面包乳桿菌（Lactobacillus panis）C-M2細菌素的分離純化及特性分析

單成俊，胡彥新，夏秀東，劉小莉，李 瑩，王 英，章建浩，周劍忠,*

面包乳桿菌（Lactobacillus panis）C-M2細菌素的分離純化及特性分析

單成俊1,2，胡彥新1,2，夏秀東2，劉小莉2，李 瑩2，王 英2，章建浩1，周劍忠1,2,*

（1.南京農業大學食品科技學院，江蘇 南京 210095；2.江蘇省農業科學院農產品加工研究所，江蘇 南京 210014）

本實驗對面包乳桿菌C-M2所產的新型細菌素進行分離純化和特性研究。通過乙酸乙酯萃取、陽離子交換層析和半制備液相三步分離純化該細菌素。最終細菌素的比活力達到5 044.96 AU/mg，純化倍數為79.8 倍，但回收率僅為0.35%。通過液相色譜-串聯質譜法分析，該細菌素的分子質量為863.52 D，氨基酸序列為MVKKTSAV，它是一種新型的Ⅱ類細菌素。該細菌素具有廣泛的抑菌譜，可以抑制革蘭氏陽性和陰性的食品腐敗菌。該細菌素對熱和pH值穩定，即使在121 ℃滅菌15 min，仍保留82.1%的抑菌活性，在pH 6條件下保留85.6%的抑菌活性。它能被多種蛋白酶失活，不能被脂肪酶和淀粉酶失活，這些結果表明該細菌素具有作為食品生物防腐劑的潛在應用價值。

面包乳桿菌；細菌素；分離純化；抑菌特性

細菌素由某些細菌在代謝過程中通過核糖體合成機制產生，是一類對親緣關系相近的乳酸菌和非乳酸菌的革蘭氏陽性細菌或革蘭氏陰性細菌具有抑菌生物活性的蛋白質或多肽，而產生菌多所產的細菌素具有免疫性[1-2]。由于細菌素能被人胃腸道分泌的蛋白酶降解，對人體無毒副作用，所以細菌素作為生物食品防腐劑比化學防腐劑更安全且天然，并且細菌素具有高效、耐高溫、無抗藥性等特點，能較好地適應工業化生產[3-5]。因此，細菌素在天然食品防腐劑、飼料添加劑、益生素及開發新藥等領域具有廣闊的應用前景。

根據細菌素的化學結構、分子質量大小和穩定性將細菌素分為四大類[6-7]：第I類nisin為代表的羊毛硫抗生素，一般為小分子（＜5 kD）且熱穩定的、含羊毛硫氨酸的多肽；第Ⅱ類是小分子、熱穩定、不含羊毛硫氨酸的多肽（＜10 kD），分為3個亞類：Ⅱa（如pediocin）、Ⅱb（如lactocin G）、Ⅱc（如lactocin B）；第Ⅲ類熱敏感的大分子蛋白（＞30 kD）；第Ⅳ類復合細菌素，除蛋白質外還包含其他化學成分(如碳水化合物、脂類等)。其中Ⅰ類和Ⅱ類細菌素作為生物防腐劑在食品工業領域應用的最為廣泛[8-9]。

到目前為止，已經發現有百余種乳酸菌素，但真正用于商業化的卻只有nisin和pediocin PA-1，其余僅限于實驗室研究[10]。主要是因為乳酸菌素的性質（抑菌譜窄、pH值敏感性、熱穩定性差）和分離純化方法等諸多因素限制了乳酸菌素的獲取及其工業化生產[11-12]。因此篩選具有廣譜、耐酸堿、熱穩定性好的乳酸菌細菌素仍然是目前的首要任務。

本研究室從發酵玉米粉中分離得到一株產廣譜細菌素的乳酸菌C-M2。本實驗主要對該乳酸菌C-M2進行16S rDNA分子鑒定、所產的細菌素進行分離純化、結構鑒定以及生物學特性的研究，以期為進一步研究該細菌素的合成調控機制研究和在食品保鮮、生物防腐提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乳酸菌C-M2（Lactobacillus panis C-M2）分離于發酵玉米粉，指示菌金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）ATCC25923和大腸桿菌（Escherichia coli）ATCC25922均保藏于江蘇省農業科學院農產品加工所食品生物工程研究室。

H2O2酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、蛋白酶K 美國Sigma公司；MRS培養基、LB培養基（配方參考文獻[13]） 北京奧博星生物技術責任有限公司；檸檬酸、檸檬酸鈉、鹽酸等均為國產分析純；乙腈、三氟乙酸和甲醇均為色譜純。

1.2 儀器與設備

UV-900 AKTA蛋白純化系統 瑞典GE公司；1525高效液相色譜 美國Waters公司；FDU-1200冷凍干燥機日本Eaely公司；3K15冷凍離心機 美國Sigma公司；SW-CJ-2G超凈工作臺、LRH-150生化培養箱 蘇州凈化設備有限公司；DSX-280B立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫療器材廠。

1.3 方法

1.3.1 菌種的活化和培養流程[14]

1.3.2 菌種的16S rDNA鑒定

參照文獻[15]進行分子鑒定。用細菌基因組提取試劑盒（Bacterial DNA Kit（200），OMEGA）提取菌株C-M2的DNA，以通用的DNA引物作為PCR的模板，反應體系為25μL（表1）。聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增條件：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共進行30個循環，最后72 ℃延伸10 min。將PCR擴增后的產物進行瓊脂糖凝膠電泳，電壓為100 V，電泳結束后用凝膠成像儀觀察條帶，將觀察到的條帶用DNA膠回收試劑盒進行切膠回收，并由上海生工生物工程股份有限公司完成測序。

表1 PCR擴增體系及用量Table 1 Composition of PCR reaction system used in this study

1.3.3 細菌素的提取

采用乙酸乙酯萃取的方法[16]提取細菌素。將發酵上清液與乙酸乙酯等體積混合置于搖床（120 r/min，2 h）,讓細菌素充分融入有機相中，隨后將混合液置于分液漏斗中靜置2 h、收集有機相（上層液體）、水相（下次液體）重復上述的操作，共萃取4 次。將4 次萃取獲得的有機相合并后在45℃旋轉蒸發除去乙酸乙酯。旋轉蒸發后獲得的細菌素粗提物用檸檬酸緩 沖液（20 mmol/L，pH 4）進行復溶。以金黃色葡萄球菌為指示菌，采用瓊脂擴散牛津杯法[17-18]測定其抑菌活性。

1.3.4 細菌素的分離純化

1.3.4.1 細菌素的SP Sepharose Fast Flow陽離子交換層析[19]

將用乙酸乙酯萃取獲得的細菌素用0.22 μm的過濾膜過濾。配制20 mmol/L、pH 4的檸檬酸緩沖液和含有1 mol/L NaCl的檸檬酸緩沖液。首先用20 mmol/L、pH 4的檸檬酸緩沖液平衡層析柱，以2.0 mL/min的流速、3 mL的上樣量、含1 mol/L NaCl的檸檬酸緩沖液進行梯度洗脫。在280 nm波長處紫外檢測收集蛋白峰。將收集的各個蛋白峰4 ℃透析脫鹽后真空冷凍干燥。以金黃色葡萄球菌為指示菌，采用瓊脂擴散牛津杯法測定其抑菌活性。1.3.4.2 半制備高效液相色譜純化[20]

取適量陽離子層析柱純化后獲得的活性峰樣品溶于5%的乙腈中（含有0.1%三氟乙酸）。色譜柱的條件設定為：平衡液A：超純水+0.1% TFA，洗脫液B：純乙腈+0.1% TFA，流速2.0 mL/min，上樣量0.1 mL，進行梯度洗脫。洗脫程序為：0～5 min，5% B；5～25 min，5%～25% B；25～35 min，25%～50% B；35～45 min，50% B；45～50 min，50%～0% B。在280 nm波長紫外檢測處收集蛋白峰，將收集的各個蛋白峰真空冷凍干燥除去乙腈。以金黃色葡萄球菌為指示菌，采用瓊脂擴散牛津杯法測定其抑菌活性。

1.3.4.3 細菌素純度的檢測

利用分析性高效液相色譜來檢測細菌素的純度是否達到95%以上。將經過半制備高效液相色譜純化后獲得的活性峰樣品溶于5%的乙腈中（含有0.1%三氟乙酸），流速為0.8 mL/min，上樣量為20 μL，按照1.3.4.2節洗脫程序進行洗脫。

1.3.5 質譜分析

采用液相色譜-串聯質譜法測定該細菌素的分子質量和氨基酸序列[21]。將通過冷凍干燥的半制備液相獲得細菌素樣品懸浮于含0.2%的甲酸的超純水中，以0.3mL/min的流速，上樣量為5μL，洗脫程序為在40min內乙腈體積分數從5%升到35%。一級質譜在正離子模式下進行m/z 300～1 800全掃描，通過DDA（dependent acquisition mode）收集數據。二級質譜采用CID（collision-induced dissociation）捕捉二級質譜中的b和y離子，通過Peaks 7.0軟件進行數據采集和分析。

1.3.6 細菌素效價的測定

面包乳桿菌細菌素效價的測定按照參考文獻[22-23]的方法，采用二倍稀釋法，將發酵上清液用pH 5.0的檸檬酸緩沖液進行二倍稀釋，以金黃色葡萄球菌為指示菌，采用瓊脂擴散牛津杯法，吸取100 μL進行抑菌實驗，用對指示菌顯示沒有抑菌圈的最高稀釋濃度定義為一個活力單位（AU），稀釋濃度的倒數就是細菌素的效價（AU/mL）。計算公式如下所示：

式中：Y為細菌素的效價/（AU/mL）；n為對指示菌顯抑菌圈的孔數；x為每孔中的細菌素液加樣體積/μL。

1.3.7 細菌素蛋白含量的測定

采用考馬斯亮藍G-250染色法[24]測定細菌素蛋白含量。

1.3.8 抑菌譜的測定

采用瓊脂擴散牛津杯法，將經過SP Sepharose Fast Flow陽離子交換層析純化后獲得的細菌素用于測定面包乳桿菌C-M2的抑菌譜。

1.3.9 細菌素對溫度、pH值、蛋白酶敏感性的測定

將經過SP Sepharose Fast Flow陽離子交換層析純化后獲得的細菌素分別置于37、60、80、100 ℃水浴鍋中水浴30 min和121 ℃處理15 min，考察不同溫度對細菌素抑菌活性的影響。

將經過SP Sepharose Fast Flow陽離子交換層析純化后獲得的細菌素分別溶于pH 2～5的檸檬酸緩沖液（20 mmol/L）和 pH 6～9 的磷酸緩沖液（20 mmol/L），然后置于37 ℃水浴鍋中4 h后，測定其殘留活性。考察不同的pH值對細菌素抑菌活性的影響。

將經過SP Sepharose Fast Flow陽離子交換層析純化后獲得的細菌素分別溶于各種酶的最適pH值的緩沖液中。按質量濃度1 mg/mL分別加入蛋白酶K（20 mmol/L的磷酸鹽緩沖液，pH 7）、胃蛋白酶（20 mmol/L的醋酸鹽緩沖液，pH 2）、胰蛋白酶（20 mmol/L的磷酸鹽緩沖液，pH 7）、木瓜蛋白酶（20 mmol/L的磷酸鹽緩沖液，pH 7）、脂肪酶（20 mmol/L的磷酸鹽緩沖液，pH 7）、α-淀粉酶和β-淀粉酶（20 mmol/L的磷酸鹽緩沖液，pH 6），在37 ℃水浴2 h后，將上述酶處理過的細菌素溶液于100 ℃水浴5 min使酶失活。考察不同種類的酶對細菌素抑菌活性的影響。上述經過各種處理后的細菌素溶液采用瓊脂擴散牛津杯法測定其抑菌活性，其中以金黃色葡萄球菌為指示菌，以未做任何處理的細菌素溶液作為空白對照。

1.4 數據分析

每組實驗重復3 次，數據的結果表示為 ±s。采用SAS 8.0軟件進行單因素方差分析和差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 乳酸菌菌種的鑒定

圖1 16S rDNA PCR擴增產物Fig. 1 Agarose gel electrophoresis of PCR-amplifi ed 16S rDNA

用1.0%的瓊脂糖凝膠對菌株C-M2的16S rDNA產物進行電泳，在1 500 bp附近獲得一條熒光條帶（圖1），回收的DNA片段經測序后，共獲得1 485 個堿基，將該序列通過NCBI中BLAST進行同源性分析，發現該菌與面包乳桿菌Lactobacillus panis strain C17（基因登錄號：EF412978.1）同源性高達99%，因此可以把該菌鑒定為面包乳桿菌。

2.2 細菌素的分離純化

表2 細菌素的分離純化Table 2 Summary of purifi cation steps of the bacteriocin

圖2 細菌素的SP Sepharose Fast Flow陽離子交換層析圖譜Fig. 2 Ion-exchange chromatography of the bacteriocin on SP Sepharose fast fl ow column

由于大多數乳酸菌細菌素帶正電并且在酸性條件下穩定，本實驗經過乙酸乙酯粗提的細菌素由SP Sepharose Fast Flow陽離子交換樹脂分離后得到3個洗脫峰（圖2），S2和S3兩個洗脫峰相連，分離度很差，對金黃色葡萄球菌的抑制能力很差，故本實驗不對此洗脫條件進行進一步的優化。而S1洗脫峰較窄且高、分離度較好，能與其他雜質蛋白分開。并且S1洗脫峰對金黃色葡萄球菌的抑菌活性最好，故選擇S1洗脫峰做下一步的純化工作。經過乙酸乙酯萃取和陽離子交換樹脂分離純化后，細菌素的比活力達到3 515.03 AU/mg，純化倍數為55.6倍，回收率為3.19%（表2）。由于該細菌素可以被陽離子交換樹脂吸附，說明該細菌素是一種帶正電的多肽[25]。

圖3 lactocin C--MM2的半制備高效液相色譜圖Fig. 3 Semi-preparative HPLC chromatrogram of the bacteriocin

反相高效液相色譜是根據分子疏水性的不同來達到分離抗菌肽的目的，具有靈敏度高、速度快、分辨率好，并且經反相高效液相色譜分離得到的樣品可以直接進行質譜分析[26]。本實驗將經過陽離子純化后獲得的活性峰S1合并后用節流分子質量為500 D透析袋透析除鹽、真空濃縮后通過半制備液相進行分離純化后得到4 個洗脫峰（圖3），將4個洗脫峰合并、凍干后測定其活性，結果顯示H2洗脫峰對金黃色葡萄球菌的抑菌活性最好。經過分析液相分析H2，在9.5 min左右出現一個單峰（圖4），在其他時間沒有出現明顯的吸收峰，表明該樣品已為色譜純，并將該細菌素命名為lacocin C-M2。經過半制備液相純化后的細菌素比活力達到5 044.96 AU/mg，純化倍數為79.8 倍。

圖4 lactocin C--MM2的反相高效液相色譜圖Fig. 4 Analytical RP-HPLC chromatogram of the bacteriocin

在純化的過程中發現，最終該細菌素的回收率非常低，僅有0.35%，回收率低主要的原因是該細菌素的提取采用有機溶劑乙酸乙酯萃取的方法，由于乙酸乙酯的極性較正丁醇小，采用該方法致使一部分細菌素殘留在發酵的上清液中導致提取率大幅降低，雖可以通過重復提取實驗提高回收率，但前期實驗發現隨著提取重復次數的增加，提取效率也在逐漸降低，為了降低工作量和實驗成本，本實驗只提取了4 次，導致回收率降低。又由于乙酸乙酯較正丁醇更容易從細菌素的混合液中除去且獲得細菌素純度較高，故本實驗采用乙酸乙酯萃取該細菌素。另外一個原因是通過陽離子交換樹脂純化，陽離子樹脂具有高度的選擇性，而細菌素在不同的pH值緩沖液中可能帶正電荷或負電荷以及所帶電荷的數量不同，并且現在發現的可以產細菌素的乳酸菌，一般可以產生多種細菌素，不同的細菌素在同一pH值條件下所帶電荷不同，而在實驗過程中只會針對其中的一種細菌素進行分離純化，導致部分細菌素不能吸附在陽離子柱上，除此之外，離子交換柱在純化的過程中還可以除去很大一部分不帶電的雜蛋白，進而使回收率很低。后期可以通過優化面包乳桿菌C-M2產細菌素的發酵條件和純化過程（比如找更合適提取該細菌素的有機溶劑）來提高該細菌素最終的回收率。除此之外，來源于半制備液相分離的組分H3也可以抑制金黃色葡萄球菌的生長，說明面包乳桿菌C-M2可以產生多種細菌素，這大大地增加了其開發和應用價值。相類似的結果也出現在其他產細菌素的乳酸菌中，例如Izquierdo等[27]從軟奶酪中分離的Enterococcus faecium WHE81、Yi Lanhua等[28]從江水白菜中分離的Lactobacillus coryniformis XN8都可以產生至少兩種細菌素。

2.3 質譜分析

經過高效液相色譜檢測后具有抑菌活性的細菌素樣品進行質譜分析，得到一級質譜圖（未列出），顯示該細菌素的分子質量為863.52 D。對863.52 D的峰進行高效液相色譜-串聯質譜分析，得到二級質譜圖（圖4）。通過Peaks 7.0軟件對該細菌素的二級質譜片段進行分析得出該細菌素的氨基酸序列為MVKKTSAV。序列的推斷過程見表3。將該細菌素的氨基酸序列在NCBI（National Center for Biotechnology Information）進行比對，未找到與該細菌素完全一樣的序列，說明該細菌素是一種新型的細菌素。

圖5 細菌素的二級質譜圖Fig. 5 Tandem mass spectrum of the bacteriocin

表3 細菌素氨基酸序列的推斷Table 3 Predicted b-ion and y-ion fragments and sequence of the bacteriioocciinn

2.4 lactocin C-M2的抑菌譜

由表4可知，lactocin C-M2和大多數的乳酸菌細菌素具有相類似的特性，對與它們親緣關系較近的乳酸菌具有抑制作用[29]，例如戊糖片球菌、植物乳桿菌、短乳桿菌、瑞士乳桿菌、發酵乳桿菌。同時lactocin C-M2還可以抑制常見的致病菌和腐敗菌，如金黃色葡萄球菌、志賀菌、枯草芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌、單核細胞性李斯特菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌和沙門菌,可廣泛應用于食品的防腐殺菌處理。尤其lactocin C-M2可以抑制單核細胞性李斯特菌的生長，說明lactocin C-M2具有Ⅱ類細菌素的特性。但是lactocin C-M2對供試的酵母菌和霉菌沒有抑制作用。

表4 細菌素的抑菌譜Table 4 Antimicrobial spectrum of the bacteriocin

2.5 lactocin C-M2對溫度、pH值、蛋白酶敏感性

表5 細菌素對溫度、pH值、酶的敏感性Table 5 Effects of heat, pH and enzymes on antibacterial activity of the bacteriocin

由表5可知，lactocin C-M2經過各種蛋白酶處理后抑菌活性完全消失，但是該細菌素經脂肪酶和淀粉酶處理后抑菌活性基本保持不變，說明lactocin C-M2是蛋白類抑菌物質，并且可以被蛋白酶降解而不會在體內殘留，可以安全地應用到食品的防腐方面。

lactocin C-M2在酸性條件下（pH 2～6）抑菌活性比較穩定，在pH 6的條件下，該細菌素仍保留85.6%的抑菌活性。但lactocin C-M2在堿性條件下抑菌活性喪失比較明顯，在pH 9的條件下，該細菌素只有初始抑菌活性的40%。結果顯示lactocin C-M2在酸性條件下抑菌活性升高，而在堿性條件下抑菌活性降低。這可能是有由于在極端pH值條件下，在強的分子內靜電相互作用下誘導氨基和羧基基團的解離，終導致蛋白質變性，從而使該細菌素的活性降低[30]。

lactocin C-M2在37、60、80、100 ℃條件下處理30 min后，抑菌活性保持在90%以上。即使在121 ℃滅菌15 min后，抑菌活性仍保留82.1%。說明細菌素lactocinC-M2具有良好的熱穩定性。由于延長食品保質期通常會采取加熱或者創造酸性、堿性環境的方法，以達到殺死或抑制腐敗微生物，而細菌素lactocin C-M2具有良好的穩定性和耐酸堿性，該優勢使得它在食品加工和食品的生物保鮮中均具有廣泛的應用前景。由于lactocin C-M2具有小分子質量、熱穩定、不含羊毛硫氨酸、可以抑制單核細胞性李斯特菌的生長等特點，因此lactocin C-M2屬于Ⅱ類細菌素。

3 討 論

目前，16S rDNA序列是編碼核糖體RNA小亞基16S rRNA的基因，是當今細菌分類學中最常用且有效的分子分析方法。本實驗中利用16S rDNA基因序列對從發酵玉米粉分離出來的一株產細菌素的乳酸菌C-M2進行鑒定，最終鑒定該菌為面包乳桿菌。根據目前報道，盡管已經成功的從各種材料中分離出很多面包乳桿菌，其功能也各式各樣，例如Grahame[31]發現Lactobacillus panis PM1可以產1,3-丙二醇，但是這是第一次發現可以產細菌素的面包乳桿菌。

細菌素的分離純化與其特性研究密切相關。乳酸菌細菌素一般均帶有正電荷、疏水特性等特點。細菌素的初步分離方法可以采取鹽析法、有機溶劑沉淀法和pH值吸附法等，進一步純化方法有凝膠過濾層析、離子交換層析、疏水相互作用層析，精度純化一般采用反相高效液相色譜。本實驗采取乙酸乙酯萃取、陽離子交換層析和制備液相三步法成功的從菌株C-M2上清液中分理處細菌素lactocin C-M2，與張瑜[32]所分離細菌素的純化過程類似，同時也說明本實驗分離的出細菌素是小分子質量的細菌素。但細菌素最終純化倍數為79.8 倍，回收率為0.35%，說明純化過程中目的蛋白損失較大。今后應繼續對該細菌素的分離純化條件進行優化，為將來的精細純化及應用提供理論支持。將lactocin C-M2序列提交到APD數據庫（Antimicrobial Peptide Database）進行比對，只找到與其相識度為38.46%和37.5%的抗菌肽Uperin 7.1和Fusaricidin A，說明該細菌素是一種新型抗菌肽。

由于食品加工過程中對采用熱加工，所以細菌素對熱的穩定性好壞是衡量其潛在應用價值的標準。lactocin C-M2具有良好的熱穩性，即使在121 ℃滅菌15 min后，抑菌活性仍保留82.1%，其熱穩定性優于pentocin LPEM818[8]。不同的細菌素適用的pH值范圍不同，大多數在酸性環境下抑菌活性較好。但在中性或堿性條件下，抑菌活性減弱或喪失。如nisin在低pH值條件下有很強的抑菌活性，但在pH 7以上時，活性喪失。而lactocin C-M2在pH 9的條件下仍保留40.34%的抑菌活性，但該細菌素耐酸堿性不及步氏乳桿菌KLDS1.0364[33]所產的細菌素。同時與步氏乳桿菌KLDS1.0364所產的細菌素一樣，lactocin C-M2對供試的蛋白酶敏感，對非蛋白酶不敏感，說明其產生的類細菌素是蛋白類物質，具有較高的安全性。該細菌素對供試的大部分G+菌株和G-菌株均具有較強抑制作用，對多數致病菌和食品腐敗菌抑菌作用明顯，特別是對Listeria mouocytogeues和G-菌株較強的抑制作用，所以其具有作為食品生物防腐劑的潛在應用價值。

4 結 論

面包乳桿菌C-M2分離于發酵玉米粉，其產生的細菌素（命名為lactocin C-M2）經過乙酸乙酯萃取、陽離子交換層析和半制備液相三步成功的從菌株培養液中提取和純化出該菌所產的細菌素，最終該細菌素的比活力達到5 044.96 AU/mg，純化倍數為79.8 倍，回收率為0.35%。該細菌素的分子質量為863.52 D，氨基酸序列為MVKKTSAV，并且是一種新的Ⅱ類細菌素。該細菌素具有廣泛的抑菌譜，它不僅可以抑制與它親緣關系較近的乳酸菌的生長，同時它還可以抑制革蘭氏陽性和陰性的致病菌。該細菌素對熱、pH值、淀粉酶和脂肪酶具有良好的穩定性，但對多種蛋白酶敏感。綜上，面包乳桿菌C-M2所產的細菌素在食品保鮮和生物防腐具有良好的應用前景。

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Purifi cation and Characterization of the Bacteriocin Produced by Lactobacillus panis C-M2

SHAN Chengjun1,2, HU Yanxin1,2, XIA Xiudong2, LIU Xiaoli2, LI Ying2, WANG Ying2, ZHANG Jianhao1, ZHOU Jianzhong1,2,*
(1. College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China;2. Research Institute of Agricultural Product Processing, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014, China)

The present study aimed to purify and characterize a novel bacteriocin produced by Lactobacil lus panis C-M2.The bacteriocin was purified through sequential ethyl acetate extraction, cation exchange chromatography and semipreparative high-performance liquid ch romatography (RP-HPLC). Finally, the specifi c activity reached 5 044.96 AU/mg and the purifi cation fold was 79.8, but the recovery was only 0.35%. The bacteriocin had a molecular mass of 863.52 D and its N-terminal sequence was MVKKTSAV as determined by LC-MS/MS, showing low similarity with other class II bacteriocins reported earlier. It showed a good stability to heat and pH and retained 82.1% of the original antibacterial activity even after exposure to 121 ℃ for 15 min and retained 85.6% of the original activity at pH 6. The bacteriocin could be totally inactivat e d after treatment with protease, but it was not sensitive to lipase or amylase. These results indicate the potential of the bacteriocin for application in food preservation.

Lactobacillus panis; bacteriocin; purifi cation; antimicrobial activity

10.7506/spkx1002-6630-201720004

R996.1

A

1002-6630（2017）20-0020-07

單成俊, 胡彥新, 夏秀東, 等. 面包乳桿菌(Lactobacillus panis) C-M2細菌素的分離純化及特性分析[J]. 食品科學, 2017,38(20): 20-26. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201720004. http://www.spkx.net.cn

SHAN Chengjun, HU Yanxin, XIA Xiudong, et al. Purification and characterization of the bacteriocin produced by Lactobacillus panis C-M2[J]. Food Science, 2017, 38(20)∶ 20-26. (in Chinese with English abstract) DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201720004. http∶//www.spkx.net.cn

2016-11-14

江蘇省水產三新工程項目（Y2015-29）

單成俊（1978—），男，博士研究生，研究方向為食品生物技術。E-mail：chengjun_shan@163.com

*通信作者：周劍忠（1965—），男，研究員，博士，研究方向為食品生物技術。E-mail：zjzluck@126.com