老年大鼠學習記憶相關基因egr1表達變化的機制及補腎益氣方藥的調整作用

尹 芳 鄭 靜 康湘萍 張麗娜 金國琴

(上海中醫藥大學基礎醫學院生化教研室，上海 201203)

·基礎研究·

老年大鼠學習記憶相關基因egr1表達變化的機制及補腎益氣方藥的調整作用

尹 芳 鄭 靜 康湘萍 張麗娜 金國琴

(上海中醫藥大學基礎醫學院生化教研室，上海 201203)

目的探討DNA甲基化老年大鼠學習記憶相關基因egr1表達變化的機制及補腎益氣方藥——左歸丸、益氣聰明湯的調整作用。方法以自然衰老(24月齡)SD雄性大鼠為動物模型，隨機分為老年對照組、老年補腎組、老年益氣組、老年合劑組和老年拮抗組，另設一組青年對照組(5月齡)。采用RT-PCR法及Western印跡法觀察大鼠學習記憶相關基因egr1 mRNA和蛋白表達變化，采用亞硫酸氫鹽轉化結合高通量測序法檢測基因egr1啟動子區甲基化狀態，同時觀察補腎益氣方藥對上述指標變化的調整作用。結果與青年對照組相比，老年大鼠egr1 基因mRNA和蛋白表達均明顯降低(P<0.05)，其啟動子區甲基化增高，左歸丸、益氣聰明湯能不同程度地改善egr1的表達，并降低egr1啟動子區甲基化率。結論補腎益氣方藥改善老年大鼠增齡性學習記憶退化可能與抑制基因egr1啟動子DNA甲基化而提高egr1的表達有關。

egr1；DNA甲基化；左歸丸；益氣聰明湯

egr1是早期生長反應egr基因家族的一員，編碼的核轉錄因子對突觸重塑和記憶以及長時程增強效應(LTP)的誘導起到重要作用〔1〕。敲除egr1的小鼠海馬可觀察到短期LTP現象，且持續性LTP受損〔2〕；空間學習記憶實驗中，egr1缺失的小鼠具有完整的短期記憶但長期記憶缺失。Renaudineau等〔3〕研究表明，海馬中egr1是維持空間記憶長期穩定所必須的，而老年大鼠缺失這一過程〔4〕。目前，對增齡性相關基因轉錄變化的機制還不清楚，但有研究表明，突觸重塑和記憶形成過程中DNA甲基化與組蛋白乙酰化的動態調節影響相關基因的轉錄〔5〕。越來越多的證據表明，老年大腦中的表觀遺傳變化影響增齡性相關的認知功能〔6～8〕。例如，活性調節細胞骨架基因(arc)是記憶相關基因，其轉錄因增齡而發生改變，這與arc基因的異常甲基化有關〔6〕。最近有研究發現，老年動物海馬bdnf和egr1核小體組蛋白賴氨酸殘基甲基化水平異常〔8〕。本實驗在以往補腎益氣方藥改善老年大鼠學習記憶退化的實驗基礎上〔9〕，著重觀察補腎益氣對大鼠海馬組織中egr1 mRNA和蛋白表達的影響及egr1 DNA啟動子區甲基化狀態的變化。

1 材料與方法

1.1實驗方藥 左歸丸出自《景岳全書》原方，由熟地黃20 g、山藥10 g、菟絲子10 g、枸杞子10 g、山茱萸10 g、牛膝7.5 g、龜板膠10 g、鹿角膠10 g組成；益氣聰明湯出自《東垣試效方·卷五》，由黃芪15 g、炙甘草15 g、人參15 g、升麻9 g、葛根9 g、蔓荊子4.5 g、芍藥3 g、黃柏3 g組成，以上藥物均購自上海康橋中藥飲片有限公司。將各方藥按傳統方法水煎成劑，并加以濃縮，-30℃保存，臨用前稀釋；合劑以稀釋后的左歸丸藥液與益氣聰明湯藥液等體積混合后飲用。

1.2試劑與儀器 Trizol(Invitrogen公司)，egr1兔抗大鼠多克隆抗體(Abcam公司)，β-actin 兔抗大鼠多克隆抗體(CST公司)，辣根過氧化物酶(HRP)標記山羊抗兔IgG(CST公司)，PrimeScriptTM RT Kit(TaKaRa公司)，SYBR Premix Ex TaqTM Kit(TaKaRa公司)，Genomic DNA-issue MiniPrep(ZYMO公司)，DNA Methylation-Gold Kit(ZYMO公司)，RU38486(Sigma公司)，引物合成(上海英濰捷基公司)，聚偏氟乙烯(PVDF)膜(Milipore公司)，PCR儀(Eppendorf公司)，RT-PCR儀(ABI公司)，蛋白電泳儀、電泳槽、轉移槽(Bio-Rad公司)，凝膠成像分析系統(GBOX CHEMI)，測序(上海英濰捷基公司)。

1.3實驗動物造模及分組 12月齡清潔級、雄性SD大鼠，上海中醫藥大學實驗動物中心提供，隨機分為老年對照組、老年補腎組、老年益氣組、老年合劑組及老年拮抗組，另設青年對照組(5月齡)。自21月齡起，分別給老年補腎組、老年益氣組及老年合劑組大鼠飲用左歸丸、益氣聰明湯及兩方合劑藥液(劑量相當于臨床成人每公斤體重劑量的9倍)，連續應用3個月至24月齡，每周飲藥液5 d、停藥2 d；老年拮抗組于取樣前連續7 d皮下注射皮質酮拮抗劑RU38486(5 mg/kg)〔10〕。

1.4方法

1.4.1egr1 mRNA表達檢測 Trizol試劑提取大鼠海馬總RNA，測定OD260/OD280比值，瓊脂糖凝膠電泳判斷所提取RNA的純度和完整性；測定RNA濃度后分裝，-30℃保存待用。逆轉錄生成cDNA及RT-PCR反應參照試劑盒說明書進行，采用兩步法，熱循環參數：95℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 30 s，40個循環。實驗結果采用ΔΔCt法分析。

1.4.2Western印跡法檢測egr1蛋白表達 分離大鼠海馬、提取蛋白，雙縮脲法定量蛋白，取上清液分裝，-80℃保存。依次進行上樣、電泳、轉膜、封閉及發光檢測，一抗的稀釋比例為1∶200，二抗的稀釋比例為1∶20 000，化學增強發光法(ECL)顯色后凝膠成像分析系統直接成像、拍照，求得積分密度值(IOD)。

1.4.3高通量測序法檢測egr1啟動子區甲基化水平 分離大鼠海馬、提取基因組DNA，組內6個樣本的基因組DNA合并為1個樣本。按照試劑盒說明書對DNA進行亞硫酸氫鈉轉化，非甲基化狀態的胞嘧啶C被轉化為尿嘧啶U，甲基化狀態的胞嘧啶C不會被轉化。UCSC數據庫在線預測egr1基因啟動子區CpG島，設計引物對egr1啟動子區包含CpG島的一段DNA(該DNA片段包含5個CG位點)進行測序。

1.5統計學方法 應用SPSS20.0軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1補腎益氣方藥對老年大鼠egr1 mRNA表達的影響 與青年對照組(0.991±0.011)比較，老年對照組大鼠海馬組織egr1基因mRNA表達(0.322±0.025)明顯降低(P<0.05)；與老年對照組相比，老年補腎組、老年益氣組、老年合劑組和老年拮抗組(0.600±0.044、0.543±0.055、0.518±0.067、0.554±0.048)明顯升高(P<0.05)。

2.2補腎益氣方藥對老年大鼠egr1蛋白表達的影響 與青年對照組(0.516±0.024)比較，老年對照組大鼠海馬組織egr1蛋白表達(0.290±0.017)明顯降低(P<0.05)；與老年對照組相比，老年補腎組、老年益氣組、老年合劑組(0.359±0.010、0.343±0.029、0.334±0.123)明顯升高(P<0.05)，老年拮抗組(0.303±0.016)有升高趨勢但差異無統計學意義(P>0.05)。見圖1。

2.2補腎益氣方藥對老年大鼠egr1基因啟動子CpG島甲基化水平的影響 老年對照組大鼠海馬組織egr1基因啟動子CpG島一段DNA平均甲基化率比青年對照組高，老年補腎組、老年益氣組、老年合劑組比老年對照組低，老年拮抗組比老年對照組高，但差異均無統計學意義(P>0.05)。見表1。

從左至右：青年對照組、老年對照組、老年補腎組、老年益氣組、老年合劑組和老年拮抗組圖1 各組大鼠egr1 蛋白表達變化

組別位點1位點2位點3位點4位點5平均(x±s)青年對照組04.645.363.3502.67±2.54老年對照組2.164.355.473.523.343.77±1.23老年補腎組04.065.163.4302.53±2.39老年益氣組1.915.055.243.231.713.43±1.67老年合劑組03.665.192.9602.36±2.30老年拮抗組2.286.265.373.262.213.88±1.85

3 討 論

健康大鼠在其記憶形成和突觸重塑的認知過程中需要即刻早期生長反應蛋白(IEGs)，抑制這些基因的表達后認知正常動物的記憶也會受損，記憶相關疾病和正常衰老過程中伴隨IEG的異常表達〔11〕。DNA甲基化是調控中樞神經系統基因表達的機制，而衰老與大腦中特殊基因的甲基化修飾有關，其中包括egr1〔8〕。本研究中就單個CG位點甲基化率的檢測結果表明：第1、5位點在不同實驗組中的甲基化率變化明顯，老年組的第3、4位點甲基化率最高，轉錄因子數據庫JASPAR預測顯示，位點1位于轉錄因子Pax-5的DNA結合序列中，位點5位于核轉錄因子NF-1的DNA結合序列中，位點3、4位于核轉錄因子Sp1/Sp3的DNA結合序列中，這些核轉錄因子可促進靶基因的轉錄。由此表明，CG位點的甲基化狀態直接影響轉錄因子Pax-5、Sp1、Sp3、NF-1與啟動子區DNA的結合，進而影響基因egr1轉錄乃至翻譯。

中醫認為，老年性學習記憶的減退屬于“健忘”范疇，其病位在腦而本于腎。腎藏精生髓，腦為髓之海。腎強髓充則元神精湛而記憶不怠；髓海不足，腦失充養，則神明呆滯而引起學習記憶功能減退甚至障礙。左歸丸出自明代《景岳全書·新八方陣》，是明代張仲景根據陰陽互補原理研制的“滋補腎陰”的經典補腎方藥，八藥合用，共湊滋陰補腎、填精益髓之功效。益氣聰明湯出自宋金時期著名醫家李杲所著的《東垣試效·方卷五》，“聰明”者，為視聽靈敏，聰穎智慧之意，此方可使中氣得到補益，從而清陽上升，肝腎受益，耳聰目明，神旺腦健。脾胃為“后天之本，氣血生化之源”，脾健氣足是健腦的重要條件，腎精的充盈賴于脾胃化生的水谷精微儒養。

脾腎相濟精足氣盛是神旺腦健的重要物質基礎。本實驗結果進一步證明了補腎益氣方藥改善老年大鼠學習記憶功能退化的分子機制可能與抑制DNA基因啟動子區域CpG島甲基化修飾、提高學習記憶相關基因egr1 mRNA和蛋白表達有關。

1Haberman RP，Colantuoni C，Stocker AM，etal.Prominent hippocampal CA3 gene expression profile in neurocognitive aging〔J〕.Neurobiol Aging，2011；32(9)：1678-92.

2Jones MW，Errington ML，French PJ，etal.A requirement for the immediate early gene Zif268 in the expression of late LTP and longterm memories〔J〕.Nat Neurosci，2001；4(3)：289-96.

3Renaudineau S，Poucet B，Laroche S，etal.Impaired long-term stability of CA1 place cell representation in mice lacking the transcription factor zif268/egr1〔J〕.Proc Natl Acad Sci，2009；106(28)：11771-5.

4Rosenzweig ES，Barnes CA.Impact of aging on hippocampal function：plasticity，network dynamics，and cognition〔J〕.Prog Neurobiol，2003；69(3)：143-79.

5Day JJ，Sweatt JD.Epigenetic mechanisms in cognition〔J〕.Neuron，2011；70(5)：813-29.

6Penner MR，Roth TL，Chawla MK，etal.Age-related changes in Arc transcription and DNA methylation within the hippocampus〔J〕.Neurobiol Aging，2011；32(12)：2198-210.

7Oliveira AM，Hemstedt TJ，Bading H.Rescue of aging-associated decline in Dnmt3a2 expression restores cognitive abilities〔J〕.Nat Neurosci，2012；15(8)：1111-3.

8Morse SJ，Butler AA，Davis RL，etal.Environmental enrichment reverses histone methylation changes in the aged hippocampus and restores age-related memory deficits〔J〕.Biology，2015；4(2)：298-313.

9康湘萍，金國琴.補腎方藥對老年大鼠學習記憶退化的影響〔J〕.中華中醫藥雜志，2012；27(4)：981-6.

10Xu L,Holscher C,Anwyl R,etal.Glucocorticoid receptor and protein/RNA synthesis-dependent mechanisms underline the control of synapticplasticity by stress〔J〕.Neurobiology，1998；95：3204-8.

11Chawla MK，Penner MR，Olson KM，etal.Spatial behavior and seizure-induced changes in c-fos mRNA expression in young and old rats〔J〕.Neurobiol Aging，2013，34(4)：1184-98.

〔2017-02-09修回〕

(編輯 袁左鳴)

R28

A

1005-9202(2017)19-4689-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.19.001

國家自然科學基金面上項目(81473583)

金國琴(1961-)，女，碩士，教授，博士生導師，主要從事中藥延緩衰老與預防老年病研究。

尹 芳(1986-)，女，在讀博士，主要從事中藥延緩衰老的研究。