響應面法優化梔子中總多酚、總黃酮的提取工藝Δ

黃 瀟，劉 婧，彭水梅，劉德鴻，付小梅，裴建國，吳志瑰（江西中醫藥大學藥學院，南昌 330004）

·制劑與工藝·

響應面法優化梔子中總多酚、總黃酮的提取工藝Δ

黃 瀟＊，劉 婧，彭水梅，劉德鴻，付小梅#，裴建國，吳志瑰（江西中醫藥大學藥學院，南昌 330004）

目的：優化梔子中總多酚、總黃酮的提取工藝。方法：通過Plackett-burman（PB）設計篩選乙醇體積分數、液料比、藥材粒徑、提取時間、提取溫度5個因素中對梔子總多酚、總黃酮提取的關鍵影響因素，再采用星點設計結合響應面法對提取工藝中關鍵影響因素進行優化，并進行驗證試驗。結果：梔子總多酚的最優提取條件為40%乙醇、藥材粒徑0.20 mm、提取溫度60℃、液料比20倍、提取時間20 min；總黃酮的最優提取條件為40%乙醇、藥材粒徑0.20 mm、提取溫度30℃、液料比20倍、提取時間20 min。驗證試驗中梔子總多酚、總黃酮的含量分別為1.70%（RSD＝1.43%，n＝3）、3.23%（RSD＝3.72%，n＝3），與預測值的相對誤差分別為1.80%、8.75%。結論：采用基于PB和星點設計的響應面法優化梔子總多酚、總黃酮的提取工藝簡便、合理、可行，本方法可為其工業化提取提供參考。

梔子；多酚；黃酮；Plackett-burman設計；星點設計；響應面法；提取工藝；優化

梔子為茜草科植物梔子（Gardenia jasminoides Ellis）的干燥成熟果實，被歷版《中國藥典》收載。國內外學者從梔子中發現了近80個黃酮類及多酚類化合物[1-2]，而這2類化合物多開發為天然的抗氧化劑[3-4]。為深度開發梔子這一江西道地藥材，本研究聯用Placket-burman（PB）-星點設計（Central composite design，CCD），通過響應面法分析優化梔子中黃酮類及多酚類化合物的提取工藝，為梔子的開發利用提供科學依據。

1 材料

1.1 儀器

KQ-250超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；HH-4數顯恒溫水浴鍋（國華電器有限公司）；BS224S電子天平（德國賽多利斯公司）；116搖擺式粉碎機（浙江瑞安市永歷制藥機械有限公司）；UV-2100紫外分光光度計（上海美譜達儀器有限公司）。

1.2 藥材、對照品與試劑

梔子（購自江西樟樹天齊堂中藥飲片有限公司，批號：20140708，經江西中醫藥大學范崔生教授鑒定為梔子的果實，憑證標本存于江西中醫藥大學中藥資源學科組）；沒食子酸對照品（批號：110813-201204，純度：98.50%）、蘆丁對照品（批號：11040302，純度：98.32%）均來源于中國食品藥品檢定研究院；其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 梔子總多酚的測定方法

2.1.1 沒食子酸標準曲線與方法學考察 精密稱取沒食子酸對照品5.0 mg，置于50 mL量瓶中，用80%乙醇稀釋至刻度，分別精密吸取0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mL于10 mL量瓶中，加水至4.0 mL，再加入2 mL福林酚試劑，搖勻，靜置5 min；再加入10%碳酸鈉溶液2 mL，用水稀釋至刻度，搖勻，避光放置120 min，于764 nm波長處測定吸光度[5]。以吸光度為縱坐標（y）、沒食子酸質量濃度為橫坐標（x），繪制標準曲線，得回歸方程為：y＝0.095x－0.103（R2＝0.998 0），表明沒食子酸質檢測質量濃度線性范圍為3～8μg/mL。按相關方法學考察方法操作，精密度試驗中吸光度的RSD＝0.09%（n＝6）；穩定性試驗中樣品溶液室溫放置8 h含量的RSD＝0.29%（n＝6）；分別按80%、100%、120%精密加入適量沒食子酸對照品的樣品溶液的平均回收率分別為98.94%、97.83%、98.90%（RSD＝2.24%，n＝3）。上述試驗結果提示，本含量測定方法均符合相關方法學要求。

2.1.2 梔子總多酚的測定 精密稱取梔子粉末0.5 g，置于100 mL錐形瓶中，精密加入20 mL 80%乙醇溶液，超聲提取20 min（頻率：40 kHz，功率：250 W），取出，放至室溫，離心20 min（3 000 r/min，離心半徑為6.5 cm）。取上清液置于10 mL量瓶中，加水至4.0 mL，先加入2 mL福林酚試劑，搖勻，靜置5 min；再加入2 mL 10%碳酸鈉溶液，用水定容至刻度，搖勻，避光放置120 min。于764 nm波長處測定吸光度，根據沒食子酸標準曲線計算梔子總多酚含量，每組試驗平行3次。

2.2 梔子總黃酮的測定方法

2.2.1 蘆丁標準曲線與方法學考察 精密稱取蘆丁對照品6.2 mg，置于25 mL量瓶中，用80%乙醇稀釋至刻度，分別精密吸取1.3、1.6、1.9、2.1、2.4、2.8 mL置于10 mL量瓶中（不足2.4 mL者加水至2.4 mL），先加入5%亞硝酸鈉溶液0.4 mL，搖勻，靜置6 min；然后加入10%硝酸鋁溶液0.4 mL，搖勻，靜置6 min；最后加入4.3%氫氧化鈉溶液4.0 mL，用水稀釋至刻度，搖勻，靜置15 min，于508 nm波長處測定吸光度[6]。以吸光度為縱坐標（y）、蘆丁質量濃度為橫坐標（x），繪制標準曲線，得回歸方程為：y＝12.056x－0.148 5（R2＝0.999 6），表明蘆丁檢測質量濃度線性范圍為32.24～69.44 μg/mL。按相關方法學考察方法操作，精密度試驗中吸光度的RSD＝0.12%（n＝6）；穩定性試驗中樣品溶液室溫放置8 h含量的RSD＝0.35%（n＝6）；分別按80%、100%、120%精密加入適量蘆丁對照品的樣品溶液的平均回收率分別為98.12%、97.93%、98.45%（RSD＝2.09%，n＝3）。上述試驗結果提示，本含量測定方法均符合相關方法學要求。

2.2.2 梔子總黃酮的測定 精密稱取梔子粉末0.5 g，置于100 mL錐形瓶中，精密加入20 mL的80%乙醇溶液，超聲提取20 min（頻率：40 kHz，功率：250 W），取出，放至室溫，離心20 min（3 000 r/min，離心半徑為6.5 cm）。取上清液置于10 mL量瓶中，加水至2.4 mL，先加入5%亞硝酸鈉溶液0.4 mL，搖勻，靜置6 min；再加入10%硝酸鋁溶液0.4 mL，搖勻，靜置6 min；最后加入4.3%氫氧化鈉溶液4 mL，用水定容至刻度，搖勻，放置10～15 min。于508 nm波長處測定吸光度，根據蘆丁標準曲線計算梔子總黃酮的含量，每組試驗平行3次。

2.3 梔子總多酚和總黃酮提取工藝的優化

2.3.1 提取方法 精密稱取一定量的已過工業篩的梔子粉末（根據不同目數的工業篩來篩選出不同粒徑大小的梔子粉末），置于具塞錐形瓶中，加入一定量的不同體積分數的乙醇溶液，用鐵架臺固定于超聲清洗器中，在保持超聲清洗器中一定的提取水溫的情況下（即提取溫度），超聲提取一定時間，過濾，收集提取液備用。

2.3.2 PB設計 查閱文獻[7-8]，分別設置乙醇體積分數（X1）、液料比（X2）、藥材粒徑（X3）、提取時間（X4）及提取溫度（X5）5個考察因素。在前期的單因素試驗中每個因素均考察了5個水平。根據單因素試驗結果，得到各因素的取值范圍為X1：40%～80%，X2：10～30倍[加醇量（mL）∶梔子質量（g）]，X3：0.20～1.45 mm，X4：10～30 min，X5：30～70℃。以總多酚含量[TPC，即總多酚質量（g）/梔子質量（g）×100%]及總黃酮含量[TFC，即總黃酮質量（g）/梔子質量（g）×100%]為指標，用Design Expert 7.0軟件設計試驗并進行數據處理。PB試驗因素與水平見表1，試驗設計與結果見表2，方差分析結果見表3。

表1 PB試驗的因素與水平Tab 1 Factors and levels in PB test

表2 PB試驗設計與結果Tab 2 PB test design and results

表3 PB試驗方差分析結果Tab 3 Results of variance analysis of PB test

從表3可知，各因素對TFC影響大小為X3＞X1＞X5＞X2＞X4；對 TPC 影 響 大 小 為 ：X3＞X5＞X1＞X4＞X2。對5個因素進行回歸分析和檢驗得知：X2、X4、X5與TPC、TFC響應值均具有正相關性；X3對這2個指標的響應值均具有極顯著影響；X1、X5對響應值具有顯著影響；X2、X4對響應值均不具有顯著影響。

綜合考慮，將乙醇體積分數、藥材粒徑、提取溫度這3個顯著因素作為星點設計中的因素；而液料比和提取時間這2個非顯著因素不再進一步優化，而直接采用PB試驗中的0水平，即分別為20倍、20 min。

2.3.3 星點設計 根據PB試驗結果分析，選取乙醇體積分數（X1）、藥材粒徑（X3）、提取溫度（X5）為考察變量，以TPC、TFC為指標，進一步采用星點設計對梔子提取工藝進行優化。試驗包括12個析因試驗和3個中心試驗（估計誤差）。在星點設計中每個因素取3個水平，以[－l，0，1]表示；試驗數據進行二次回歸擬合，得到帶交互項和平方項的二次方程；分析各因素的主效應和交互效應，最后在一定的水平范圍內求出最佳值。星點設計的因素與水平見表4，星點設計與結果見表5。

表4 星點設計的因素與水平Tab 4 Factor and levels in CCD test

表5 星點設計與結果Tab 5 CCD test design and results

應用Design Expert 7.0軟件對數據進行多元回歸，經回歸擬合后，各影響因素對各響應值的影響可用回歸方程表示（Y1為 TPC，Y2為 TFC）：Y1＝1.22－0.17X1－0.32X3+0.13X5－0.041X1X3+0.032X1X5+0.055X3X5－0.055X12+0.15X32－ 0.055X52（R12＝0.846 5）；Y2＝2.19 －0.36X1－0.28X3+0.09X5－0.27X1X3+0.22X1X5+0.25X3X5+0.12X12+0.049X32－0.14X52（R22＝0.865 7）。

對回歸方程和方程的各因子進行方差分析，結果見表6。

表6 回歸方程的顯著性檢驗與方差分析結果Tab 6 Results of significance test of the regression equation and variance analysis

根據方差分析結果得知，各模型方程P值均小于0.01，即表明指標值與自變量的多元回歸關系極其顯著，且失擬值均不顯著（P＞0.05），表明試驗相對于純誤差不具有顯著性，模型合適。因此可以利用以上方程對梔子中總多酚、總黃酮的提取進行預測。

對于TPC模型方程，其R12＝0.846 5，表明Y1方程擬合情況較好（R2值＞0.7即認為該方程擬合較好）。并且從方差結果中發現，X1、X3、X5對TPC具有顯著影響（P＜0.05），但是各因素之間的交互作用影響不明顯（P＞0.05）。

對TFC模型方程，其R22＝0.865 7，表明Y2方程擬合情況較好。并且從方差結果中發現，X1、X3、X1X3、X1X5以及X3X5對TFC具有顯著影響（P＜0.05）。

2.3.4 響應面分析 利用Design Expert 7.0軟件作出各因素之間交互作用的等高線圖及響應面圖，見圖1、圖2。

由圖1可知，各因素對TPC的影響大小依次為X3＞X1＞X5，因此減小藥材粒徑、增加乙醇體積分數、升高提取溫度，都可使TPC響應值增加。3個因素的等高線并沒有趨向橢圓，故無交互作用。

由圖2可知，對TFC的影響大小依次為X1＞X3＞X5，X3、X1的等高線趨向于橢圓，故兩者有交互作用。當X5固定為50℃、X2固定為20倍、X1固定在40%～80%范圍中任一值的條件下，X3在0.20～1.45 mm范圍內，隨著粒徑減少TFC逐漸增加。同樣，若其他條件都固定，而X1值在40%～80%范圍內，隨著X1的升高，TFC響應值逐漸增加。

2.3.5 最優工藝條件的確定和模型的驗證 通過Design Expert 7.0數據分析軟件得出回歸模型，預測出總多酚的最優提取工藝條件為：乙醇體積分數40%，藥材粒徑0.20 mm、提取溫度57.87℃。預測梔子TPC為1.67%。考慮到試驗的可操作性，將提取溫度優化為60℃。總黃酮的最優提取工藝條件為：乙醇體積分數40%、藥材粒徑0.20 mm、提取溫度30℃。預測梔子TFC為2.97%。

為了對模型進行驗證，在以上最優提取條件下進行驗證試驗，共進行3次平行試驗。精密稱取500 g粒徑為0.20 mm的梔子粉末，加入40%乙醇溶液，液料比為20倍，提取水溫控制為60℃，超聲提取20 min，結果梔子TPC平均值為1.70%（RSD＝1.43%，n＝3）。精密稱取500 g粒徑為0.20 mm的梔子粉末，加入40%乙醇溶液，液料比為20倍，提取水溫控制為30℃，超聲提取20 min，結果TFC平均值為3.23%（RSD＝3.72%，n＝3）。二者與預測值的相對誤差分別為1.80%、8.75%，提示建立的最優提取條件穩定、可靠。

圖1 各因素對TPC的等高線圖和響應面圖Fig 1 Contours plots and response surfaces of each factor on TPC

3 討論

PB設計法是一種通過N次試驗可以研究最多K＝N－1個變量（N一般為4的倍數）的2水平的試驗方法，適用于從眾多的考察因素中快速有效地篩選出最為重要的幾個因素，供進一步研究用。本試驗采用PB設計方法對影響梔子中總多酚、總黃酮提取的5個因素即乙醇體積分數、液料比、藥材粒徑、提取時間及提取溫度進行篩選，快速地優化出3個關鍵的影響因素即乙醇體積分數、藥材粒徑、提取溫度，為CCD-響應面法的最優提取工藝的研究提供了基礎。

圖2 各因素對TFC的等高線圖和響應面圖Fig 2 Contours plots and response surfaces of each factor on TFC

江西是梔子的道地產區，也是《中藥材生產質量管理規范》（GAP）產地。梔子中主要含有環烯醚萜類、西紅花苷類、三萜類、有機酸類、黃酮類、多酚類等成分。歷來文獻主要對梔子中環烯醚萜類尤其是對其中的京尼平苷的分析測定較多，其次是對西紅花苷類的含量測定，對酚酸類僅有極少量報道，如綠原酸、熊果酸、藏紅花酸的含量測定[9-11]。有關梔子的總多酚、總黃酮的含量及提取工藝研究報道較少。本試驗通過聯用PB-CCD設計方法進行梔子中總多酚、總黃酮成分的提取工藝研究，首先利用PB設計方法對提取過程中的因素進行篩選，再利用CCD-響應面法優化最終提取工藝參數，建立具有較高預測性的提取模型，為今后對梔子總多酚、總黃酮的工業提取制備提供了試驗基礎。

多酚類和黃酮類化合物具抗氧化、清除自由基、抗衰老、降血脂、降血壓、降血糖、抗癌、鎮痛、免疫、抗炎、抗菌等作用[12-14]。合成的抗氧化劑如叔丁基羥基茴香、2，6-二叔丁基對甲酚、叔丁基對苯二酚因具有毒性而被限制使用[15]。因此，從植物中尋找安全、天然的抗氧化劑成為研究熱點。本試驗研究結果為梔子開發成天然的抗氧化劑提供了一定的科學基礎，為促進江西道地藥材梔子資源的充分利用與深度開發奠定了基礎。

[1] 張忠立，左月明，楊雅琴，等.梔子中的黃酮類化學成分研究[J].中國實驗方劑學雜志，2013，19（4）：79-81.

[2] Nishizawa M，Izuhara R，Kaneko K，et al.5-Lipoxygenase inhibitors isolated from Gardeniae Fructus[J].Chem Pharm Bull，1988，36（1）：87-95.

[3] 賢景春，林婉華.飛揚草總多酚提取及其對羥基自由基的抑制作用[J].云南農業大學學報，2014，29（1）：131-134.

[4] 趙二勞，馮冬艷，武宇芳，等.香椿葉提取物抗氧化及抑菌活性研究[J].河南工業大學學報（自然科學版），2013，34（6）：69-72.

[5] 張軍，李江遐，陸翠珍，等.Folin-Ciocalteu比色法測桑葉中多酚含量[J].激光生物學報，2012，21（2）：131-135.

[6] 付克，王書妍，包玉敏，等.梔子中黃酮類化合物的提取和含量測定[J].內蒙古民族大學學報（自然科學版），2012，27（5）：530-532.

[7] 胡春暉，張發斌.Box-Behnken響應面法優化砂生槐子中總生物堿的提取工藝[J].中成藥，2016，38（9）：2063-2066.

[8] 康冰亞，劉瑞新，桂新景，等.Box-Behnken響應面法優化大蒜油提取工藝[J].中國藥房，2017，28（1）：103-106.

[9] 付小梅，彭水梅，劉婧，等.HPLC法同時測定梔子類藥材中10個主要有效成分的含量[J].藥物分析雜志，2014，34（4）：615-621.

[10] 林萍，陳繼光，尹忠平，等.不同培養條件對黃梔子愈傷的生長和綠原酸類物質積累的影響[J].現代食品科技，2017，33（4）：181-188.

[11] 楊海玲，覃葆，李琴，等.焦梔子炮制前后熊果酸含量變化[J].中國實驗方劑學雜志，2013，19（15）：43-45.

[12] Ajay M，Cheng M，Mustafa AM，et al.A comparative study on antioxidant activity of flavonoids：structure-activity relationship[J].Malays J Sci，2005，24（1）：187-190.

[13] Singh M，Bhui K，Singh R，et al.Tea polyphenols enhance cisplatin chemosensitivity in cervical cancer cells via induction of apoptosis[J].Life Sci，2013，93（1）：7-16.

[14] Latruffe N，Rifler JP.Bioactive polyphenols from grapes and wine emphasized with resveratrol[J].Curr Pharm Des，2013，19（34）：6053-6063.

[15] Hu W，Shen W，Wang M，et al.Free radical scavenging activity and protective ability of methanolic extract from Duchenea indica against protein oxidation and DNA damage[J].J Food Sci Nutr，2009，14（4）：277-282.

Optimization of Extraction Technology of Total Polyphenols and Total Flavonoids in Gardenia jasminoides by Response Surface Method

HUANG Xiao，LIU Jing，PENG Shuimei，LIU Dehong，FU Xiaomei，PEI Jianguo，WU Zhigui（School of Pharmacy，Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine，Nanchang 330004，China）

OBJECTIVE：To optimize the extraction technology of total polyphenol and total flavonoid in Gardenia jasminoides.METHODS：Plackett-burman（PB）design was used to select the ethanol volume fraction，liquid-solid ratio，particle size，extraction time and extraction temperature to determine the key factor affecting the extraction of total polyphenol and total flavonoids in G.jasminoides.Then central composite design（CCD）was combined with response surface method to optimize the extraction technology，and verification test was conducted.RESULTS：The optimal extraction conditions of total polyphenol were 40%ethanol，particle size of 0.20 mm，extraction temperature of 60℃，liquid-solid ratio of 20，and extraction time of 20 min；the optimal extraction conditions of total flavonoids were 40%ethanol，particle size of 0.20 mm，extraction temperature of 30℃，liquid-solid ratio of 20，and extraction time of 20 min.In verification test，the contents of total polyphenol and total flavonoids in G.jasminoi-des were 1.70%（RSD＝1.43%，n＝3），3.23%（RSD＝3.72%，n＝3），with relative error of 1.80%，8.75%with predicted values，respectively.CONCLUSIONS：The response surface method based on PB and CCD is simple，reasonable and feasible to optimize the extraction technology of total polyphenol and total flavonoids in G.jasminoides.The method can provide reference for its industrial extraction.

Gardenia jasminoides；Polyphenol；Flavonoid；Plackett-burman design；Central composite design；Response surface method；Extraction technology；Optimization

R284.2

A

1001-0408（2017）28-3964-05

2017-03-10

2017-05-22）

（編輯：劉 萍）

國家自然科學基金資助項目（No.81360620）

＊講師，碩士。研究方向：中藥制劑。電話：0791-87118645。E-mail：54682090@qq.com

#通信作者：副教授，博士。研究方向：中藥品質評價。電話：0791-87118993。E-mail：smilefxm@163.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2017.28.21