雙波長HPLC法同時測定板柴口服液中（R，S）-告依春和綠原酸的含量Δ

華之卉，劉棟，李明春（1.鄭州人民醫(yī)院藥學(xué)部臨床藥學(xué)科，鄭州45000；2.解放軍第15中心醫(yī)院制劑室，鄭州 450042；.解放軍第401醫(yī)院藥劑科，山東青島 266071）

雙波長HPLC法同時測定板柴口服液中（R，S）-告依春和綠原酸的含量Δ

華之卉1＊，劉棟2#，李明春3（1.鄭州人民醫(yī)院藥學(xué)部臨床藥學(xué)科，鄭州450003；2.解放軍第153中心醫(yī)院制劑室，鄭州 450042；3.解放軍第401醫(yī)院藥劑科，山東青島 266071）

目的：建立同時測定板柴口服液中（R，S）-告依春和綠原酸含量的方法。方法：采用雙波長高效液相色譜法。色譜柱為Wondasil C18，流動相為乙腈-0.1%磷酸溶液（11∶89，V/V），流速為1.0 mL/min，檢測波長為245 nm[（R，S）-告依春]、327 nm（綠原酸），柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量為10 μL。結(jié)果：（R，S）-告依春和綠原酸檢測質(zhì)量濃度線性范圍分別為4.05～40.51 μg/mL（r＝0.999 9）、29.41～294.05 μg/mL（r＝0.999 9）；定量限分別為3.32、2.45 ng，檢測限分別為1.00、0.74 ng；精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)的RSD均＜1.0%；加樣回收率分別為98.46%～101.06%（RSD＝0.98%，n＝9）、98.18%～100.78%（RSD＝0.86%，n＝9）。結(jié)論：該方法操作簡便，結(jié)果準(zhǔn)確、靈敏度高、重復(fù)性好，可用于板柴口服液中（R，S）-告依春和綠原酸含量的同時測定。

板柴口服液；（R，S）-告依春；綠原酸；含量測定；雙波長高效液相色譜法

ABSTRACTOBJECTIVE：To establish a method for simultaneous determination of（R，S）-goitrin and chlorogenic acid in Banchai oral liquid.METHODS：The dual-wavelength HPLC method was adopted.The determination was performed on Wondasil C18column with mobile phase consisted of acetonitrile-0.1%phosphoric acid（11∶89，V/V）at the flow rate of 1.0 mL/min.The detection wavelengths were 245 nm for（R，S）-goitrin and 327 nm for chlorogenic acid.The column temperature was 30 ℃，and injection volume was 10 μL.RESULTS：The linear ranges were 4.05-40.51 μg/mL for（R，S）-goitrin（r＝0.999 9），29.41-294.05 μg/mL for chlorogenic acid（r＝0.999 9）.The limits of quantification were 3.32，2.45 ng，limits of detection were 1.00，0.74 ng.RSDs of precision，stability and reproducibility tests were lower than 1.0%；the recoveries were 98.46%-101.06%（RSD＝0.98%，n＝9）and 98.18%-100.78%（RSD＝0.86%，n＝9）.CONCLUSIONS：The method is simple，accurate，sensitive and reproducible，and can be used for simultaneous determination of（R，S）-goitrin and chlorogenic acid in Banchai oral liquid.

KEYWORDSBanchai oral liquid；（R，S）-goitrin；Chlorogenic acid；Content determination；Dual-wavelength HPLC

板柴口服液[批準(zhǔn)文號：總制字（2016）F403001，曾用名：復(fù)方板柴口服液]是解放軍第153中心醫(yī)院自主開發(fā)的中藥復(fù)方制劑，由板藍(lán)根、金銀花、柴胡、魚腥草、大青葉等5味中藥材加工制成，具有清熱解毒、疏散風(fēng)寒、利咽消腫之功效，適用于感冒、發(fā)熱、咽喉痛等癥的治療[1]，臨床療效確切，口碑較好，現(xiàn)已收錄于2015年版《中國人民解放軍醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑規(guī)范》（第一冊）。該制劑現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的含量測定項(xiàng)只檢測了君藥板藍(lán)根中的（R，S）-告依春[2]，但單一指標(biāo)成分測定難以反映制劑質(zhì)量的整體特征。金銀花和魚腥草為方中臣藥，二者的有效成分均為綠原酸，其具有抗菌、抗病毒、抗炎、抗腫瘤、增強(qiáng)免疫等作用[3-5]。鑒于此，本課題組采用雙波長高效液相色譜法（HPLC）建立了同時測定板柴口服液中（R，S）-告依春和綠原酸的含量，以期為完善該制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

1 材料

1.1 儀器

LC-10A型HPLC儀，包括SPD-10A型紫外檢測器、手動進(jìn)樣器、LC-solutionLite色譜工作站（日本Shimadzu公司）；BT125D型十萬分之一電子分析天平（德國Sartorius公司）。

1.2 藥品與試劑

板柴口服液（解放軍第153中心醫(yī)院自制，批號：161023、161209、170112，規(guī)格：10 mL/支）；（R，S）-告依春對照品（批號：111753-201304，純度：99.9%）、綠原酸對照品（批號：110753-201314，純度：96.6%）均購自中國食品藥品檢定研究院；乙腈為色譜純，甲醇和磷酸為分析純，水為自制重蒸水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Wondasil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-0.1%磷酸溶液（11∶89，V/V）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：245 nm[（R，S）-告依春]、327 nm（綠原酸）；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液 精密稱取（R，S）-告依春、綠原酸對照品各適量，加50%甲醇溶液，制成（R，S）-告依春、綠原酸質(zhì)量濃度分別為81.02、588.10μg/mL的混合對照品貯備液。精密量取上述混合對照品貯備液2 mL，置于10 mL棕色量瓶中，加50%甲醇溶液定容，搖勻，即得（R，S）-告依春、綠原酸質(zhì)量濃度分別為16.20、117.62μg/mL的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 精密量取樣品5 mL，置于25 mL棕色量瓶中，加50%甲醇溶液定容，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性對照溶液 按樣品的配方比例和制備工藝，分別制備缺板藍(lán)根、缺金銀花和魚腥草的陰性樣品，再按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備陰性對照溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

精密量取“2.2”項(xiàng)下混合對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液各適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜，詳見圖1。由圖1可知，在該色譜條件下，各成分均能達(dá)到基線分離，分離度＞1.5；理論板數(shù)以（R，S）-告依春峰和綠原酸峰計(jì)分別為13 387、10 876，保留時間分別為11.1、15.0 min。結(jié)果表明，其他成分對測定無干擾。

2.4 線性關(guān)系考察

精密量取“2.2.1”項(xiàng)下混合對照品貯備液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，分別置于10 mL棕色量瓶中，加50%甲醇溶液定容，搖勻，制成系列混合對照品溶液。精密量取上述系列混合對照品溶液各10 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。以（R，S）-告依春和綠原酸質(zhì)量濃度（x，μg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得（R，S）-告依春回歸方程為y＝67 928.30x－38 823.11（r＝0.999 9），綠原酸回歸方程為y＝29 509.83x－56 152.16（r＝0.999 9）。結(jié)果表明，（R，S）-告依春和綠原酸檢測質(zhì)量濃度線性范圍分別為4.05～40.51、29.41～294.05 μg/mL。

2.5 定量限（LOQ）與檢測限（LOD）考察

取“2.2.1”項(xiàng)下混合對照品溶液適量，倍比稀釋，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6次，記錄峰面積。當(dāng)信噪比為10∶1時，得LOQ；當(dāng)信噪比為3∶1時，得LOD。結(jié)果，（R，S）-告依春和綠原酸的LOQ分別為3.32、2.45 ng；（R，S）-告依春和綠原酸的 LOD 分別為1.00、0.74 ng。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

2.6 精密度試驗(yàn)

取“2.2.1”項(xiàng)下混合對照品溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果，（R，S）-告依春和綠原酸峰面積的RSD分別為0.59%、0.46%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液（批號：170112）適量，分別于室溫下放置0、2、4、8、12、24 h時按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，（R，S）-告依春和綠原酸峰面積的RSD分別為0.71%、0.78%（n＝6），表明供試品溶液在室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批樣品（批號：170112）適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計(jì)算樣品含量。結(jié)果，（R，S）-告依春和綠原酸的含量平均值分別為0.080 6、0.604 2 mg/mL，RSD分別為0.96%、0.82%（n＝6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.9 加樣回收率試驗(yàn)

精密量取已知含量的樣品（批號：170112）2.5 mL，共9份，分別置于25 mL棕色量瓶中，各加入低、中、高質(zhì)量的（R，S）-告依春和綠原酸對照品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液。取上述供試品溶液10 μL，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝9）Tab 1 Results of recovery tests（n＝9）

2.10 樣品含量測定

取3批樣品各適量，分別按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計(jì)算樣品含量，結(jié)果見表2。

表2 樣品含量測定結(jié)果（n＝3，mg/mL）Tab 2 Results of content determination of samples（n＝3，mg/mL）

3 討論

3.1 色譜條件的選擇

3.1.1 流動相的選擇 筆者考察了甲醇-磷酸溶液、乙腈-0.1%磷酸溶液作為流動相時的色譜情況[6-8]。結(jié)果，當(dāng)乙腈-0.1%磷酸溶液為流動相進(jìn)行等度洗脫時，（R，S）-告依春和綠原酸的色譜峰峰形均較好。又進(jìn)一步考察了等度洗脫下流動相的比例（7∶93、11∶89、13∶87，V/V）。結(jié)果，當(dāng)以乙腈-0.1%磷酸溶液（11∶89，V/V）為流動相進(jìn)行等度洗脫時[9]，（R，S）-告依春和綠原酸與相鄰峰的分離度較好，且分析時間恰當(dāng)（20 min內(nèi)），因此選擇上述溶液為本試驗(yàn)的流動相。

3.1.2 檢測波長的選擇 通過掃描（R，S）-告依春和綠原酸的紫外吸收波譜，并參考2015年版《中國藥典》（一部）[6]可知，（R，S）-告依春和綠原酸的最大吸收波長分別為245、327 nm，但綠原酸在245 nm波長處也有一定的吸收度。本研究在預(yù)試驗(yàn)中考察了HPLC波長轉(zhuǎn)換法，但轉(zhuǎn)換波長時易出現(xiàn)基線瞬間上揚(yáng)的現(xiàn)象。同時考慮到最大吸收波長處測定含量靈敏度和準(zhǔn)確度最高，因此筆者選擇分別在兩種成分各自的最大吸收波長處進(jìn)行含量測定，即選擇檢測波長為245 nm[（R，S）-告依春]、327 nm（綠原酸）。

3.2 溶劑的選擇

筆者分別考察了水、不同體積分?jǐn)?shù)的甲醇（20%、50%、80%）和乙醇（20%、50%、80%）為溶劑。結(jié)果，以水為溶劑時，雜質(zhì)峰較多；用不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液為溶劑時，（R，S）-告依春和綠原酸的峰形較差且基線不穩(wěn)；而采用50%甲醇溶液為溶劑時，上述兩種成分的響應(yīng)均較好，分離度高。因此，選擇50%甲醇溶液為本試驗(yàn)的溶劑。

3.3 綠原酸陰性對照的確定

處方中的金銀花和魚腥草均含有綠原酸[3-5]，以金銀花中含量較高[10]，故試驗(yàn)過程中制備了缺金銀花和魚腥草的雙陰性樣品[11]。

綜上所述，本方法操作簡便，結(jié)果準(zhǔn)確、靈敏度高、重復(fù)性好，可用于板柴口服液中（R，S）-告依春和綠原酸含量的同時測定。

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Simultaneous Determination of（R，S）-goitrin and Chlorogenic Acid in Banchai Oral Liquid by Dual-wavelength HPLC

HUA Zhihui1，LIU Dong2，LI Mingchun3（1.Dept.of Clinical Pharmacy，Clinical pharmacy Section，Zhengzhou People’s Hospital，Zhengzhou 450003，China；2.Drug Manufacturing Room，No.153 Central Hospital of PLA，Zhengzhou 450042，China；3.Dept.of Pharmacy，No.401 Hospital of PLA，Shandong Qingdao 266071，China）

R927.2

A

1001-0408（2017）27-3853-03

2017-05-02

2017-06-13）

（編輯：劉 柳）

軍隊(duì)醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑標(biāo)準(zhǔn)提高科研專項(xiàng)課題（No.14ZJZ02）

＊主管藥師，碩士。研究方向：醫(yī)院藥學(xué)。電話：0371-67079918。E-mail：zhihui19998@126.com

#通信作者：主管藥師，碩士。研究方向：醫(yī)院制劑研發(fā)與質(zhì)量控制。電話：0371-60653569。E-mail：liudong13673546650@163.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2017.27.30