不同干燥方式對杜仲葉4種活性成分含量的影響Δ

鄭艷萍，潘艷瓊，秦昆明，徐虹#（.南京海昌中藥集團有限公司，南京006；.江蘇省第二中醫院藥劑科，南京 006）

不同干燥方式對杜仲葉4種活性成分含量的影響Δ

鄭艷萍1＊，潘艷瓊2，秦昆明1，徐虹2#（1.南京海昌中藥集團有限公司，南京210061；2.江蘇省第二中醫院藥劑科，南京 210061）

目的：考察不同干燥方式對杜仲葉中活性成分含量的影響，為建立杜仲葉在產地采收后的干燥加工方式提供參考。方法：取杜仲葉采用不同干燥方法[自然陰干72 h、自然曬干36 h、烘干（60℃6 h、80℃2 h、100℃1 h、120℃0.5 h）、微波真空冷凍干燥12 h、真空冷凍干燥12 h]對杜仲葉進行處理；采用高效液相色譜法同時測定樣品中桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸、綠原酸、京尼平苷的含量，并與未處理的鮮品進行比較。結果：2種冷凍干燥后的樣品與鮮品中的4種成分含量接近，并高于其他干燥方式處理的樣品。結論：干燥方法對杜仲葉有效成分具有較顯著的影響，微波真空冷凍干燥和真空冷凍干燥較自然陰干、自然曬干、烘干更能保留杜仲鮮葉中的活性成分。

杜仲葉；桃葉珊瑚苷；京尼平苷酸；綠原酸；京尼平苷；干燥方式；微波真空冷凍干燥；真空冷凍干燥

杜仲葉為杜仲科杜仲屬植物杜仲（Eucommia ulmoides Oliv.）的干葉[1]。杜仲傳統以樹皮入藥，是中國自古以來的名貴滋補藥材[2]。現代藥理研究表明，杜仲中有效成分對免疫系統、內分泌系統、中樞神經系統、循環系統和泌尿系統均有不同程度的調節作用，還能興奮垂體-腎上腺皮質系統，增強腎上腺皮質功能[3]。

由于杜仲傳統加工方式導致剝皮樹死，為保護杜仲植物資源，作為替代資源的杜仲葉的化學成分及藥理作用研究近年來已取得初步進展。杜仲葉與傳統杜仲皮的化學成分和藥理作用極其相似，均具有降壓作用[4]。桃葉珊瑚苷是杜仲葉中重要的生物活性物質，具有清濕熱、利尿、鎮痛、降壓、保護肝臟、抗腫瘤等作用，能促進干細胞再生，顯著抑制乙型肝炎病毒DNA的復制[5]；杜仲葉中的活性成分京尼平苷酸具有消炎、利膽等功效，臨床用于降壓效果非常顯著[6]；杜仲葉中含量較高的活性成分之一綠原酸具有抗菌消炎、特殊的抗誘變及抗惡性腫瘤等多種藥理療效[7]；另一種活性成分京尼平苷對心血管系統、消化系統及中樞神經系統疾病均有獨特的療效，同時，京尼平苷還有抗炎和治療軟組織損傷的療效[8]。杜仲葉在產地采收以后需要干燥后儲存，傳統干燥方式以低溫烘干為主[9]，而近年來又出現多種新的干燥方式，如微波真空冷凍干燥和真空冷凍干燥等。為比較各干燥方式的效果，筆者在本試驗中較系統地研究了杜仲葉經自然陰干、自然曬干、烘干、冷凍干燥后，主要活性成分桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸、綠原酸、京尼平苷的含量變化，比較各干燥工藝對杜仲葉主要活性成分的影響，為杜仲葉干燥方式的改進提供科學依據。

1 材料

1.1 儀器

LC-20AB高效液相色譜（HPLC）儀，包括二極管陣列檢測器（DAD）（日本Shimadzu公司）；FA1104電子分析天平（上海精密科學儀器有限公司）；KQ3200DB數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率：350 W，頻率：40 kHz）；TGL-16C離心機（上海安亭科學儀器廠）；真空冷凍干燥機（北京四環儀器公司）；YHW-4S微波真空冷凍干燥機（南京亞泰微波能技術研究所）。

1.2 藥材、藥品與試劑

杜仲葉（于2016年7月采摘自北京林業科學研究院，經南京中醫藥大學藥學院陳建偉教授鑒定為杜仲植物的新鮮葉）；桃葉珊瑚苷對照品（批號：MUST-11091601，純度：＞98%）、京尼平苷酸對照品（批號：MUST-11121502，純度：＞98%）均來自成都曼思特生物科技有限公司；綠原酸對照品（批號：110753-200413，純度：＞98%）、京尼平苷對照品（批號：110749-200613，純度：＞98%）均來自中國食品藥品檢定研究院；甲醇、乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結果

2.1 不同干燥方式制備杜仲葉樣品

通過參考文獻[9]方法及預試驗篩選，本試驗采用以下幾種干燥方式。

2.1.1 自然陰干 取杜仲葉鮮品1份，50 g，于室內通風處自然陰干（72 h），備用，樣品編號S1。

2.1.2 自然曬干 取杜仲葉鮮品1份，50 g，于日光下曬干（36 h），備用，樣品編號S2。

2.1.3 烘干 取杜仲葉鮮品4份，每份50 g，分別平鋪于瓷托盤上，放入電熱鼓風干燥箱內，分別于60、80、100、120℃下加熱，各溫度下分別干燥6、2、1、0.5 h后取出，備用，樣品編號分別為S3、S4、S5、S6。

2.1.4 微波真空冷凍干燥 取杜仲葉鮮品1份，50 g，－40℃預凍后放入微波真空冷凍干燥機進行冷凍干燥（微波功率為700 W，冷阱溫度為－40℃，真空度為0.07 kPa），干燥12 h后取出，備用，樣品編號S7。

2.1.5 真空冷凍干燥 取杜仲葉鮮品1份，50 g，－40℃預凍后放入真空冷凍干燥機進行冷凍干燥（冷阱溫度為－45℃，真空度為0.06 kPa），干燥12 h后取出，備用，樣品編號S8。

2.1.6 未干燥 另取杜仲葉鮮品不作任何處理，樣品編號為S9。

2.2 色譜條件與系統適用性試驗

[10-13]確定色譜條件。色譜柱：YMC C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-0.2%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（洗脫程序見表1）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：200 nm；柱溫：35 ℃；進樣量：10 μL。取“2.3”項下供試品（S7）溶液和混合對照品溶液進樣分析，色譜圖見圖1。

由圖1可見，4個主成分的峰之間及與相鄰峰之間分離度均大于1.5，雜質及其他成分不干擾主成分的測定。

表1 梯度洗脫程序Tab 1 Gradient elution program

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

2.3 溶液的制備

2.3.1 供試品溶液 參考文獻[12]方法制備。分別取不同干燥方式制得的杜仲葉樣品適量，粉碎后過3號篩；其中冷凍干燥的樣品，在干冰保護下研缽搗碎后過篩。取過篩粉末約1 g，精密稱定，分別置于具塞錐形瓶中，加入20 mL石油醚超聲30 min，過濾棄去濾液；濾渣揮干，精密加入80%甲醇10 mL，稱定質量，超聲處理40 min，放冷；再稱定質量，用80%甲醇補足損失的質量，搖勻，0.45 μm濾膜過濾；取續濾液，即得供試品溶液。新鮮杜仲葉取約4.1 g（相當于干燥品1 g），剪碎后同法處理。

2.3.2 混合對照品溶液 分別精密制備質量濃度為2.1 mg/mL的桃葉珊瑚苷、0.72 mg/mL的京尼平苷酸、0.692 mg/mL的綠原酸和1.4 mg/mL的京尼平苷的甲醇對照品溶液，分別吸取0.5、1、1、0.5 mL置于5 mL量瓶中，用甲醇定容，即得混合對照品溶液。

2.4 線性關系與定量限考察

精密量取混合對照品溶液 0.1、0.5、1.0、5.0、10.0 mL，分別置于10 mL量瓶中，加80%甲醇定容至刻度，搖勻。將上述制備好的不同質量濃度的混合對照品溶液按照“2.2”項下色譜條件進樣分析。以對照品的峰面積（y）對對應的質量濃度（x）進行線性回歸，得回歸方程、相關系數及線性范圍。以各化合物的信噪比等于10時的相應質量濃度確定定量限（LOQ），結果見表2。

表2 4種成分的線性關系和定量限Tab 2 Linear relationship and LOQ of 4 ingredients

2.5 精密度試驗

取混合對照品溶液，在“2.2”項條件下連續進樣6次，記錄保留時間和峰面積。計算得桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸、綠原酸、京尼平苷峰面積的RSD分別為4.56%、2.34%、4.72%、2.71%（n＝6），保留時間的RSD分別3.03%、2.64%、3.88%、1.48%（n＝6）。結果表明，該儀器的精密度良好。

2.6 重復性試驗

取S7樣品粉末，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，平行6份，按“2.2”項下色譜條件進樣測定。計算得桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸、綠原酸、京尼平苷含量的RSD分別為2.37%、1.79%、1.70%、4.17%（n＝6），保留時間的RSD分別為1.15%、0.83%、0.79%、1.04%（n＝6）。結果表明，該方法的重復性較好。

2.7 穩定性試驗

取S7樣品的供試品溶液，分別在放置0、1、6、12、18、24 h后進樣測定，記錄峰面積和保留時間。結果桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸、綠原酸、京尼平苷峰面積的RSD分別為 3.70%、1.03%、3.04%、3.69%（n＝6），保留時間的RSD分別為 2.35%、3.73%、2.73%、3.22%（n＝6）。結果表明，供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.8 準確度試驗

取已測定含量的S7樣品6份，精密稱定，分別精密加入一定量的桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸、綠原酸、京尼平苷對照品，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.2”項下色譜條件進樣分析，計算回收率。結果桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸、綠原酸、京尼平苷平均加樣回收率分別為98.61%、98.56%、99.50%、101.28%，RSD分別為1.82%、3.25%、1.80%、1.47%（n＝6）。

2.9 樣品中4種成分含量測定

取9種樣品制備的供試品溶液進樣測定，計算樣品中桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸、綠原酸、京尼平苷的含量（以干燥品計）。各數據采用SPSS 17.0軟件進行統計分析，多組均數比較采用單因素方差分析，組間進行多重比較，分析采用LSD法。結果見表3。

表3 樣品中4種成分含量測定結果（n＝3，mg/g）Tab 3 Determination results of 4 ingredients of samples（n＝3，mg/g）

通過表3可知，除S1、S2外，各干燥樣品中京尼平苷含量與鮮葉比較變化不大；S7、S8與鮮葉中4種成分的含量均接近，并高于其他方式干燥后的樣品。

3 討論

本試驗在考察杜仲葉的自然陰干、曬干、烘干、冷凍干燥工藝的基礎上，建立了同時測定杜仲葉中4種活性成分即桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸、綠原酸、京尼平苷含量的HPLC法，并對不同干燥方式的效果進行了比較。結果表明，本文建立的含量測定方法重復性好、可操作性強，所測結果比較全面、直觀地反映了不同干燥方式處理后的杜仲葉中4種活性成分的差異，可用于杜仲葉藥材的功效成分定量研究及質量控制。

筆者在前期試驗中分別比較了不同提取溶劑（甲醇、50%甲醇、80%甲醇、乙醇、50%乙醇、80%乙醇）、不同提取方法（超聲、回流、索氏提取等）、不同流動相組成（乙腈-0.2%乙酸水溶液、乙腈-0.2%磷酸水溶液、甲醇-0.2%乙酸水溶液、甲醇-0.2%磷酸水溶液）條件下的提取效果，以及在HPLC-DAD全波段190～800 nm波長下的掃描結果。結果顯示，提取溶劑為80%甲醇時被測成分提取率最高；3種提取方法的效果相近，但因超聲方法簡單易行，故選取超聲提取；流動相選擇乙腈-0.2%磷酸水溶液、檢測波長在200 nm時，被測成分分離度好、干擾小、色譜圖基線平穩。

真空冷凍干燥機和微波真空冷凍干燥機一次干燥最大容量為1.2 L，因為杜仲葉體積較大，所以每次干燥量一般約為50 g。與真空冷凍干燥機比較，微波真空冷凍干燥機增加了微波功能，而微波可以穿透物料，可以在物料內部形成均勻的內熱源，補充了物料凍干所需能量，故其干燥時間縮短。真空冷凍干燥機由于沒有微波功能，故其冷凍效率更低，若要達到相同的冷凍效果就要降低冷凍溫度，因此本試驗中真空冷凍干燥溫度設置為－45℃，由于溫度低，真空度只能達到0.06 kPa。

通過比較9種杜仲葉樣品中活性成分的含量發現，在產地、品種、采收時間等因素都相同的情況下，采取不同的干燥方式制得的杜仲葉樣品活性成分含量相差較大，與文獻結論[14-15]一致。桃葉珊瑚苷和綠原酸在烘干方式下，隨著烘干溫度升高，含量降低，尤其以桃葉珊瑚苷含量變化尤為明顯，可能與這2種成分的熱穩定性差有很大的關系。2種真空冷凍干燥處理后的樣品，其中的活性成分含量與鮮葉樣品最接近，表明冷凍干燥工藝更能保留杜仲葉的活性成分。

為提高杜仲葉藥材的有效利用率，必須選擇高效、穩定、可靠的干燥方式并加以規范操作，才能更有效地利用藥材資源。本研究為篩選適用于杜仲葉的產地干燥方式、提高和控制杜仲葉藥材質量提供了科學依據。

參考文獻

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[S].2015年版.北京：中國醫藥科技出版社，2015：166.

[2] 肖芳，黃勤挽，范潤勇，等.HPLC法同時測定杜仲3個藥用部位中8種成分[J].中成藥，2016，38（8）：1782-1786.

[3] 袁天翊，方蓮花，呂揚，等.杜仲葉的藥理作用研究進展[J].中國中藥雜志，2013，38（6）：81-85.

[4] 黃勤挽，王瑾，蘇娟雙，等.雙波長HPLC法同時測定杜仲雄花中 3 種成分的含量[J].中國藥房，2011，22（27）：2565-2567.

[5] 鄭杰，劉端，趙肅清，等.杜仲葉桃葉珊瑚苷的酶法提取及其抑菌活性[J].中藥材，2012，35（2）：304-306.

[6] 孫彥超，李欽，杜紅巖，等.RP-HPLC測定杜仲葉中京尼平苷酸、綠原酸、京尼平苷的含量[J].中成藥，2009，31（10）：1608-1609.

[7] 李文娜，韓宇東，劉銀花，等.杜仲葉綠原酸提取物對脂代謝關鍵酶活性的影響[J].中藥新藥與臨床藥理，2012，23（1）：30-33.

[8] Li Y，Kamo S，Metori K，et al.The promoting effect of eucommiol from Eucommiae cortex on collagen synthesis[J].Biol Pharm Bull，2000，23（1）：54-59.

[9] 嚴瑞娟，張水寒，羅躍龍，等.不同產地初加工方式處理杜仲葉的HPLC指紋圖譜研究[J].中草藥，2013，44（15）：2485-2491.

[10] 王柏強，劉福，江承平，等.正交試驗優選杜仲葉綠原酸的提取工藝[J].中國藥房，2014，25（27）：2527-2530.

[11] 唐芳瑞，榮華，邵峰，等.不同產地杜仲葉高效液相色譜指紋圖譜分析[J].時珍國醫國藥，2016，27（6）：1496-1498.

[12] 阿來·賽坎，文娥，田樹革.高效液相色譜法同時測定杜仲葉中4種有效成分的含量[J].國際藥學研究雜志，2016，43（3）：571-574.

[13] Wang JL，Liu EW，Wu S，et al.Development of HPLC method to evaluate drug-processing technique of Eucommiae cortex[J].Chin Herb Med，2011，3（3）：221-225.

[14] 杜紅巖，劉昌勇，李欽，等.杜仲葉中3種主要活性成分含量的季節變化[J].中南林業科技大學學報，2011，31（8）：6-9.

[15] 宣志紅，壽輝，姚琥，等.不同干燥加工與貯藏方法對杜仲葉藥材質量變化的研究[J].中草藥，2013，44（11）：1431-1434.

Effects of Different Drying Methods on Contents of 4 Active Ingredients in Leaves of Eucommia ulmoides

ZHENG Yanping1，PAN Yanqiong2，QIN Kunming1，XU Hong2（1.Nanjing Haichang Chinese Medicine Group Co.，Ltd.，Nanjing 210061，China；2.Dept.of Pharmacy，Jiangsu Second TCM Hospital，Nanjing 210061，China）

OBJECTIVE：To investigate the effects of different drying methods on contents of active ingredients in leaves of Eucommia ulmoides，and provide reference for establishing its drying methods after habitat harvesting.METHODS：Different drying methods[natural drying in the shade for 72 h，natural drying in the sunlight for 36 h，drying beside or over a fire（60℃ 6 h，80℃ 2 h，100℃ 1 h，120℃ 0.5 h），microwave vacuum freeze drying for 12 h，vacuum freeze drying for 12 h]were used for processing.HPLC was conducted to determine the contents of aucubin，geniposidic acid，chlorogenic acid and geniposide in samples and compare with the untreated fresh products.RESULTS：Contents of 4 ingredients in samples after the 2 freeze drying were close to these in fresh samples，which were higher than samples after other drying.CONCLUSIONS：Drying methods show significant effects on the effective ingredients in leaves of E.ulmoides.Compared with natural drying in the shade and natural drying sunlight and drying beside or over a fire，microwave vacuum freeze drying and vacuum freeze drying can make better retention of the active ingredients in fresh leaves of E.ulmoides.

Leaves of Eucommia ulmoides；Aucubin；Geniposidic acid；Chlorogenic acid；Geniposide；Drying method；Microwave vacuum freeze drying；Vacuum freeze drying

R283

A

1001-0408（2017）28-3973-04

2017-01-05

2017-04-20）

（編輯：劉 萍）

國家中醫藥管理局公益性行業專項——30味中藥飲片產地加工及飲片生產一體化研究（No.201507002-2）

＊助理研究員，碩士。研究方向：中藥分析與質量標準。E-mail：zyp611@163.com

#通信作者：副主任中藥師。研究方向：中藥制劑與質量標準。E-mail：2541999692@qq.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2017.28.23