東北地區GLIS3基因多態性與2型糖尿病合并視網膜病變的關聯性研究

莊曉彤，陸美子，于秀玲，徐麗

（沈陽市第四人民醫院眼科 ，沈陽 110031）

東北地區GLIS3基因多態性與2型糖尿病合并視網膜病變的關聯性研究

莊曉彤，陸美子，于秀玲，徐麗

（沈陽市第四人民醫院眼科 ，沈陽 110031）

目的探討GLIS3基因多態性與中國東北地區2型糖尿病合并視網膜病變的相關性。方法采用病例對照研究方法，選取糖尿病合并視網膜病變患者（DR組）、糖尿病未合并視網膜病變患者（DNR組）、健康人群（NC組）各120例為研究對象。應用PCRRFLP方法測定GLIS3基因rs7041847與rs7034200多態的基因分型。用非條件logistic回歸計算比值比及95%置信區間。結果DR、DNR組分別與NC組比較，GLIS3基因rs7041847 多態AG、AG/GG基因型、G等位基因患者發病風險顯著增加（P ＜ 0.05），rs7034200多態CC、AC/CC基因型、C等位基因患者發病風險顯著增加（P ＜ 0.05）。結論在中國東北地區，GLIS3基因rs7041847、rs7034200是2型糖尿病的危險因素，并未發現GLIS3基因與視網膜病變的易感性相關。

2型糖尿病；視網膜病變；GLIS3基因

Abstract ObjectiveTo investigate the correlation between the polymorphisms in GLIS3 and diabetic retinopathy in patients with type 2 diabetes in Northeast China.MethodsBased on the case-control study，polymorphisms in GLIS3 were examined by PCR-RFLP in 120 cases of diabetic retinopathy in patients with type 2 diabetes （DR），120 cases of patients with type 2 diabetes without diabetic retinopathy （DNR），and 120 healthy individuals （NC）. The odds ratio （OR） and 95% confidence interval （CI） were calculated using unconditional logistic analysis.ResultsThe results demonstrated that GLIS3 rs7041847 AG，AG/GG genotype，or G allele was associated with an increased risk of DR and DNR （P ＜ 0.05）. Moreover，GLIS3 rs7034200 CC，AC/CC genotype，or C allele was associated with an increased risk of DR and DNR （P ＜ 0.05）.ConclusionIn the patients in Northeast China，the polymorphisms in GLIS3 rs7041847 and rs7034200 were correlated with type 2 diabetes mellitus，while GLIS3 may not be associated with the susceptibility to diabetic retinopathy.

Keywordstype 2 diabetes mellitus； retinopathy； GLIS3 gene

2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）是復雜的代謝紊亂綜合征，已成為危害公共健康的流行病問題，據估計其發病率占中國成年人群的11.6%。其中，肥胖、家族遺傳、運動缺乏及不良生活習慣為T2DM的主要危險因素［1-2］。糖尿病視網膜病變（diabetic retinopathy，DR）為糖尿病常見的微血管并發癥，能導致患者失明［3-4］。環境因素與遺傳因素均在糖尿病及DR的發生發展中發揮重要作用［5-6］。GLIS3基因位于人類染色體9p24.2，為鋅指蛋白家族成員之一，主要在胰腺、甲狀腺及腎臟中表達。有研究［7］表明GLIS3異常表達會增加T2DM的發病風險。另有研究［8］對美國及東亞地區T2DM人群進行全基因組關聯分析，發現GLIS3基因多態與糖尿病相關，中國東北地區此基因與DR的相關性尚未見報道。因此，本研究利用病例對照研究探討GLIS3基因多態是否與東北地區T2DM及DR患者存在關聯。

1 材料與方法

1.1 研究對象

選取2011年1月至2015年3月沈陽市第四人民醫院眼科門診及病房根據糖尿病診斷和分型標準由糖尿病專家診斷為T2DM的患者。所有患者均接受眼科專家根據DR入組標準進行的眼科檢查。根據檢查結果將患者分為糖尿病合并DR組（DR組，120例，其中男52例，女68例），糖尿病未合并DR組（DNR 組，120例，其中男56例，女64例）。選擇健康成年體檢者為對照組（NC組，120例，其中男63例，女57例）。本研究得到本院倫理委員會批準，所有研究對象均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取：抽取研究對象外周靜脈血（約3 mL），用酚氯仿法提取全血樣本的基因組DNA，紫外分光光度計測定DNA濃度后，-20 ℃保存備用。

1.2.2 多重PCR引物：根據GLIS3基因內含子多態位點附近區域序列，同時考慮接續的限制性內切酶PstⅠ的識別特性進行引物設計，由上海生工合成。rs7041847上游引物序列：5’-GGCCCCTCCTTCCCTT GACtA-3’，下游引物序列：5’-CATCTCTGAAAGACA GATTGTGACAG-3’。rs7034200上游引物序列：5’-T CCAGTTTTCACATTAATTACGCC-3’，下游引物 序列：5’-GCATTTTATCCCTTTTTTTGTTAaCtAG-3’。

1.2.3 多重PCR-RFLP及產物檢測：多重PCR是在1個20 μL的PCR反應體系中，包括1×Taq酶（日本TaKaRa公司），10 μmol/L濃度引物2 μL，50 ng的模板DNA。反應條件為94 ℃預變性1 min，94 ℃ ，30 s，50 ℃ ，30 s，72 ℃，30 s，重復35個循環；最后72 ℃ 1 min。反應結束后，將10 μL PCR產物加入含PstⅠ限制性內切酶的反應體系中孵育過夜。酶切產物進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，紫外燈下觀察電泳結果。

1.3 統計學分析

采用統計分析軟件SPSS 13.0 進行數據處理。利用t檢驗分析DR、DNR組和NC組臨床資料，采用χ2檢驗確定對照組基因型頻率是否符合Hardy-Weinberg平衡，比較基因型的組間分布頻率。采用非條件logistic回歸分析不同基因型與DR、DNR組和NC組之間的相關性。P ＜ 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 DR、DNR組和NC組的一般特征比較

DR、DNR患者及NC組間年齡分布、性別構成差異無統計學意義（P ＞ 0.05）。與NC組比較，DR及DNR組的收縮壓及舒張壓、體質量指數、吸煙史及飲酒史均有統計學差異 （P ＜ 0.05）。DR及DNR組比較，收縮及舒張壓、體質量指數、吸煙史及飲酒史等差異無統計學無意義（P ＞ 0.05）。DR組的糖尿病病程較DNR組長，差異有統計學意義（P ＜ 0.05），見表1。DR、DNR組及NC組基因型與等位基因分布顯示，rs7041847位點DR、DNR組與NC組基因頻率比較有統計學差異（P ＜ 0.05），DR與DNR組基因頻率比較無統計學差異（P ＞ 0.05）。rs7034200位點 DR、DNR組與NC組基因頻率比較有統計學差異（P ＜ 0.05），DR與DNR組基因頻率比較無統計學差異（P ＞ 0.05）。GLIS3基因rs7041847與rs7034200 NC組的基因型頻率符合Hanly-Weinberg平衡，具有群體代表性。見表2。

2.2 GLIS3基因多態性與糖尿病合并/未合并DR發病風險的相關性

如表2所示，對GLIS3基因rs7041847進行logistic回歸分析，以AA基因型或A等位基因作為對照進行危險度評價。DR組與NC組相比，rs7041847 AG、AG/GG基因型、 G等位基因患者發病風險顯著增加（均P ＜ 0.001）。同時，DNR組與NC組相比也有類似結果（均P ＜ 0.001）。

表1 3組患者臨床特征情況比較Tab.1 Comparison of clinical characteristics in the three groups

表2 GLIS3基因多態位點基因型分布頻率與糖尿病合并DR發病風險的相關性Tab.2 Genotype frequencies of the GLIS3 polymorphisms among the three groups and their association with diabetic retinopathy in patients with a risk of type 2 diabetes

對GLIS3基因rs7034200進行logistic回歸分析，以AA基因型或A等位基因作為對照進行危險度評價。DR組與NC組相比，rs7034200 CC、AC/CC基因型、C等位基因患者發病風險顯著增加（均P ＜ 0.05）。DNR組與NC組相比也有類似結果（均P ＜ 0.05），見表2。

3 討論

糖尿病患者的高血糖狀態是微血管并發癥的高危因素，DR為糖尿病最常見的并發癥之一［9］。近期研究［10］預測DR人群在2030年將增加至1.91億。DR是一個復雜過程且存在種族差異及地域差異，危險因素包括不良血糖控制、糖尿病、吸煙、炎癥反應、肥胖與高血壓。STRATTON等［11］發現不良血糖控制及糖尿病是DR的獨立危險因素。然而，關于DR的具體病理生理機制尚不十分清楚。

遺傳基因不同也影響著糖尿病及DR的發生發展，有許多學者從基因水平探索糖尿病及DR的發生機制，篩選相關基因，并從表觀遺傳學、基因組學、基因多態以及信號通路等角度分析DR的遺傳易感性［12-14］。GLIS3作為糖尿病的易感基因，最初在胰腺（主要在β細胞）中表達，其突變會引起新生兒糖尿病［15-16］。全基因組關聯分析［17］揭示GLIS3多態與1型糖尿病和T2DM在不同人種中均存在顯著關聯。

本研究發現在GLIS3位點rs7041847中，與AA基因型或A等位基因相比，AG、AG/GG基因型、G等位基因患者發病風險顯著增加；在位點rs7034200中，與AA基因型或A等位基因相比，CC、AC/CC基因型、C等位基因患者發病風險顯著增加。DR組與DNR組進行2個多態位點基因型對比分析差異無統計學意義，說明GLIS3基因的2個多態位點可能不參與DR的發生發展，因此未對DR與DNR組進行后續logistic分析。本結果表明GLIS3基因多態與東北地區T2DM相關，且rs7041847的G等位基因、rs7034200的C等位基因為遺傳高危因子。

病例對照研究也有一些不足，基于醫院的病例設計可能存在病例的內在選擇偏倚。因此，基于醫院的病例對照研究結果應在將來被基于人群的前瞻性研究進一步驗證。此外，由于這些位點的等位基因頻率相對較低，這些多態位點的潛在臨床應用也許不能實現。因此希望能夠開展設計更合理、更多大樣本、更多種族類型的相關研究，為明確糖尿病合并DR的發生發展提供思路。

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（編輯 武玉欣）

Polymorphisms in GLIS3 Associated with Diabetic Retinopathy in Patients with Type 2 Diabetes in Northeast China

ZHUANG Xiaotong，LU Meizi，YU Xiuling，XU Li

（Department of Ophthalmology，The Fourth People’s Hospital of Shenyang，Shenyang 110031，China）

R774.1

A

0258-4646（2017）10-0909-04

http://kns.cnki.net/kcms/detail/21.1227.R.20170927.1452.022.html

10.12007/j.issn.0258‐4646.2017.10.011

沈陽市科學技術計劃（F16-206-9-25）

莊曉彤（1978-），女，副主任醫師，博士.

徐麗，E-mail：xu-li1149@163.com

2017-02-12

網絡出版時間：2017-09-27 14:52