肥胖小鼠良性前列腺增生模型的建立

向玖琳 王 茹 陳 廷 楊 欽 劉向云

(上海市人類運(yùn)動能力開發(fā)與保障重點(diǎn)實驗室 運(yùn)動健身科技省部重點(diǎn)實驗室 上海體育學(xué)院，上海 200438)

肥胖小鼠良性前列腺增生模型的建立

向玖琳 王 茹 陳 廷 楊 欽 劉向云

(上海市人類運(yùn)動能力開發(fā)與保障重點(diǎn)實驗室 運(yùn)動健身科技省部重點(diǎn)實驗室 上海體育學(xué)院，上海 200438)

目的構(gòu)建肥胖小鼠良性前列腺增生的動物模型。方法SPF級C57BL/6J小鼠28只,取8只小鼠作為對照組(C組)喂養(yǎng)普通飼料，剩余的20只小鼠為高脂誘導(dǎo)肥胖組(Dio組)喂食高脂飼料，構(gòu)建肥胖小鼠良性前列腺增生的模型。酶聯(lián)免疫法檢測血糖血脂、血清雌二醇(E2)和睪酮(T)；水取代法檢測前列腺體積；HE染色檢測前列腺組織病理變化；IPP圖像分析軟件統(tǒng)計前列腺腺腔面積和上皮高度。結(jié)果實驗第9周，高脂喂養(yǎng)后有12只小鼠達(dá)到肥胖標(biāo)準(zhǔn)(為Ob組)，肥胖率為60%。Ob組小鼠體重、內(nèi)臟脂肪重量明顯大于C組(P<0.05)，前列腺重量、前列腺指數(shù)、體積、面積和上皮高度明顯大于C組(P<0.05)；Ob組E2水平高于C組(P>0.05)，T水平低于C組(P>0.05)，而雌雄激素(E2/T)比值Ob組大于C組(P<0.05)；前列腺組織病理切片顯示Ob組小鼠前列腺發(fā)生增生的病理變化。結(jié)論肥胖小鼠發(fā)生了前列腺增生。

肥胖小鼠；良性前列腺增生；前列腺體積；前列腺指數(shù)

良性前列腺增生(BPH)是老年男性最常見的疾病之一,年齡、生活方式等是BPH的重要原因,60～69歲的男性BPH發(fā)病率為70%，70歲以上的男性BPH的發(fā)病率為80%〔1〕。因此，探索BPH的發(fā)病機(jī)制，對提高老年男性的生活質(zhì)量具有重大意義。國內(nèi)外多項研究發(fā)現(xiàn)肥胖與BPH密切相關(guān)，體重、身高、腰圍以及腰臀比是BPH的風(fēng)險因子〔2～4〕。體質(zhì)量指數(shù)(BMI)較高的男性人群BPH發(fā)生率較高，BMI每增加1 kg/m2,前列腺總體積增加0.41 ml〔3,5〕。據(jù)查閱文獻(xiàn)，目前尚未見研究報道肥胖BPH的小鼠模型。因此，建立一種理想的肥胖患者前列腺增生的動物模型，對肥胖BPH的發(fā)生機(jī)制探索，藥物研發(fā)和運(yùn)動干預(yù)療法等研究有重大的意義。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 SPF級C57BL/6J小鼠28只,雄性，體重(16.16±0.90)g，4周齡，購自上海靈暢生物科技有限公司〔SCXK(滬)2013-0018〕。飼養(yǎng)條件:SPF級動物房(合格證號：SYXK(滬)2014-0002)，室溫21℃～23℃，濕度40%～60%，12 h明暗循環(huán)，每籠4只共7籠，自由進(jìn)食水。

1.1.2主要試劑、儀器 Mouse Blood Glucose ELISA Kit(Catalog#CK-E00592M)，HDL and LDL/VLDL Quantitation Kit(Catalog#MAK045-1KT)，Triglyceride Quantification Colorimetric/FluorometricKit(Catalog#K622-100),Estradiol Parameter Assay Kit(Catalog#KGE014),Testosterone Parameter Assay Kit(Catalog #KGE010)均購自上海優(yōu)寧維生物科技有限公司；BioTek EON酶標(biāo)儀(BioTek Corporation,Vermont,USA) ；BX53F顯微鏡(Olympus Cooperation,Tokyo,Japan)。

1.2方法

1.2.1小鼠分組及模型制作 適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w，一般情況下，高脂喂養(yǎng)8 w后有40%的小鼠可達(dá)到肥胖標(biāo)準(zhǔn)〔6〕，肥胖標(biāo)準(zhǔn)〔7〕：肥胖建模組體重超過對照組體重平均值20%。因此，根據(jù)3R原則以及肥胖成功率，取8只作為對照組(C組)，體重(17.79±0.86)g，給予普通飼料喂養(yǎng)，剩余的20只小鼠作為高脂誘導(dǎo)肥胖組(Dio組)，體重(18.01±0.84)g，給予60%高脂飼料，以期有8只(即20×40%=8只)小鼠達(dá)到肥胖標(biāo)準(zhǔn),每周進(jìn)行小鼠稱重，連續(xù)8 w。普通飼料購于上海杰思捷實驗動物有限公司。高脂飼料(D12492,Research Diets Company,CAN)購自福貝世亨生物醫(yī)藥(上海)有限公司，能量供應(yīng)比kcal%：蛋白質(zhì)20%、糖類20%、脂肪60%。

1.2.2解剖取材 第9周末稱重，Dio組高脂喂養(yǎng)后有12只小鼠達(dá)到肥胖標(biāo)準(zhǔn)，肥胖率為60%，作為肥胖模型組(Ob組)。剔除8只肥胖造模不成功的小鼠，Ob組取8只(其余4只肥胖小鼠以備后續(xù)實驗進(jìn)行運(yùn)動干預(yù))和C組8只小鼠進(jìn)行解剖取材。在取血前一晚禁食12 h，眼眶取血，4℃，3 000 r/min低溫離心15 min，吸取血清儲存于-80℃?zhèn)溆谩Ｈ缓笕「闻K周圍脂肪和附睪脂肪，內(nèi)臟脂肪水分吸干后稱重。解剖前列腺組織水分吸干稱重,計算前列腺指數(shù)(前列腺重量mg/小鼠體重g)，并用水取代法測量前列腺組織體積〔8〕，即用兩個滴管和一根橡膠管制作成“U”型管，注入生理鹽水至統(tǒng)一刻度，當(dāng)放入前列腺組織至一側(cè)后并調(diào)回至以前刻度，用對側(cè)上升的刻度減去原來統(tǒng)一的刻度即為前列腺體積值。然后取出前列腺組織固定于4%的多聚甲醛。

1.2.3血清指標(biāo)檢測 采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測血清中甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、睪酮(T)、雌二醇(E2)水平。

1.2.4前列腺組織病理學(xué)檢查 小鼠前列腺切片，厚度4 μm，蘇木素-伊紅染色(即HE染色)，切片用Olympus顯微鏡(Olympus Cooperation,Tokyo,Japan，BX53F)進(jìn)行病理學(xué)觀察并拍片。每張切片隨機(jī)抽取5個高倍視野(×40)，每組8個前列腺切片，共40個視野，用IPP(Image-Pro Plus,IPP)圖像統(tǒng)計軟件(Media Cybernetics,Silver Spring,MD,USA,version 6.0)統(tǒng)計腺腔面積和上皮高度〔9〕。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS20.0軟件(IBM COMPANY,USA)行獨(dú)立樣本t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1小鼠體重和前列腺系數(shù)變化 小鼠的初始體重(16.16±0.90)g，第9周時，Dio組有60% 即12只小鼠達(dá)到肥胖標(biāo)準(zhǔn)(為Ob組)。Ob組肥胖小鼠與C組小鼠體重分別為(34.16±1.03)g和(25.83±1.06)g，兩組之間具有統(tǒng)計學(xué)差異(t=-21.195，P<0.05),圖1為兩組小鼠平均體重曲線圖，Ob組小鼠體重增長速度大于C組。兩組之間內(nèi)臟脂肪分別為(2.08±0.27)g和(0.41±0.07)g，具有顯著性差異(t=-16.792，P<0.05)。體重、腹腔脂肪重量等是判斷肥胖的主要標(biāo)準(zhǔn)，Ob組小鼠體重、內(nèi)臟脂肪重量與C組相比均有顯著差異，從形態(tài)學(xué)表明達(dá)到肥胖標(biāo)準(zhǔn)〔7〕，肥胖率為60%。Ob組與C組前列腺重量分別為(116.38±27.71)mg和(44.38±9.86)mg，兩組比較具有統(tǒng)計學(xué)差異(t=-6.925，P<0.05)。Ob組與C組前列腺指數(shù)分別為(3.44±0.82)和(1.72±0.37)，兩組之間具有統(tǒng)計學(xué)差異(t=-6.775，P<0.05)。Ob組和C組小鼠前列腺體積分別為(0.12±0.03)ml和(0.03±0.01)ml，兩組間具有統(tǒng)計學(xué)差異(t=-5.434，P<0.05)。

與C組比較：1)P<0.05圖1 肥胖小鼠體重增長曲線圖

2.2血糖血脂變化 小鼠經(jīng)過8 w的高脂喂養(yǎng)后，Ob組和C組小鼠血糖濃度分別為(7.79±0.84)nmol/μl和(6.60±0.94)nmol/μl，具有統(tǒng)計學(xué)差異(t=-2.659,P<0.05)。Ob組和C組TG分別為(1.31±0.18)nmol/μl和(1.16±0.24)nmol/μl,血清LDL-C分別為(0.13±0.04)ng/μl和(0.10±0.03)ng/μl，雖然兩組之間甘油三酯和低密度脂蛋白水平無明顯差異(t=-1.495，-1.396；P=0.157，0.185)，但是Ob組有升高的趨勢；Ob組和C組HDL-C分別為(0.43±0.01)ng/μl和(0.36±0.07)ng/μl，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=-2.881，P<0.05)。

2.3前列腺組織病理學(xué)變化 在病理學(xué)檢查中，通過顯微鏡觀察各組中每只小鼠的前列腺組織切片，發(fā)現(xiàn)C組小鼠前列腺無增生相關(guān)的變化特點(diǎn)。Ob組小鼠前列腺上皮細(xì)胞呈柱狀、高柱狀，腺腔面積增加,腺上皮高度增加。大量乳頭狀增生突向腺腔內(nèi)，腺腔內(nèi)可見分泌物。腺體周圍附著大量脂肪組織。同時用IPP圖像分析軟件統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)Ob組前列腺腺腔面積(17 629.73±4 966.57)μm2和上皮高度(14.35±4.96)μm,均大于C組腺腔面積(12 447.93±5 600.36)μm2和上皮高度(9.90±2.97)μm，兩組具有統(tǒng)計學(xué)差異(t=-4.378，-4.866；P=0.000)。見圖2。

2.4小鼠雌雄激素變化 Ob組E2水平為(0.049±0.012)ng/ml，高于C組(0.045±0.009)ng/ml(t=-0.550,P>0.05)，Ob組T水平為(1.850±0.505)ng/ml，低于C組(2.043±0.448)ng/ml,雖無統(tǒng)計學(xué)差異(t=0.777，P>0.05)，但Ob組E2水平呈上升的趨勢，T水平呈下降趨勢，且Ob組E2/T比值(0.036±0.008)明顯大于C組(0.022±0.010)(t=-2.428，P<0.05)。

圖2 小鼠前列腺組織HE染色結(jié)果(×200)

3 討 論

高脂飼料誘導(dǎo)肥胖的方法是肥胖相關(guān)研究中應(yīng)用的最廣的建模方法，其誘導(dǎo)的單純性肥胖模型與人類的單純性肥胖相似性很高〔10〕。近年研究發(fā)現(xiàn)肥胖引發(fā)的代謝綜合征可能是引發(fā)BPH的主要因素之一〔11～13〕。一定程度的新陳代謝紊亂會驅(qū)使BPH的病理變化，越來越多的證據(jù)闡明增加的脂肪，血糖紊亂，高密度脂蛋白膽固醇，以及低密度脂蛋白膽固醇與BPH具有密切聯(lián)系〔2,3〕。研究者將肥胖、糖尿病、高脂血癥、高血壓等與前列腺增生合并于代謝綜合征〔14〕。并且已有研究成功造模高脂血癥合并前列腺增生大鼠模型，以及糖尿病合并前列腺增生大鼠模型〔15,16〕。肥胖是代謝綜合征發(fā)病的病理生理學(xué)基礎(chǔ)〔17〕。肥胖，特別是BMI≥35 kg/m2的肥胖患者與前列腺增生關(guān)聯(lián)更高〔3〕。實驗對小鼠進(jìn)行8 w的高脂飼料喂養(yǎng)后，小鼠的體重及內(nèi)臟脂肪重量的增加從形態(tài)學(xué)表明達(dá)到肥胖標(biāo)準(zhǔn)〔8〕。肥胖組糖脂水平具有上升的趨勢，與一些流行病調(diào)查研究相吻合。前列腺組織重量和體積增大，并呈現(xiàn)出增生變化，導(dǎo)致肥胖小鼠發(fā)生前列腺增生病理變化。

肥胖是由于體內(nèi)脂肪過度堆積并引發(fā)以糖脂代謝紊亂為主的代謝性疾病，隨著時間的延長和脂肪堆積加劇，進(jìn)一步引發(fā)很多其他疾病〔18〕。肥胖可導(dǎo)致血糖升高，降低高密度脂蛋白水平，增加低密度脂蛋白水平以及膽固醇水平等脂代謝紊亂變化，而長期的糖脂代謝紊亂會增加前列腺增生的風(fēng)險〔19〕。血糖增高易累及微小血管損傷，改變局部微循環(huán)，以及通過誘導(dǎo)雄激素高表達(dá)、生長因子表達(dá)刺激前列腺上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞增生〔20,21〕，血糖濃度是前列腺增大的風(fēng)險因子〔5〕。基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)高脂喂養(yǎng)的高血脂大鼠出現(xiàn)低密度脂蛋白增高，前列腺增大和膀胱過度活動以及勃起功能障礙，闡明新陳代謝與BPH的生理上聯(lián)系〔15〕。Vignozzi等〔22〕發(fā)現(xiàn)高脂喂養(yǎng)動物具有性腺機(jī)能衰退和新陳代謝紊亂相關(guān)的特點(diǎn)。高脂飲食影響前列腺病理變化，如腺體的炎癥狀態(tài)和肌纖維化、組織缺氧〔23〕。

性激素紊亂是導(dǎo)致前列腺增生的主導(dǎo)因素已被大量研究證實。前列腺的生長依賴于雌、雄激素的協(xié)同作用,雌、雄激素的比例失衡是前列腺增生發(fā)生和進(jìn)展的原因之一〔24〕。E2/T的比值增高有可能是模型小鼠BPH發(fā)生的又一機(jī)制，肥胖也可能通過對性激素水平的影響而加速前列腺組織的增生。Tindall等〔25〕報道肥胖影響多種激素的代謝,其中包括雄性激素在脂肪組織中經(jīng)芳香化轉(zhuǎn)變成雌性激素。Gat等〔26〕提出肥胖者腹內(nèi)壓比較高，影響前列腺組織靜水壓高，會阻礙前列腺與睪丸的靜脈回流，從而導(dǎo)致睪丸內(nèi)睪酮濃度增加，前列腺睪酮濃度減少，進(jìn)而促使前列腺增生發(fā)生。

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〔2017-02-15修回〕

(編輯 徐 杰)

R3

A

1005-9202(2017)19-4700-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.19.005

國家自然科學(xué)基金資助項目(81472148)；上海市體育局科技綜合計劃項目(Z022)

劉向云(1976-)，女，副教授，博士，碩士生導(dǎo)師，主要從事運(yùn)動醫(yī)學(xué)研究。

向玖琳(1990-)，女，碩士，主要從事運(yùn)動醫(yī)學(xué)研究。