HPLC法同時測定復方魚腥草片中綠原酸、黃芩苷和槲皮素的含量Δ

邱紅梅，楊林，何丹（1.重慶醫科大學藥學院，重慶400016；.重慶醫藥高等專科學校藥學系，重慶401331）

HPLC法同時測定復方魚腥草片中綠原酸、黃芩苷和槲皮素的含量Δ

邱紅梅1＊，楊林2，何丹1#（1.重慶醫科大學藥學院，重慶400016；2.重慶醫藥高等專科學校藥學系，重慶401331）

目的：建立同時測定復方魚腥草片中綠原酸、黃芩苷和槲皮素含量的方法。方法：采用高效液相色譜法。色譜柱為GL InterSustain-C18，流動相為水-甲醇（55∶45，V/V），流速為1.0 mL/min，檢測波長為270 nm，柱溫為30 ℃，進樣量為20 μL。結果：綠原酸、黃芩苷和槲皮素的檢測質量濃度線性范圍分別為1.264～12.64 μg/mL（r＝0.999 9）、8.704～87.04 μg/mL（r＝0.999 9）、1.212～12.12 μg/mL（r＝0.999 9）；定量限分別為1.88、2.98、1.94 ng，檢測限分別為0.56、0.89、0.58 ng；精密度、穩定性、重復性試驗的RSD＜2.0%；加樣回收率分別為98.02%～101.10%（RSD＝1.01%，n＝9）、97.48%～101.70%（RSD＝1.38%，n＝9）、98.31%～101.10%（RSD＝1.02%，n＝9）。結論：該方法操作簡便，精密度、穩定性、重復性好，可用于復方魚腥草片中綠原酸、黃芩苷和槲皮素含量的同時測定。

高效液相色譜法；復方魚腥草片；綠原酸；黃芩苷；槲皮素

ABSTRACTOBJECTIVE：To establish a method for simultaneous determination of chlorogenic acid，baicalin and quercetin in Compound yuxingcao tablets.METHODS：HPLC method was adopted.The separation was performed on GL InterSustain-C18column with mobile phase consisted of water-methanol（55∶45，V/V）at the flow rate of 1.0 mL/min.The detection wavelength was set at 270 nm，and the column temperature was 30 ℃.The sample size was 20 μL.RESULTS：Linear ranges of chlorogenic acid，baicalin and quercetin were 1.264-12.64 μg/mL（r＝0.999 9），8.704-87.04 μg/mL（r＝0.999 9）and 1.212-12.12 μg/mL（r＝0.999 9），respectively.The limit of quantification were 1.88，2.98，1.94 ng，respectively.The limits of detection were 0.56，0.89，0.58 ng，respectively.RSDs of precision，stability and reproducibility tests were all lower than 2.0%.The recoveries were 98.02%-101.10%（RSD＝1.01%，n＝9），97.48%-101.70%（RSD＝1.38%，n＝9）and 98.31%-101.10%（RSD＝1.02%，n＝9），respectively.CONCLUSIONS：The established method is simple，accurate，stable and reproducible，and can be used for simultaneous determination of chlorogenic acid，baicalin and quercetin in Compound yuxingcao tablets.

KEYWORDSHPLC；Compound yuxingcao tablets；Chlorogenic acid；Baicalin；Quercetin

復方魚腥草片是由魚腥草、黃芩等5味中藥材經提取制成的口服制劑，具有清熱解毒的功效，臨床上多用于外感風熱引起的咽喉紅腫疼痛、急性咽炎、急性扁桃體炎的治療[1]。本品收載于2015年版《中國藥典》（一部），現有標準采用薄層色譜法對魚腥草、連翹苷和綠原酸進行鑒別[1]，以高效液相色譜法（HPLC）測定黃芩苷的含量，并規以黃芩苷計不得少于2.7 mg/片。魚腥草中除含揮發油成分外，還含有大量綠原酸和槲皮素[2-4]。綠原酸具有抗菌、抗病毒、降血壓和抗腫瘤等作用[5]；槲皮素屬黃酮類化合物，能顯著抑制癌細胞生長[6-7]，可抗腫瘤和抗血小板凝集[5，8]。目前，文獻報道關于復方魚腥草片中有效成分的測定有HPLC法測定桑色素和槲皮素[8]，HPLC法測定黃芩苷[9]，HPLC法測定綠原酸[10]，也有采用毛細管電泳法測定綠原酸和槲皮素[11]，但未見同時測定復方魚腥草片中綠原酸、黃芩苷和槲皮素含量的報道。本試驗采用HPLC法同時測定復方魚腥草片中綠原酸、黃芩苷和槲皮素含量，以期為復方魚腥草片的質量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器

LC-20型HPLC儀，包括二極管陣列檢測器（日本Shimadzu公司）；AG135型電子分析天平（瑞士Mett-ler-Toledo公司）；KQ-1100DE型超聲波清洗器（昆山舒美超聲儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

復方魚腥草片（李時珍醫藥集團有限公司，批號：1605002、1601001、1511004，規格：0.393 g/片）；綠原酸對照品（批號：110753-201415）、黃芩苷對照品（批號：110896-200001）、槲皮素對照品（批號：100081-201408）均購自中國食品藥品檢定研究院，純度均≥99.0%；甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純化水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：GL InterSustain-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：水-甲醇（55∶45，V/V）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：270 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：20 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液 分別精密稱取綠原酸、黃芩苷、槲皮素對照品15.33、10.88、15.15 mg，分別置于50 mL量瓶中，加水溶解并定容，得單一對照品溶液；量取上述單一對照品溶液各0.1 mL，置于同一25 mL量瓶中，加水溶解并定容，搖勻，得綠原酸、黃芩苷和槲皮素質量濃度分別為12.64、87.04、12.12 μg/mL的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取樣品20片，研缽研細，精密稱取0.4 g，置于25 mL量瓶中，加甲醇20 mL使溶解，稱定質量，超聲（功率：100 W，頻率：40 kHz）處理30 min，放至室溫（25℃），用甲醇補足減失的質量，搖勻，經0.45 μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。

2.2.3 陰性對照溶液 按復方魚腥草片處方和工藝制備缺魚腥草和黃芩的陰性樣品，并按“2.2.2”項下方法制成陰性對照溶液。

2.3 系統適用性試驗

取“2.2”項下混合對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液各適量，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜，詳見圖1。結果，理論板數以綠原酸峰計＞3 000；綠原酸、黃芩苷和槲皮素均能達到基線分離，分離度均＞2，各成分基線分離良好。

2.4 線性關系考察

分別精密量取“2.2.1”項下混合對照品溶液1、2、4、6、8、10 mL，分別置于10 mL量瓶中，加水定容，制成系列對照品溶液。精密量取上述系列對照品溶液各20 μL，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以待測成分質量濃度（x，μg/mL）為橫坐標、峰面積（y）為縱坐標進行線性回歸，得綠原酸、黃芩苷和槲皮素回歸方程分別為y＝43 567x－388（r＝0.999 9）、y＝59 992x－423（r＝0.999 9）、y＝63 934x－578（r＝0.999 9）。結果表明，綠原酸、黃芩苷和槲皮素檢測質量濃度線性范圍分別為 1.264～12.64、8.704～87.04、1.212～12.12 μg/mL。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

2.5 定量限與檢測限考察

分別精密量取“2.2.1”項下混合對照品溶液適量，倍比稀釋，并按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。當信噪比為10︰1時，得定量限；當信噪比為3︰1時，得檢測限。結果，綠原酸、黃芩苷和槲皮素的定量限分別為1.88、2.98、1.94 ng，檢測限分別為0.56、0.89、0.58 ng。

2.6 精密度試驗

取“2.2.1”項下混合對照品溶液適量，按“2.1”項下色譜條件連續進樣測定6次，記錄峰面積。結果，綠原酸、黃芩苷和槲皮素峰面積的RSD分別為1.04%、1.33%、0.95%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.7 穩定性試驗

取“2.2.2”項下供試品溶液（批號：1605002）適量，分別于室溫下放置0、2、4、6、8、10 h時按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果，綠原酸、黃芩苷和槲皮素峰面積的RSD分別為1.21%、0.98%、1.01%（n＝6），表明供試品溶液室溫放置10 h內基本穩定。

2.8 重復性試驗

精密稱取同一批樣品（批號：1605002）適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算樣品含量。結果，綠原酸、黃芩苷和槲皮素含量的平均值分別為0.452 0、4.402、0.118 4 mg/片，RSD 分別為 1.03%、0.76%、1.02%（n＝6），表明本方法重復性良好。

2.9 加樣回收率試驗

取已知含量樣品（批號：1605002）適量，共9份，分別加入低、中、高質量的待測成分對照品，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率，結果見表1。

表1 加樣回收率試驗結果（n＝9）Tab 1 Results of recovery tests（n＝9）

2.10 樣品含量測定

取3批樣品各適量，分別按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算樣品含量，結果見表2。

表2 樣品含量測定結果（n＝3，mg/片）Tab 2 Results of content determination of samples（n＝3，mg/tablet）

3 討論

2015年版《中國藥典》（一部）采用HPLC法對黃芩苷含量進行測定，流動相為甲醇、水和磷酸[1]。而本研究所建方法流動相僅需甲醇和水，不使用磷酸，更加經濟環保。

2015年版《中國藥典》（一部）中魚腥草及其飲片含量測定項下暫無相應內容[1]。本研究所建方法可以為魚腥草、魚腥草飲片以及魚腥草的相關制劑中綠原酸和槲皮素的含量測定提供參考。

綜上所述，本方法操作簡便，精密度、穩定性、重復性好，可用于復方魚腥草片中綠原酸、黃芩苷和槲皮素含量的同時測定。

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Simultaneous Determination of Chlorogenic Acid，Baicalin and Quercetin in Compound Yuxingcao Tablets by HPLC

QIU Hongmei1，YANG Lin2，HE Dan1（1.College of Pharmacy，Chongqing Medical University，Chongqing 400016，China；2.Dept.Pharmacy，Chongqing Medical and Pharmaceutical College，Chongqing 401331，China）

R917

A

1001-0408（2017）27-3846-03

2016-10-10

2016-11-11）

（編輯：張 靜）

重慶市教委科學技術研究項目（No.KJ14400208）

＊副教授。研究方向：中藥藥理學、中藥分析。E-mail：qiuhongmei@cqmu.edu.cn

#通信作者：副教授。研究方向：藥物分析。E-mail：ildoctor@163.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2017.27.28