柑橘皮揮發(fā)油提取及HPLC測定柑橘皮揮發(fā)油中的檸檬烯含量

丁潔+沙芮+王愛霞+錢瀅文+牛犇+高俊+梁寧

摘要：試驗優(yōu)化了水蒸氣蒸餾法提取柑橘皮揮發(fā)油條件，通過正交試驗確定最佳工藝參數(shù)為浸泡時間 1 h，提取時間3.0 h，加水量800 mL，粉碎目數(shù)30目。采用氣相色譜法，色譜柱HP-5（30 m×320 μm×0.25 μm），測得5批不同產(chǎn)地柑橘皮揮發(fā)油含量在1.30%～1.98%，檸檬烯質(zhì)量分數(shù)在75%～95%。該方法簡便，準確，重復(fù)性好，可用于檸檬烯含量的測定。

關(guān)鍵詞：柑橘皮；揮發(fā)油；檸檬烯；氣相色譜

中圖分類號：S666.2；O657.7+1 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）17-3326-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.17.035

Citrus Essential Oil Extraction and HPLC Determination of the Limonene Content of Essential Oil in Orange Peel from Different Habitats

DING Jie1，SHA Rui1，WANG Ai-xia2，QIAN Ying-wen1，NIU Ben1，GAO Jun2，LIANG Ning1

（1.Commercial Technology Institute of Gansu Province，Lanzhou 730020，China；

2.The People's Hospital of Gansu Province，Lanzhou 730000，China）

Abstract： The conditions of extracting volatile oil from citrus peel by steam distillation method were optimized and determined. By orthogonal experiment，the optimal conditions for the extraction were the soaking time 1 h，extracting time 3 h，quantity of water 800 mL， smashing mesh 30. Through gas chromatography and with a column HP-5（30 m×320 μm× 0.25 μm），the experiment measured that the content of volatile oil in 5 batches of citrus peel from different habitats ranged from 1.3% to 1.98%， and limonene mass fraction was between 75% and 95%. The method was proved to be simple， accurate and reproducible， which can be used in determination of the content of limonene.

Key words： citrus peel； volatile oil； limonene； gas chromatography

中國是柑橘類水果生產(chǎn)大國，每年產(chǎn)量高達3 200萬t，每噸柑橘類水果可產(chǎn)鮮皮0.25 t[1]，每噸柑橘類鮮皮含揮發(fā)油30 kg[2]。柑橘皮除了部分用于中藥陳皮，有少部分用于調(diào)味料外，其余絕大部分廢棄。按鮮果皮中揮發(fā)油含量1%～3%計算[3]，每年有大約8萬～24萬t揮發(fā)油被廢棄。

柑橘皮揮發(fā)油主要成分為：單萜烯、倍半萜烯和含氧芳香烴3大類組成[4]。單萜烯是柑橘皮類揮發(fā)油的主要成分，以D-檸檬烯（D-Limonene）為主，還有γ-松油烯（γ-Terpinene）、β-月桂烯（β-Myrcene）、α-蒎烯（α-Pinene）[5]。柑橘皮類揮發(fā)油具有祛痰、止咳、平喘、促進胃腸蠕動、促進消化液分泌、鎮(zhèn)痛、溶解膽結(jié)石、抗菌消炎和去除自由基等作用[6]，既是飲料、糕點類食品的天然調(diào)味劑，又是香水、牙膏、皂類等日用品的天然香味劑[7，8]。柑橘皮類揮發(fā)油的藥用價值還能增強心臟的收縮力、擴張冠狀動脈、增加冠狀動脈血流量、降低毛細血管通透性。同時具有維生素P的作用，能擴張支氣管，平喘、促進消化液分泌與排除腸內(nèi)積氣等作用，但大劑量則有抑制作用和刺激性[9]。揮發(fā)油能松弛支氣管平滑肌，水提物或揮發(fā)油均能阻斷或解除氯化乙酞膽堿或磷酸組胺所致的支氣管平滑肌的收縮痙攣[10]。陳皮水煎劑有促進小鼠胃排空、降低小鼠胃殘留率及促進小腸推進等作用[11]。水煎劑能促進呼吸道分泌，具有明顯的祛痰[8]、有強心、抗休克及升壓等作用[12，13]。

由于以上諸多藥用價值，本試驗對不同產(chǎn)地鮮柑橘皮類揮發(fā)油提取率和陳皮揮發(fā)油提取率進行比較，并采用氣相色譜和標準品對不同產(chǎn)地柑橘皮揮發(fā)油中主要成分檸檬烯進行測定，旨在為今后大規(guī)模開發(fā)柑橘皮揮發(fā)油的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

柑橘（購自蘭州市水果市場，并記錄產(chǎn)地），陳皮（購自廣西南寧），純水[自制，pH 6.82，電導(dǎo)率15 μs/cm（27 ℃）]，二氯甲烷（色譜純，天津市凱信化學(xué)工業(yè)有限公司，批號：20140121），石油醚（分析純，沸程：60～90 ℃，天津市化學(xué)試劑一廠，批號：040606），（R）-（+）-檸檬烯（Dr.Ehenstorfer，德國，批號：5989-27-5，純度：99.7%）。

7890B型氣相色譜儀（安捷倫，美國）；SB5200DTNendprint

超聲波儀（寧波新芝生物科技）；XS225A型電子分析天平（普利塞斯，瑞士）；優(yōu)普UPT-I-20L落地式純水機（四川優(yōu)普超純科技）。

1.2 方法

1.2.1 單因素試驗 選用水蒸氣蒸餾法提取柑橘皮揮發(fā)油，取打碎的新鮮橘皮300 g加入2 000 mL圓底燒瓶中，加一定量純水，安裝揮發(fā)油提取器、球形冷凝管并加熱沸騰回流，提取揮發(fā)油，靜置待揮發(fā)油澄清透明，計算提取率[14]。以浸泡時間、提取時間、溶劑量、粉碎目數(shù)為單因素，通過試驗確定每種因素中較優(yōu)的水平，讀取揮發(fā)油體積數(shù)。每個樣品做3個平行樣，結(jié)果取其平均值。

1）浸泡時間。固定提取時間2.0 h，溶劑量800 mL，粉碎目數(shù)20目，設(shè)置浸泡時間1、2、3、4 h。

2）提取時間。固定浸泡時間2 h，粉碎目數(shù)20目，溶劑量800 mL，設(shè)置提取時間0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 h。

3）溶劑量。固定浸泡時間2 h，提取時間2.0 h，粉碎目數(shù)20目，設(shè)置溶劑量400、600、800、1 000 mL。

4）粉碎目數(shù)。固定浸泡時間2 h，溶劑量800 mL，提取時間2.0 h，設(shè)置粉碎目數(shù)10、20、30、40目。

1.2.2 正交試驗設(shè)計 為了同時考察各因素對柑橘皮揮發(fā)油提取的影響，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選擇浸泡時間、提取時間、溶劑量、粉碎目數(shù)4種影響因素按4因素3水平進行L9（34）正交試驗設(shè)計，因素水平見表1。

1.3 不同產(chǎn)地柑橘皮揮發(fā)油提取

取不同地區(qū)新鮮橘皮300 g，粉碎后加入2 000 mL圓底燒瓶中，安裝揮發(fā)油提取器、球形冷凝管并加熱沸騰回流，按照最佳工藝條件，提取揮發(fā)油，靜置待揮發(fā)油澄清透明，每個地區(qū)橘皮樣品設(shè)置3次重復(fù)，計算提取率，取平均值。

揮發(fā)油提取率=V/M×100%，式中，V為提取出揮發(fā)油的體積（mL），M為橘皮質(zhì)量（g）。

1.4 樣品制備

1.4.1 標準品溶液配制 精密稱取檸檬烯標準品0.056 7 g置于10 mL容量瓶中，加二氯甲烷定容，搖勻，作為母液備用。

1.4.2 樣品溶液配制 準確稱取柑橘皮揮發(fā)油0.05 g置于10 mL容量瓶中，加二氯甲烷定容，搖勻備用。

1.5 色譜條件

色譜柱HP-5（30 m×320 μm×0.25 μm），進樣口溫度250 ℃，柱溫50～220 ℃，載氣N2，分流比50∶1，氫火焰離子化檢測器（FID），檢測器溫度250 ℃。

1.6 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件對試驗數(shù)據(jù)進行分析，結(jié)果以平均值±標準誤差（M±SE）表示，對各組結(jié)果進行統(tǒng)計學(xué)Duncan檢驗比較差異，以不同小寫字母表示差異顯著（P<0.05）。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 浸泡時間 由圖1看出，揮發(fā)油的提取率隨著浸泡時間的延長呈上升趨勢，浸泡超過2 h提取率基本不變。這是由于浸泡有利于揮發(fā)油的滲出，但浸泡使揮發(fā)油浸出能力有限。方差分析表明，浸泡2和3 h的揮發(fā)油提取率差異不大，選擇浸泡2 h為水蒸氣蒸餾法提取橘皮揮發(fā)油的最佳時間，提取率為0.91%。

2.1.2 提取時間 由圖2看出，隨著提取時間延長，揮發(fā)油提取率呈上升趨勢，在0.5～2.0 h揮發(fā)油提取率增加較快，超過2.0 h揮發(fā)油提取率不再上升，說明2.0 h左右揮發(fā)油提取完全，從縮短提取時間、減少能耗方面考慮，確定2.0 h為橘皮揮發(fā)油最佳提取時間。

2.1.3 溶劑量 由圖3可知，揮發(fā)油提取率隨著溶劑量的增加呈上升趨勢，溶劑量超過800 mL提取率基本不變。試驗發(fā)現(xiàn)，溶劑量400 mL時容易出現(xiàn)糊底現(xiàn)象，對揮發(fā)油的含量和品質(zhì)都有影響。當(dāng)溶劑量從400 mL提高至600 mL時，揮發(fā)油提取率有所提高，從600 mL提高至800 mL時，揮發(fā)油含量顯著提高。而當(dāng)溶劑量繼續(xù)增加時，揮發(fā)油提取率不變，說明繼續(xù)增加溶劑量對揮發(fā)油提取率影響不大，因此提取最佳溶劑量為800 mL。

2.1.4 粉碎目數(shù) 由圖4可知，隨著粉碎目數(shù)增大，揮發(fā)油提取率呈上升趨勢，說明橘皮粉碎有利于揮發(fā)油浸出，超過20目橘皮揮發(fā)油提取率基本不變，粉碎目數(shù)達40目時，在提取過程中發(fā)現(xiàn)橘皮粉末有結(jié)塊現(xiàn)象，導(dǎo)致?lián)]發(fā)油提取率略有下降，因此確定橘皮揮發(fā)油提取最佳粉碎目數(shù)為20目。

2.2 正交試驗

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選擇4個影響因素的3個水平設(shè)計正交試驗L9（34），優(yōu)化水蒸氣蒸餾法提取柑橘皮揮發(fā)油工藝，正交試驗結(jié)果與分析見表2，方差分析見表3。從表3可知，水蒸氣蒸餾提取柑橘皮揮發(fā)油的影響因素中提取時間的影響最顯著，粉碎目數(shù)和浸泡時間次之，溶劑量的影響最不顯著。極差分析得出水蒸氣蒸餾法提取柑橘皮揮發(fā)油的最佳工藝方案是A1B3C2D3，即浸泡時間1 h，提取時間3.0 h，加水量800 mL，粉碎目數(shù)30目。以上述最佳工藝條件進行驗證試驗，測得提取率為1.42%，RSD=1.08%（n=6），表明該工藝條件穩(wěn)定可行。

2.3 不同產(chǎn)地柑橘皮揮發(fā)油提取

按“2.2”中優(yōu)選的試驗條件提取5批不同產(chǎn)地柑橘皮揮發(fā)油，每個批次重復(fù)3次，取平均值，結(jié)果見表4。由表4可以看出，不同產(chǎn)地柑橘皮揮發(fā)油提取率有差異，但差異不明顯。

2.4 揮發(fā)油中檸檬烯含量測定

2.4.1 色譜分離情況 在“1.5”色譜條件下，標準溶液和樣品的氣相色譜分離情況見圖5。

2.4.2 線性范圍考察 精密量取標準品母液0.04、0.08、0.12、0.16、0.20 mL置于10 mL容量瓶中，加二氯甲烷定容，搖勻，按照“1.5”色譜條件，以標準品峰面積為縱坐標，樣品濃度為橫坐標，得檸檬烯回歸方程為Y=0.344 2X+0.072 2（R2=0.999 9），線性范圍為22.68～113.40 μg/mL。endprint

2.4.3 重復(fù)性 精密吸取試樣溶液0.1 mL定容至10 mL容量瓶，搖勻，在上述色譜條件下計算得出柑橘皮揮發(fā)油中檸檬烯平均質(zhì)量分數(shù)為95.8%（n=6），RSD為1.21%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.4 精密度 精密量取同一檸檬烯標準品溶液按色譜條件連續(xù)進樣6次，以檸檬烯峰面積計算RSD為1.12%，表明儀器精密度良好。

2.4.5 穩(wěn)定性 取同一揮發(fā)油樣品溶液，分別在0、2、4、6、8 h進樣，以檸檬烯峰面積計算其RSD為2.38%。表明樣品溶液在8 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.4.6 加樣回收率 精密吸取已知檸檬烯含量（95.8%）柑橘皮揮發(fā)油樣品0.05 mL，分別精密加入檸檬烯標準品（5.67 mg/mL）0.044 mL，定容至10 mL，并按“1.5”色譜條件測定，得出平均回收率為99.73%（表5）。

2.5 不同產(chǎn)地柑橘皮揮發(fā)油中檸檬烯測定

分別取5個不同產(chǎn)地柑橘皮揮發(fā)油0.1 mL定容至10 mL容量瓶，搖勻，進樣3次，取平均值計算含量，結(jié)果見表6。

3 結(jié)論

通過正交試驗優(yōu)化出水蒸氣蒸餾法提取柑橘皮揮發(fā)油最佳工藝參數(shù)：浸泡時間1 h，提取時間3.0 h，加水量800 mL，粉碎目數(shù)30目。該工藝簡單，成本低，提取過程中不產(chǎn)生三廢，提取的揮發(fā)油澄清透明，具有濃烈的香味。

氣相色譜條件[15-18]，考察了不同條件并進行對比，確定梯度升溫50～220 ℃分離效果，該方法準確度、靈敏度、穩(wěn)定性均較好，可用于檸檬烯的質(zhì)量控制。

檸檬烯具有祛痰、止咳、平喘、促進胃腸蠕動、促進消化液分泌、鎮(zhèn)痛、溶解膽結(jié)石、抗菌消炎和去除自由基等作用[6]。近年來有研究報道[19]中藥油滴丸中含有檸檬烯，本試驗可為今后綜合利用鮮柑橘皮開發(fā)揮發(fā)油新藥資源提供依據(jù)。

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