾后，敏感性沒有受到干擾（見圖1）。

圖1 dI-AS-PCR、AS-PCR和ARMS的敏感性

2.1.2 耐受范圍 應用耐受標準品 I評價dI-AS-PCR，40個陽性質粒作為陽性參考，進行3次重復實驗。實驗結果為：ARMS耐受性最好，可以耐受高達10萬個的野生背景；dI-AS-PCR次之，可耐受4×104個野生型背景；AS-PCR最高可以耐受4×103個野生型背景。在同一濃度（1×106、4×105和1×105）條件下，dI-AS-PCR的檢測結果（由于PC的值不同，選擇對各自重復實驗和濃度下的Ct值與PC差值進行統計學分析）與AS-PCR和ARMS檢測結果相比，差異沒有統計學意義（P＞0.05）。見表2。

2.2 閾值及檢測能力

應用dI-AS-PCR檢測DNA樣品前，需要在檢測EGFR基因突變的體系引入內參引物和探針（Ctrl-F/R/P）建立雙重熒光PCR體系。其目的：①確定是否有待檢測DNA樣品加入。②指示加入樣品DNA的濃度。運用耐受標準品Ⅱ，測試dI-AS-PCR的耐受性。結果表明，dI-AS-PCR可以耐受30 ng以上的野生型DNA的干擾。考量到核酸蛋白定量儀定量DNA的誤差，將DNA上樣的濃度標準定為10 ng。

應用 dI-AS-PCR、Normal-PCR-DNA測序、Marker-PCR-DNA測序和質粒熒光PCR（PMDPCR）方法同時檢測敏感性標準品Ⅱ，評價dI-ASPCR的檢測能力。結果表明：Normal-PCR-DNA測序方法無法檢測出敏感性標準品中含有10%以下的突變；通過Marker-PCR DNA測序再次驗證，敏感性標準品中確實含有EGFR基因突變。dI-ASPCR檢測結果與 Marker-PCR DNA測序和PMD-PCR檢測結果一致。見表3。

表2 耐受標準品I測試dI-AS-PCR

表3 多種方法檢測敏感性標準品Ⅱ

可以確定在10 ng野生型DNA干擾下，dI-ASPCR可以檢測0.05%左右的突變。因此本研究以10 ng DNA檢測樣本為上樣閾值，檢測EGFR基因突變。

2.3EGFR基因突變的穩定性

通過對構建的測試標準品的檢測明確的EGFR基因突變樣品10例，其中L858R和19del各5例，分為3等份分別交給3人應用dI-AS-PCR檢測，評價其的穩定性。結果表明，3人檢測結果一致，差異無統計學意義（P＞0.05），dI-AS-PCR體系檢測EGFR突變的穩定性良好。

2.4 臨床樣本結果

經過多方面測試，建立了dI-AS-PCR，可以用于檢測臨床樣本。隨機收集的50例臨床樣本，應用dI-AS-PCR和DNA測序方法進行比較分析，對檢測結果有出入的樣本采用EGFR基因檢測試劑盒進行確認分析。經檢測dI-AS-PCR的檢測結果與DNA測序完全一致。隨機選擇10例應用EGFR基因檢測試劑盒進行確認檢測，結果與dI-AS-PCR和DNA測序一致，差異無統計學意義（P＞0.05）。

50例臨床樣本中，23例檢測EGFR基因突變陽性，EGFR基因熱點突變率為46%；其中19del 14例（28%），L858R基因突變9例（18%）。且這23例EGFR基因突變樣本均為腺癌，5例鱗癌中未檢測出基因突變。由于樣本量的限制，本文中EGFR基因突變率并不能反映當地真實NSCLC患者的EGFR基因突變水平。

3 討論

大量的研究表明EGFR基因突變患者接受TKI治療，療效要高于野生型患者[16-19]。因此臨床已經建立基于EGFR基因突變類型的NSCLC個性化靶向治療方案，并在我國廣泛推廣。目前，提高EGFR基因突變檢測率的方法主要有2種：一是研究和開發高敏感的基因突變檢測技術；另一種是提高待檢組織腫瘤細胞的均質性，盡可能的獲得均質的腫瘤組織，但是受限于取材的影響，這點很難滿足。

因此，提高檢測方法的檢測能力是提高突變檢測率的主要手段，基于此很多基因突變的檢測方法問世，如：單分子測序、變性高效液相質譜（denaturing high performance liquid chromatography，DHPLC）[20]、基質輔助激光解析離子化-飛行時間質譜（matrix-assisted laser desorption/Ionization time of flight，MALDI-TOF）[12]等，這些方法操作復雜，檢測周期較長。雖然基因測序為EGFR基因突變檢測的“金標準”[21-22]，但是由于其敏感性低[12，23]，操作復雜[24]，國內外市場推廣的主要是基于AS-PCR或ARMS的EGFR基因突變檢測試劑盒，如scropion-ARMS、TaqMan-ARMS以及ADX-ARMS等，其敏感性可達到1%。

本文補充的一種AS-PCR引物設計方法，也可以理解為一種新的ARMS引物設計方法。AS-PCR檢測基因突變，利用Taq DNA聚合酶缺乏3’-5’校正功能，將檢測突變的堿基設計于3'-末端來檢測基因突變，由于AS-PCR需要反復優化引物濃度、Taq DNA聚合酶含量、Mg2+濃度及Tm值等。在AS-PCR引物3’-末端n-1或n-2位置人為引入錯配的ARMS得到追捧；這樣可以有效地降低野生型模板干擾，但是同時也降低了敏感性。dI是自然天然存在的堿基，與堿基A、G、C和T均能結合，結合力依次為dI∶dC＞dI∶dA＞dI∶dG＞dI∶dT。但是其與堿基共價結合能力很弱，引物中引入一定數量的dI可以有效降低PCR非特異擴增，如寡核苷酸引物（Dual Priming Oligonucleotide，DPO）系統。因此本文中，將AS-PCR引物n-1或n-2位置的堿基采用dI修飾替換。經dI修飾的AS-PCR對野生型模板的耐受及特異性有很大的提高，可以耐受104個以上的野生型模板干擾，同時敏感性又未受到干擾，可以檢測低至0.05%的基因突變；應用dI-AS-PCR和DNA測序檢測50例臨床樣本，其結果完全一致。

綜上所述，AS-PCR引物中引入dI修飾，不但可以提高引物對野生型模板的耐受，同時對引物系統檢測的敏感性無干擾。這樣拓展了AS-PCR有效檢測范圍。因此dI-AS-PCR可以應用于臨床檢測EGFR基因突變。采用dI修飾的AS-PCR引物無疑是設計等位基因PCR或ARMS檢測基因突變一個比較好的選擇。dI-AS-PCR可以推廣于臨床檢測EGFR基因突變，指導臨床個性化用藥。

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（張蕾 編輯）

Establishment of a method for detection ofEGFRgene hotspot mutations based on deoxyinosine-modified allele-specific PCR*

Yong-hui Yang,Hui Li,Gui-yun Zhu,Xiu-wu Li,Ning Chen,Xue-fei Ren
(Hebei Lung Cancer Prevention Research Center,Hebei Chest Hospital, Shijiazhuang,Hebei 050041,China)

R734

A

2016-11-28

河北省衛生和計劃生育委員會重點跟蹤項目（No：GL2014061）

朱桂云，E-mail：zgyblk@163.com

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.22.003

1005-8982（2017）22-0013-07