間接阻抗法檢測酸性罐藏食品商業(yè)無菌的研究

杜寒春，葉開富，劉紹剛，徐蟬，蘇梅清，譚學(xué)才，*

（1.廣西壯族自治區(qū)分析測試研究中心，廣西南寧530022；2.廣西民族大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，廣西高校食品安全與藥物分析化學(xué)重點實驗室，廣西南寧530008）

間接阻抗法檢測酸性罐藏食品商業(yè)無菌的研究

杜寒春1，葉開富1，劉紹剛2，徐蟬1，蘇梅清1，譚學(xué)才2，*

（1.廣西壯族自治區(qū)分析測試研究中心，廣西南寧530022；2.廣西民族大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，廣西高校食品安全與藥物分析化學(xué)重點實驗室，廣西南寧530008）

建立間接阻抗法快速檢測酸性罐藏食品商業(yè)無菌的方法。選取酸性罐藏食品中易污染的多粘芽孢桿菌、腸膜明串珠菌和異常漢遜酵母作為試驗菌株，對間接阻抗法的臨界值、適用性、靈敏度、測量持續(xù)時間及罐頭樣品取樣量等應(yīng)用條件進(jìn)行研究，并與國標(biāo)法GB 4789.26-2013《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗商業(yè)無菌檢驗》進(jìn)行比對。研究表明，建立的間接阻抗法與國標(biāo)法的檢測結(jié)果完全一致，但比常規(guī)方法縮短7 d，3 d內(nèi)即可判定樣品是否為商業(yè)無菌。

間接阻抗法；酸性罐藏食品；商業(yè)無菌

Abstract：A method for rapid detection of commercial sterility in acid canned food was established by indirect impedance method.The microorganisms which are easily contaminated in acid canned foods，such asPaenibacillus polymyxa，Leuconostoc mesenteroidesandHansenula anomalawere selected as experimental strains to study of the threshold，applicability，sensitivity，measurement duration and sample volume of canned food of the indirect impedance method.Compared with the national standard method GB 4789.26-2013＜National food safety standard Food microbiological examination：Examination of commercial sterility＞，the study showed that the testing results of the indirect impedance method were completely consistent with that of national standard method.Meanwhile，the detection time was shorter than that of conventional method of 7 days.The sample could be determined whether is commercial sterility within 3 days.

Key words：indirect impedance method；acid canned food；commercial sterility

罐藏食品是我國食品工業(yè)最重要的出口產(chǎn)品，在國際市場上幾乎處于壟斷地位[1]。在食品安全問題日益嚴(yán)峻和競爭日益激烈的今天，保證其質(zhì)量安全衛(wèi)生尤為重要。罐藏食品依據(jù)pH值的不同可分為低酸性罐藏食品和酸性罐藏食品。其中酸性罐藏食品是指殺菌后平衡pH值小于或等于4.6的罐藏食品，其商業(yè)無菌的檢驗是通過將樣品保溫觀察10 d后，再做內(nèi)容物感官檢驗、pH值測定和涂片鏡檢，以確證罐頭食品中有無微生物增殖[2]。其檢驗過程要求較長的保溫時間，此外還需要大容量的培養(yǎng)設(shè)備，顯然該方法已無法滿足現(xiàn)代食品質(zhì)量安全檢測的要求，很有必要尋找一種快速的能與傳統(tǒng)商業(yè)無菌檢驗等同效果、但更為準(zhǔn)確、快速的檢測方法。

微生物自動快速檢測系統(tǒng)BacTrac4300是基于電阻抗原理設(shè)計生產(chǎn)的一種微生物快速檢測儀，通過測量微生物代謝引起的電特性變化來測定樣品微生物含量[3]。根據(jù)測量技術(shù)原理，電阻抗法又可分為直接阻抗測量法和間接阻抗測量法。間接阻抗法是通過檢測微生物代謝產(chǎn)生的CO2引起的阻抗變化來記錄微生物活力水平。在這個過程中，微生物產(chǎn)生的CO2被電極周圍的KOH溶液吸收，生成碳酸鉀，因而增加溶液的電阻抗。因此測量信號指示的是一個負(fù)進(jìn)程，適合于檢測產(chǎn)氣芽殖微生物[3-4]。酸性罐藏食品中的腐敗菌主要有耐酸芽孢菌、非芽孢耐酸菌、酵母及霉菌[5-13]，均代謝產(chǎn)生終產(chǎn)物CO2，適合采用間接阻抗法。目前間接阻抗法已被應(yīng)用于檢測食品中的金黃色葡萄球菌、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌、植物乳桿菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希氏菌、沙門氏菌、熱帶假絲酵母和枯草芽孢桿菌等微生物[4，14-18]，而在酸性罐藏食品商業(yè)無菌快速檢測中的應(yīng)用卻鮮有報道。

擬選取酸性罐藏食品中易污染的多粘芽孢桿菌、腸膜明串珠菌和異常漢遜酵母作為試驗菌株，對間接阻抗法在酸性罐藏食品商業(yè)無菌的應(yīng)用進(jìn)行探索和研究，以期建立一種快速、靈敏、準(zhǔn)確、可靠的快速檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

多粘芽孢桿菌（CICC 22649）、腸膜明串珠菌（CICC 21861）：中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；異常漢遜酵母（GIM2.94）：廣東省微生物菌種保藏中心。

酸性肉湯、麥芽浸膏湯、營養(yǎng)瓊脂、馬鈴薯葡萄糖瓊脂、結(jié)晶紫染色液、蛋白胨緩沖液：北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；氯化鈉、含4%碘的乙醇溶液、氫氧化鉀（均為分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

微生物自動快速檢測系統(tǒng)BacTrac4300：奧地利SY-LAB公司；HVE-50全自動高壓滅菌鍋：Hirayama Manufacturing Corporation；PL602-S 電子天平、SG2 型pH計：梅特勒－托利多儀器有限公司；HH·B11電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；BCD-226STV冰箱：青島海爾股份有限公司；AESAP1068拍擊式均質(zhì)器：法國AES公司；VORTEX-GENIE 120渦旋振蕩器：美國SCIENTIFIC INDUSTRIES公司；BX51熒光顯微鏡：日本OLYMPUS公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 常規(guī)方法

按GB 4789.26-2013《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗商業(yè)無菌檢驗》[2]進(jìn)行檢驗。

1.3.2 間接阻抗法

1.3.2.1 試驗菌液的制備

取試驗菌株多粘芽孢桿菌接種于酸性肉湯培養(yǎng)基，36℃培養(yǎng)24 h；腸膜明串珠菌接種于酸性肉湯培養(yǎng)基，異常漢遜酵母接種于麥芽浸膏湯培養(yǎng)基，36℃培養(yǎng)72 h。將各培養(yǎng)物用無菌生理鹽水進(jìn)行10倍系列稀釋，備用。

1.3.2.2 開啟酸性罐藏食品并制備樣品液

參照GB 4789.26-2013《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗商業(yè)無菌檢驗》[2]中的6.1、6.2、6.4方法開啟酸性罐藏食品，液體酸性罐藏食品搖勻后可直接作為樣品液使用，固體酸性罐藏食品稱取25 g，兩者皆有時則各取12.5 g加至225 mL滅菌蛋白胨緩沖液中進(jìn)行均質(zhì)混勻得到樣品液。

1.3.2.3 臨界值的確定

在聚苯乙烯測量瓶中加入1 mL新鮮制備的0.2%KOH溶液，各取1 mL試驗菌液分別接種至裝有5 mL相應(yīng)培養(yǎng)基的內(nèi)瓶中，內(nèi)瓶完全開放，立即旋緊測量瓶，于15 min內(nèi)將其放入BacTrac4300培養(yǎng)箱中進(jìn)行檢測。各測量參數(shù)預(yù)設(shè)為培養(yǎng)溫度：36℃，測量間隔時間：10 min，測量持續(xù)時間：72 h，預(yù)熱時間：1 h，臨界值：-25%M，得到各試驗菌液測量曲線。另選取市場多種常見的酸性罐藏食品滅菌后，開啟，取1 mL樣品液接種至裝有5 mL酸性肉湯培養(yǎng)基的內(nèi)瓶中，另取1 mL樣品液接種至裝有5 mL麥芽浸膏湯培養(yǎng)基的內(nèi)瓶中，在相同條件下進(jìn)行試驗，得到陰性樣品產(chǎn)生的基線最大漂移值。

1.3.2.4 間接阻抗法的適用性及靈敏度試驗

將臨界值更改為1.3.2.3確定得到的數(shù)值-45%M，其余參數(shù)不變，取1 mL系列稀釋的各試驗菌液分別按1.3.2.3的方法進(jìn)行阻抗法檢測，記錄到達(dá)臨界值的阻抗檢測時間（Impedance Detection Time，IDT），同時將試驗菌液按GB 4789.2-2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗 菌落總數(shù)測定》[19]進(jìn)行平板菌落計數(shù)。以菌落總數(shù)的對數(shù)log（CFU）為縱坐標(biāo)，對應(yīng)的IDT值為橫坐標(biāo)，將數(shù)據(jù)輸入系統(tǒng)自帶的數(shù)據(jù)處理軟件中即可得到標(biāo)準(zhǔn)曲線和回歸方程。

1.3.2.5 酸性罐藏食品的檢測

各取3 mL被測樣品液分別接種至裝有3 mL酸性肉湯培養(yǎng)基和3 mL麥芽浸膏湯培養(yǎng)基的內(nèi)瓶中進(jìn)行檢測，各測量參數(shù)設(shè)置為：培養(yǎng)溫度：36℃，測量間隔時間：10 min，測量持續(xù)時間：72 h，預(yù)熱時間：1 h，評價類型：M2；臨界值：-45%M。

1.3.2.6 留樣

按GB 4789.26-2013《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗商業(yè)無菌檢驗》中的6.5項進(jìn)行留樣。

1.3.2.7 感官檢查和pH值測定

按GB 4789.26-2013《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗商業(yè)無菌檢驗》中的6.6、6.7項對酸性罐頭食品內(nèi)容物進(jìn)行感官檢查和pH值測定。

1.3.2.8 涂片染色鏡檢

按GB 4789.26-2013《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗商業(yè)無菌檢驗》中的6.8項對留樣內(nèi)容物和內(nèi)瓶的培養(yǎng)液進(jìn)行涂片染色鏡檢。

1.3.2.9 結(jié)果的判定

檢測結(jié)束后，當(dāng)儀器測量結(jié)果為無IDT值時，表明被測酸性罐藏食品中無微生物增殖，經(jīng)感官檢查、pH值測定、涂片染色鏡檢確證無微生物增殖現(xiàn)象時，可報告該被測酸性罐藏食品為商業(yè)無菌；當(dāng)儀器測量結(jié)果IDT＞0時，表明被測酸性罐藏食品中有微生物增殖，經(jīng)感官檢查、pH值測定、涂片染色鏡檢確證有微生物增殖現(xiàn)象時，可報告該被測酸性罐藏食品為非商業(yè)無菌。

2 結(jié)果與分析

2.1 間接阻抗法的臨界值的確定

儀器在測量過程中將生成兩種測量信號值：M值和E值。其中M值是指相對初始值的培養(yǎng)基電阻抗的相對下降百分率（%）。而E值指相對初始值的電極阻抗變化值，受培養(yǎng)基成份的影響不大。根據(jù)儀器操作手冊，間接阻抗法應(yīng)選擇M值為檢測信號值，推薦臨界值為-25%M。將試驗菌株進(jìn)行驗證試驗，得到異常漢遜酵母的測量曲線（圖1所示），多粘芽孢桿菌和腸膜明串珠菌的測量曲線與異常漢遜酵母的相似，可見菌株的M值曲線類似微生物的生長曲線，可確定以M值作為檢測信號值。

圖1 異常漢遜酵母間接阻抗法測量曲線Fig.1 Measuring curve ofHansenula anomalaby indirect impedance method

選取什錦水果罐頭、黃桃罐頭等13種酸性罐頭食品滅菌后作為陰性樣品，經(jīng)檢測各陰性樣品基線最大漂移值分別為：什錦水果罐頭、梨罐頭、水黃桃罐頭、楊梅罐頭、桔子罐頭、蜜桔罐頭、杏罐頭：-25%M；草莓罐頭、黃桃罐頭：-45%M；山楂罐頭、菠蘿罐頭、柑橘罐頭：-20%M；芒果汁罐頭：-10%M。圖2為黃桃罐頭檢測曲線，可見陰性樣品的基線最大漂移值為-45%M，因此最終確定間接阻抗法的臨界值為-45%M。

圖2 陰性樣品黃桃罐頭測量基線Fig.2 Measuring baseline of negative canned yellow peach

2.2 電阻抗法的應(yīng)用條件研究

2.2.1 電阻抗法的適用性試驗

將各試驗菌株同時進(jìn)行電阻抗法和平板計數(shù)法檢測，分別建立了標(biāo)準(zhǔn)曲線和回歸方程，如表1所示。

表1 試驗菌株的回歸方程及參數(shù)Table 1 Regression equations and parameters of experimental strains

結(jié)果表明各試驗菌株的標(biāo)準(zhǔn)曲線均具有特異性，由此說明電阻抗法對生長特性各不相同的菌株均能靈敏、準(zhǔn)確地檢測出來，具有廣泛的適用性，適用于不同種類的、污染菌來源不明確的酸性罐頭食品商業(yè)無菌的檢測。

2.2.2 電阻抗法的靈敏度試驗

將各試驗菌株的菌懸液系列稀釋，使含菌量＜5 CFU/mL，作平行重復(fù)測試，靈敏度試驗結(jié)果見表2。

表2 靈敏度試驗結(jié)果Table 2 Experimental results of sensitivity

結(jié)果如表2所示，可見試驗菌株的5個平行值間無顯著差異（P＞0.05），將IDT值分別代入回歸方程，所得到的菌落數(shù)也相符，表明在菌落數(shù)很少的情況下，電阻抗法均能很靈敏地檢測出來。

2.2.3 測量持續(xù)時間的確定

含菌量1 CFU/mL的試驗菌株的檢測時間見表3。

表3 含菌量1 CFU/mL的試驗菌株的檢測時間Table 3 Detection time of the experimental strains containing1 CFU/mL

由表3可見各試驗菌株為1 CFU/mL時的最大IDT值均未超過72 h，參考儀器操作手冊推薦的測量持續(xù)時間48 h～72 h，最終將測量持續(xù)時間確定為72 h。

2.2.4 罐頭食品取樣量的確定

由于罐頭食品含菌量低，盡可能地加大取樣量可增加試樣的含菌量，提高檢測的靈敏度，縮短檢測時間。標(biāo)準(zhǔn)用于間接法的體積是：5 mL培養(yǎng)基和1 mL樣品溶液（樣品均質(zhì)后），如果要擴(kuò)大樣品量，則要加大培養(yǎng)基的濃度，根據(jù)儀器操作手冊，可將間接阻抗法的樣品加樣量確定為3 mL樣品溶液（樣品均質(zhì)后）和3 mL雙料培養(yǎng)基。

2.3 間接阻抗法與常規(guī)方法檢測酸性罐頭食品的比對試驗

對同一生產(chǎn)批次的3罐酸性罐頭食品，取1罐用間接阻抗法進(jìn)行檢測，另1罐按GB 4789.26-2013《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗商業(yè)無菌檢驗》保溫檢測，第3罐置2℃～5℃冰箱保存作為對照，結(jié)果如表4所示。

表4 間接阻抗法與常規(guī)方法檢測酸性罐頭食品的比對試驗結(jié)果Table 4 Comparison test results of acid canned food by indirect impedance method and conventional method

間接阻抗法的檢驗結(jié)果均為未檢出，按GB4789.26-2013《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗商業(yè)無菌檢驗》進(jìn)行保溫觀察，也未見胖聽、泄漏、pH值和感官異常，涂片鏡檢確證也無微生物增殖現(xiàn)象，因此可判定15個樣品均為商業(yè)無菌。可見，間接阻抗法與常規(guī)檢測方法的結(jié)果完全一致，但比傳統(tǒng)方法縮短了7 d時間，且更為簡單、便捷。

3 結(jié)論

建立應(yīng)用間接阻抗法快速檢測酸性罐頭食品商業(yè)無菌的方法，與傳統(tǒng)方法相比，不需要大容量的保溫設(shè)備，節(jié)省了實驗室的空間，且免去了繁瑣的操作步驟，3 d內(nèi)即可完成全部檢測過程，比該方法縮短了7 d的時間，提高了檢測的效率。所采用的間接阻抗法與直接阻抗法相比，電極不接觸酸性罐頭樣品，不會被樣品腐蝕，減少了設(shè)備更換的速率；被測樣品不干擾阻抗測量，提高了檢測的準(zhǔn)確度；且可采用傳統(tǒng)培養(yǎng)基，無需購買儀器原廠的培養(yǎng)基，大大節(jié)約了成本。方法還具有廣泛的適用性，適用于不同種類的、污染菌來源不明確的酸性罐頭食品商業(yè)無菌的檢測。本方法與低酸性罐藏食品商業(yè)無菌快速檢測方法相結(jié)合[20]，形成了系統(tǒng)的電阻抗法快速檢測罐藏食品商業(yè)無菌的方法體系。體系的建立將減少罐藏食品安全衛(wèi)生檢驗檢疫的時間，加快罐頭進(jìn)出口檢驗檢疫速度，對提升檢驗檢疫機構(gòu)此項的檢驗?zāi)芰Γ泻芨叩膶嵱脙r值，有利于罐頭食品行業(yè)的發(fā)展。

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Study on Detection of Commercial Sterility in Acid Canned Food by Indirect Impedance Method

DU Han-chun1，YE Kai-fu1，LIU Shao-gang2，XU Chan1，SU Mei-qing1，TAN Xue-cai2，*
（1.Guangxi Center for Analysis and Test Research，Nanning 530022，Guangxi，China；2.School of Chemistry and Chemical Engineering of Guangxi University for Nationalities，Guangxi Colleges and Universities Key Laboratory of Food Safety and Pharmaceutical Analytical Chemistry，Nanning 530008，Guangxi，China）

2017-02-07

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.19.022

廣西自然科學(xué)基金項目（2013GXNSFBA019048）；廣西科學(xué)研究與技術(shù)開發(fā)計劃項目（桂科能14123006-24）；國家自然科學(xué)基金項目（21367004、21667005）

杜寒春（1980—），女（漢），高級工程師，碩士，研究方向：食品質(zhì)量安全與檢測。

*通信作者