老年重癥肌無力患者Treg、APO-1、RyR-Ab、干擾素-αAb、AchR-Ab的水平變化及意義

董禮全 劉艷萍 徐 東 彭忠民 馬春燕 潘旭東

(威海市立醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，山東 威海 264200)

老年重癥肌無力患者Treg、APO-1、RyR-Ab、干擾素-αAb、AchR-Ab的水平變化及意義

董禮全 劉艷萍 徐 東1彭忠民2馬春燕3潘旭東4

(威海市立醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，山東 威海 264200)

目的探討老年重癥肌無力(MG)患者外周血Treg、APO-1、RyR-Ab、干擾素(IFN)-αAb、AchR-Ab的表達及意義。方法采用流式細胞術(shù)和酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定MG患者和健康者Treg、APO-1、RyR-Ab、IFN-αAb、AchR-Ab的表達情況。結(jié)果老年組外周血Treg明顯低于非老年組(P<0.05)。老年組外周血APO-1、RyR-Ab、IFN-αAb明顯高于非老年組和健康對照組(P<0.05)。老年組外周血AchR-Ab明顯高于健康對照組(P<0.05)，與非老年組無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。MG患者RyR-Ab、IFN-αAb與年齡呈正相關(guān)，RyR-Ab與Oosterhuis評分呈正相關(guān)。結(jié)論老年MG患者與非老年患者免疫機制存在差異，檢測老年MG患者免疫指標對臨床判斷病情有指導(dǎo)意義。

重癥肌無力；調(diào)節(jié)性T細胞；APO-1；RyR-抗體；干擾素-α抗體

重癥肌無力(MG)是一種自身免疫性疾病，有多種抗體和補體參與其發(fā)病。CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞(Treg)作為一種免疫細胞在多種免疫性疾病中發(fā)揮作用，其一方面具有抑制存在于正常機體內(nèi)潛在的大量自身反應(yīng)性T細胞的活化與增殖的功能，另一方面有維持免疫耐受，抑制發(fā)生自身免疫病的功能。Treg起源于人類胸腺，而MG患者常伴胸腺異常，如胸腺增生、胸腺瘤等〔1〕。但Treg在MG中的具體作用機制尚不明確，它與發(fā)病、病情轉(zhuǎn)歸、患者年齡、性別、類型的關(guān)系均不明確。凋亡因子APO-1在多種免疫相關(guān)疾病中發(fā)生改變，國外學(xué)者發(fā)現(xiàn)MG患者Treg細胞存在APO-1高表達的情況〔2〕，國內(nèi)尚未見類似報道。國外研究顯示MG患者Ryanodine受體抗體(RyR-Ab)和干擾素-α抗體(IFN-αAb)異常〔3，4〕，國內(nèi)研究甚少。MG有青年和老年兩個發(fā)病高峰，老年患者男性多，伴有胸腺腫瘤多。國內(nèi)外對老年MG的研究甚少，本研究利用流式細胞術(shù)和ELISA對MG患者外周血 Treg、APO-1、RyR-Ab、IFN-αAb 進行同時測定，并探討其意義。

1 資料和方法

1.1一般資料 87例MG患者中男41例,女46例，老年組(≥60歲)35例，男18例,女17例,年齡60～72(平均68.5)歲,病程1～25(平均15.9)個月。根據(jù)改良Osserman分型：Ⅰ型10例，Ⅱa型10例，Ⅱb型11例，Ⅲ型1例，Ⅳ型3例。根據(jù)Oosterhuis 5分評定法對肌無力嚴重程度評分，其中0分0例，1分10例，2分10例，3分11例，4分4例，5分0例。非老年組(<60歲)52例，男23例,女29例,年齡13～59(平均31.5)歲,病程1～21(平均14.3)個月。根據(jù)改良Osserman分型：Ⅰ型23例，Ⅱa型19例，Ⅱb型6例，Ⅲ型1例，Ⅳ型3例。根據(jù)Oosterhuis 5分評定法對肌無力嚴重程度評分，其中0分0例，1分23例，2分19例，3分6例，4分4例，5分0例。健康對照組30例，男12例,女18例，年齡20～76(平均42.2)歲。均排除神經(jīng)系統(tǒng)及自身免疫系統(tǒng)疾病。

1.2實驗材料 清晨空腹肘靜脈采血5 ml，其中3 ml促凝，迅速分離出血清，置于-70℃保存?zhèn)溆茫? ml EDTA抗凝，6 h內(nèi)流式細胞術(shù)檢測。

1.3Treg及APO-1檢測 EPICS XL-4型流式細胞儀進口于美國貝克曼公司，Optilyse C溶血素，小鼠抗人熒光單抗CD25-FITC、CD4-PE-Cy5及同型對照進口于法國Immunotech公司。小鼠抗人熒光單抗CD95-PE及同型對照購于晶美生物公司。抗體組合為CD25-FITC、CD95-PE、CD4-PE-Cy5。以FS-SS設(shè)門分析外周血Treg和APO-1的表達。

1.4RyR-Ab測定 參照Meis等〔5〕的方法，牛血清白蛋白購于美國Sigma公司，辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗人IgG抗體購于美國KPL公司。以大于健康對照組所測 A450的均值加上2倍標準差為RyR-Ab陽性。

1.5IFN-αAb測定 利用改良酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)按照IFN-αAb試劑盒1R310(美國RB公司)說明書進行，測定波長450 nm處吸光度值。

1.6AchR-Ab的測定 操作過程參照文獻〔6〕,結(jié)果判斷：以正常對照組實際測得的AchR-Ab光密度(OD492 nm)均值+3SD以上者為陽性。

1.7統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行t檢驗或秩和檢驗，χ2檢驗及Spearman相關(guān)分析。

2 結(jié) 果

2.1各組外周血各指標比較 老年組外周血Treg明顯低于非老年組(P<0.05)。老年組外周血APO-1、RyR-Ab、IFN-αAb勻明顯高于非老年組和健康對照組(P<0.05)。老年組外周血AchR-Ab高于健康對照組(P<0.05)，與非老年組無明顯差異(P>0.05)。見表1。

表1 各組外周血Treg、APO-1、RyR-Ab、IFN-αAb、 AchR-Ab水平比較

與老年組比較：1)P<0.05

2.2各指標相關(guān)性分析 MG患者RyR-Ab(r=0.454，P<0.01)，IFN-αAb與患者年齡呈正相關(guān)(r=0.485，P<0.01)。Treg(r=0.037,P=0.358)、APO-1(r=0.077,P=0.179)和AchR-Ab(r=0.136,P=0.557)與患者年齡不相關(guān)。RyR-Ab與Oosterhuis評分呈正相關(guān)(r=0.573，P<0.01)。Treg(r=0.170,P=0.173)、APO-1(r=0.093,P=0.231)、IFN-αAb(r=0.129,P=0.553)和AchR-Ab(r=0.071,P=0.218)與Oosterhuis評分無明顯相關(guān)性。

3 討 論

研究提示MG與老年男性胸腺瘤發(fā)病有關(guān)〔7〕，Treg具有免疫抑制功能，其特征性地表達CD25，可以分泌細胞因子白細胞介素(IL)-10和轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β等。目前研究認為Treg主要通過對于自身抗原或同種異體抗原所激活的CD4+、CD8+T細胞有明確的抑制作用而發(fā)揮其免疫調(diào)劑功能〔8〕。本研究發(fā)現(xiàn)老年組外周血Treg明顯低于非老年組。APO-1為分子量為45 kD的凋亡因子，屬于腫瘤壞死因子(TNF)受體家族，一般表達于胸腺細胞、T、B細胞等表面。凋亡異常可能導(dǎo)致胸腺細胞、T、B細胞等免疫功能失控〔9〕。而本實驗結(jié)果并沒有發(fā)現(xiàn)APO-1與患者年齡及Oosterhuis評分相關(guān)，推測可能的原因是APO-1升高后與其配體結(jié)合而消耗，也可能與患者實際發(fā)病時段的具體病情有關(guān)。MG患者血清中還存在多種抗體？RyR是體內(nèi)最重要Ca2+通道蛋白，可瞬間釋放大量Ca2+而引起肌肉收縮〔10〕。本研究發(fā)現(xiàn)，老年組RyR-Ab明顯高于非老年組和健康對照組，此抗體可阻止Ca2+通道蛋白開放。 RyR-Ab表達情況與Oosterhuis評分呈顯著正相關(guān)，說明RyR-Ab在老年患者體內(nèi)更高，并且對老年MG病情的評估有參考意義。IFN-α具有抗腫瘤作用，主要由白細胞產(chǎn)生〔11〕。IFN-αAb可中和IFN-α的抗腫瘤作用。IFN-αAb與患者年齡正相關(guān)。老年患者IFN-αAb增高可能與老年男性MG患者伴有胸腺瘤較多有關(guān)。IFN-αAb與Oosterhuis評分無明顯相關(guān)性。MG患者體內(nèi)存在細胞及體液免疫紊亂，老年MG患者Treg、APO-1、RyR-Ab、IFN-αAb、AchR-Ab較高，其中只有RyR-Ab、IFN-αAb與患者年齡正相關(guān)，提示MG并非如腦血管病、變性病等年齡相關(guān)性疾病，老年患者標記物的升高提示MG在老年存在一個發(fā)病小高峰。這種發(fā)病率并非與年齡正相關(guān)，并且60歲以上中老年患者免疫記憶細胞敏感性高，容易形成抗體。而體內(nèi)吞噬細胞功能相對減退，免疫復(fù)合物清除慢，也是抗體高的原因。

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〔2016-04-23修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)

R746.1

A

1005-9202(2017)19-4882-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.19.088

山東省自然科學(xué)基金(No.Y2002C13)

1 山東大學(xué)附屬山東省立醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 2 山東大學(xué)附屬山東省立醫(yī)院胸外科 3 山東大學(xué)附屬山東省立醫(yī)院中心實驗室 4 青島大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科

潘旭東(1963-)，男，博士，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，主要從事動脈硬化研究。

董禮全(1980-)，男，博士，主治醫(yī)師，主要從事動脈硬化研究。