廣西地不容藥材的HPLC指紋圖譜研究Δ

黃秋潔，葉勇，王捷，王志萍，韋煒，李丹，朱滴新（1.廣西中醫藥大學藥學院，南寧50001；2.廣西高校中藥制劑共性技術研發重點實驗室，南寧 50001；.廣西醫科大學藥學院，南寧 50021；.廣西醫科大學制藥廠，南寧 50021）

廣西地不容藥材的HPLC指紋圖譜研究Δ

黃秋潔1，2＊，葉勇3#，王捷4，王志萍1，2，韋煒3，李丹3，朱滴新3（1.廣西中醫藥大學藥學院，南寧530001；2.廣西高校中藥制劑共性技術研發重點實驗室，南寧 530001；3.廣西醫科大學藥學院，南寧 530021；4.廣西醫科大學制藥廠，南寧 530021）

目的：建立廣西地不容藥材的高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜。方法：采用HPLC法。色譜柱為Hypersil ODS2，流動相為乙腈-0.5%磷酸溶液（梯度洗脫），流速為1.0 mL/min，檢測波長為282 nm，柱溫為30℃，進樣量為10 μL。以延胡索乙素為參照，測定10批藥材樣品的HPLC圖譜，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統》（2012版）進行共有峰指認和相似度評價。結果：10批廣西地不容的HPLC圖譜有17個共有峰，10批藥材樣品中有8個產地藥材指紋圖譜與對照圖譜比較相似度＞0.900，2個產地藥材相似度＜0.900。結論：該研究所建HPLC指紋圖譜可為廣西地不容的鑒別和質量評價提供參考；廣西區內多數產地的地不容藥材所含生物堿類成分相似，少數存在差異。

廣西地不容；高效液相色譜法；指紋圖譜；相似度

ABSTRACTOBJECTIVE：To establish HPLC fingerprints of Stephania kwangsiensis.METHODS：HPLC method was adopted.The determination was performed on Hypersil ODS2 with mobile phase consisted of acetonitrile-0.5%phosphoric acid（gradient elution）at the flow rate of 1.0 mL/min.The detection wavelength was set at 282 nm，and column temperature was 30℃.The sample size was 10 μL.Using tetrahydropalmatine as reference，HPLC fingerprints of 10 batches of medicinal materials were determined.Common peak identification and similarity evaluation were conducted by using Similarity Evaluation System of TCM Chromatographic Fingerprint（2012 edition）.RESULTS：A total of 17 common peaks were identified in HPLC fingerprints of 10 batches of S.kwangsiensis.Among 10 batches of samples，fingerprint of samples from 8 producing areas were compared with control chromatogram.The similarity was higher than 0.900.The similaritg of samples from 2 producing areas were lower than 0.900.CONCLUSIONS：Established HPLC fingerprint can provide reference for the identification and quality evaluation of S.kwangsiensis；S.kwangsiensis in Guangxi from most producing areas include similar alkaloid components，but samples from other producing areas are different from them.

KEYWORDSStephania kwangsiensis in Guangxi；HPLC；Fingerprint；Similarity

廣西地不容Stephania kwangsiensis H.S.Lo為防己科千金藤屬草質藤本植物，別名又稱地不容、金不換，主產于廣西，是廣西壯族等少數民族民間常用草藥，在《廣西中藥材標準》[1]中收載為金不換的植物來源品種之一，其塊根是生產中藥顱痛定的重要原料，其功能為清熱解毒、散瘀消腫、健胃止痛，臨床多用于胃/十二指腸潰瘍疼痛、上呼吸道感染、急性胃腸炎、菌痢、牙痛、神經痛、癰瘡腫毒、跌打腫痛等癥的治療。研究發現，廣西地不容塊根中總生物堿含量較高，可達3%～4%，其具有較好的抗炎鎮痛作用[2]。本課題組曾建立了廣西地不容塊根藥材和常見混偽品雪膽塊根的鑒別方法[3]，目前已從地不容塊根中分離出9個異喹啉生物堿[4-7]，在保健食品和新藥研發上具有良好的應用前景。采用高效液相色譜法（HPLC）對中藥指紋圖譜進行研究可為中藥材的種屬差異、質量評價和真偽鑒別提供依據，從而達到控制中藥質量的目的[8-10]。為進一步評價廣西地不容藥材質量，本研究建立了廣西地不容生物堿類成分HPLC指紋圖譜，并對10批廣西地不容生物堿類成分HPLC指紋圖譜進行評價分析，對其已知成分延胡索乙素定位，以便能更加全面地反映廣西地不容藥材的質量差異，為評價和控制廣西地不容藥材綜合質量提供科學依據。

1 材料

1.1 儀器

LC-20A型HPLC儀，包括LC-20A輸液泵、SPDM20A二極管陣列檢測器、SIL-20A自動進樣器、CTO-20A柱溫箱、LC solution工作站（日本Shimadzu公司）；XS205DU型電子分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；KQ-500DB型數控超聲波清洗器（昆明市超聲儀器有限公司）。

1.2 試劑

延胡索乙素對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110726-200610，純度：＞98%）；乙腈為色譜純，甲醇、乙醇、磷酸均為分析純，水為去離子水。

1.3 藥材

廣西地不容藥材購于廣西各地中藥材市場（見表1），并經廣西中醫藥大學傅鵬副教授鑒定為真品。

表1 地不容藥材來源Tab 1 Sources of S.kwangsiensis

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Hypersil ODS2（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-0.5%磷酸溶液（B），梯度洗脫（0～8 min，0→20%A；8～40 min，20%→30%A；40～60 min，30%→45%A）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：282 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液 精密稱取延胡索乙素對照品適量，置于50 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容，搖勻，制成延胡索乙素質量濃度為2.250 mg/mL的對照品貯備液；精密量取上述對照品貯備液3.00 mL，置于10 mL量瓶中，加甲醇定容，搖勻，即得。

2.2.2 供試品溶液 取藥材樣品粉末約2 g（過60目篩），精密稱定，置于250 mL錐形瓶中，精密加60%乙醇溶液100 mL，稱定質量，超聲（功率：250 W，頻率：50 kHz）處理15 min，加熱回流提取60 min，放冷，再次稱定質量，用60%乙醇溶液補足減失的質量，搖勻，經0.45 μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。

2.3 方法學考察

2.3.1 精密度試驗 取“2.2.1”項下對照品溶液適量，按“2.1”項下色譜條件連續進樣測定6次，以延胡索乙素的保留時間和峰面積為參照，記錄各共有峰相對保留時間和相對峰面積。結果，17個共有峰相對保留時間、相對峰面積的RSD＜3.0%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.3.2 穩定性試驗 取“2.2.2”項下供試品溶液（編號：S1）適量，分別于室溫下放置0、2、4、8、12、24 h時按“2.1”項下色譜條件進樣測定，以延胡索乙素的保留時間和峰面積為參照，記錄各共有峰相對保留時間和相對峰面積。結果，17個共有峰相對保留時間、相對峰面積的RSD＜3.0%（n＝6），表明供試品溶液室溫放置24 h內基本穩定。

2.3.3 重復性試驗 精密稱取同一批樣品（編號：S1）適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，以延胡索乙素的保留時間和峰面積為參照，記錄各共有峰相對保留時間和相對峰面積。結果，17個共有峰相對保留時間、相對峰面積的RSD＜3.0%（n＝6），表明本方法重復性良好。

2.4 HPLC指紋圖譜的生成及共有峰相關分析

2.4.1 HPLC指紋圖譜的生成 取10批藥材樣品各適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統》（2012版）對10批藥材樣品的HPLC圖譜進行分析，得HPLC指紋圖譜，詳見圖1、圖2。

圖1 10批藥材樣品HPLC疊加指紋圖譜Fig 1 HPLC superposed fingerprints of 10 batches of samples

圖2 藥材樣品HPLC對照指紋圖譜Fig 2 HPLC control fingerprints of samples

2.4.2 相似度分析 采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統》（2012版）對10批藥材樣品的HPLC圖譜進行比較分析。結果，10批藥材樣品（S1～S10）相似度分別為0.984、0.980、0.953、0.962、0.988、0.973、0.966、0.869、0.891、0.921，表明10批藥材樣品中有8個產地藥材指紋圖譜與對照圖譜比較相似度＞0.900，2個產地藥材相似度＜0.900，說明廣西省內多數產地的地不容藥材所含成分相似，少數存在差異。

2.4.3 共有峰相關數據分析 采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統》（2012版）對10批藥材樣品的共有HPLC圖譜進行比較分析。10批藥材樣品共有17個特征指紋峰，共有峰的峰面積總和大于總峰面積的90%，通過對照品HPLC色譜確定14號峰為延胡索乙素。以14號峰為參照峰，計算其他共有峰相對于14號峰的相對保留時間和相對峰面積，詳見表2、表3。

表2 10批藥材樣品HPLC圖譜共有峰的相對保留時間Tab 2 Relative retention time of common peaks for HPLC fingerprints of 10 batches of samples

表3 10批藥材樣品HPLC圖譜共有峰的相對峰面積Tab 3 Relative peak areas of common peaks for HPLC fingerprints of 10 batches of samples

3 討論

本試驗所建HPLC指紋圖譜分析方法靈敏度高、重復性好、精密度好、操作簡便。在樣品前期處理時，筆者比較了超聲和加熱回流兩種提取方法，結果兩種方法差異不大，為簡化操作，筆者選擇程序簡單的超聲提取法。

本試驗采用紫外檢測器檢測發現，廣西地不容生物堿成分在282 nm波長處所檢測到的共有峰較多，多數生物堿成分在此處出峰，且峰強度較高、背景噪音小、基線平穩，經過考察最終選擇282 nm波長作為HPLC圖譜的檢測波長。筆者又分別考察了以甲醇-水、甲醇-0.5%磷酸溶液、乙腈-水、乙腈-0.5%磷酸溶液為流動相，進行等度或梯度洗脫。結果表明，采用乙腈-0.5%磷酸溶液為流動相（梯度洗脫），所得HPLC指紋圖譜各成分特征峰分布均勻、分離度高、峰形尖銳，故最終選擇乙腈-0.5%磷酸溶液作為流動相。

對廣西區內10個不同產地地不容藥材的HPLC指紋圖譜進行比較發現，其差異并不顯著，其中有8個產地藥材指紋圖譜與對照圖譜比較，相似度＞0.900，2個產地藥材相似度＜0.900，說明產地對藥材所含成分有一定的影響。但由于10批藥材均采集于廣西區內，其所在區域的氣候及生長環境較為相似，推測除與多數產地藥材HPLC指紋圖譜相似度較高有關外，還與藥材加工方法、貯存條件、采集季節、運輸方式有關，其內在質量也會因這些影響因素而存在一定差異。

[1]廣西壯族自治區衛生廳.廣西中藥材標準：第二冊[S].南寧：廣西科技出版社，1996：153-157.

[2]羅昱瀾，李江，毛柳珺，等.廣西地不容總堿的鎮痛抗炎作用及其急性毒性研究[J].海峽藥學，2015，27（12）：25-27.

[3]王捷，黎淵弘，何成章，等.廣西地不容塊根與雪膽塊根的鑒別[J].中藥材，2013，36（2）：216-219.

[4]閔知大，鐘守明.廣西地不容生物堿的研究[J].藥學學報，1980，15（9）：532-537.

[5]董紅敬.廣西地不容生物堿高速逆流色譜制備技術及提取工藝研究[D].濟南：山東中醫藥大學，2012.

[6]成桂仁，王桂青，文永新.廣西地不容生物堿的研究非酚性堿部分[J].藥學通報，1981，16（2）：49-50.

[7]鄧業成，徐漢虹.廣西地不容塊根生物堿成分研究[J].廣西師范大學學報（自然科學版），2004，22（12）：73-77.

[8]劉玉梅.指紋圖譜在中藥質量控制中的應用簡析[J].亞太傳統醫藥，2015，11（13）：55-57.

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Study on HPLC Fingerprints of Stephania kwangsiensis in Guangxi

HUANG Qiujie1，2，YE Yong3，WANG Jie4，WANG Zhiping1，2，WEI Wei3，LI Dan3，ZHU Dixin3（1.School of Pharmacy，Guangxi University of TCM，Nanning 530001，China；2.Key Lab of Generic Technology R&D for TCM Preparations in Guangxi Universities，Nanning 530001，China；3.School of Pharmacy，Guangxi Medical University，Nanning 530021，China；4.Pharmaceutical Factory of Guangxi Medical University，Nanning 530021，China）

R282

A

1001-0408（2017）27-3856-03

2016-09-07

2016-11-24）

（編輯：張 靜）

廣西高校科學技術研究項目（No.LX2014062）；廣西中醫藥大學中藥制劑共性技術研發重點實驗室系統性研究課題（No.ZJGX201402003）；廣西醫科大學大學生創新創業計劃項目（No.201510598063）

＊副教授。研究方向：中藥新劑型與新技術。E-mail：hqj8@163.com

#通信作者：副教授。研究方向：藥物新劑型與新技術。E-mail：yong-ye@163.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2017.27.31