新會柑胎仔與青皮、陳皮的黃酮含量分析與比較

盛釗君，葛思媛，張焜，譚永權(quán)，劉澤璇，李裕琳，謝芳英，陳小樂（五邑大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，廣東江門529020）

新會柑胎仔與青皮、陳皮的黃酮含量分析與比較

盛釗君，葛思媛，張焜，譚永權(quán)，劉澤璇，李裕琳，謝芳英，陳小樂（五邑大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，廣東江門529020）

采用高效液相色譜（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）與分光光度法兩種檢測手段，分析和比較了新會柑胎仔、1年青皮、5年陳皮、10年陳皮4種樣品的黃酮苷類和多甲氧基黃酮類化合物的含量。HPLC檢測結(jié)果表明，新會柑胎仔的橙皮苷含量高達(dá)12.8%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他3種樣品。同時(shí)，新會柑胎仔的橘皮素（0.3%）和川陳皮素含量（0.6%）也略高于其他3種樣品。分光光度法的檢測結(jié)果顯示，4種樣品中黃酮苷類成分含量由高到低分別是柑胎仔（9.5%），10年陳皮（6.1%），5年陳皮（5.2%），1年青皮（4.9%）；多甲氧基黃酮類成分含量由高到低分別是柑胎仔（2.5%），1年青皮（1.9%），5年陳皮（1.7%），10年陳皮（1.6%）。兩種檢測結(jié)果均表明柑胎仔中黃酮含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于青皮或陳皮，在功能食品的研究和開發(fā)中具有應(yīng)用潛力。

柑胎仔；陳皮；高效液相色譜（HPLC）；黃酮；橙皮苷

Abstract：The contents of flavone glycosides and polymethoxylated flavones in Xinhui tangerine buds，1-yearold mandarin orange peel，5-years-old Chenpi and 10-years-old chenpi were determined and compared by HPLC and spectrophotometry.The results of HPLC showed that the Content of hesperidin in tangerine buds reached up to 12.8%，which was much higher than the other three samples.Moreover，the contents of tangeritin（0.3%）and nobiletin（0.6%）in Xinhui tangerine buds were also slightly higher than the other three samples.The results of spectrophotometry showed that the contents of flavone glycosides in the four samples from high to low were tangerine buds（9.5%），10-years-old Chenpi（6.1%），5-years-old Chenpi（5.2%），1-year-old mandarin orange peel（4.9%），and the contents of polymethoxylated flavones from high to low were tangerine buds（2.5%），1-year-old mandarin orange peel（1.9%），5-years-old Chenpi（1.7%），10-years-old Chenpi（1.6%）.The results of both methods showed that the content of flavonoids in tangerine buds was much higher than mandarin orange peel and Chenpi.Xinhui tangerine buds have great potency in the development and research of functional foods.

Key words：tangerine buds；Chenpi；high performance liquid chromatography（HPLC）；flavonoids；hesperidin

新會柑，又稱陳皮柑，廣東省江門市著名土特產(chǎn)，中國地理標(biāo)志產(chǎn)品。將新會柑皮曬干可以得到青皮，將青皮陳化3年以上便是我們所熟知的“新會陳皮”。新會陳皮是廣東省十大傳統(tǒng)地道藥材之一，兼具藥食兩用的特色，主治脘腹脹滿、食少吐瀉、咳嗽多痰。近幾十年來，大量文獻(xiàn)報(bào)道了有關(guān)陳皮的功能成分及功效的研究[1-3]。研究結(jié)果表明，新會陳皮具有抗氧化、抗癌、抑菌等多種生理功效[4-6]，而主要功效成分為揮發(fā)油和黃酮類成分[1，7]。陳皮中主要含兩種黃酮類成分：一種是柚皮苷（naringin，圖 1）、橙皮苷（hesperidin，圖1）等二氫黃酮苷類；一種是橘皮素（tangeritin，圖1）、川陳皮素（nobiletin，圖1）等多甲氧基黃酮類[8-9]。《中國藥典》2015年版以橙皮苷作為指標(biāo)性成分評價(jià)陳皮的質(zhì)量。橙皮苷是一個(gè)生物活性確切、藥理作用廣泛的黃酮類化合物，具有抗炎、抗氧化、抗菌、抗癌、調(diào)節(jié)免疫力、防輻射、保護(hù)心血管系統(tǒng)等多種藥理活性，在醫(yī)藥學(xué)上有廣泛的用途和利用前景[10-12]。

圖1 柚皮苷、橘皮素、橙皮苷、川陳皮素的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structure of naringin，tangeritin，hesperidin and nobiletin

新會柑胎仔，又名青柑仔、柑仔乳果，是新會柑樹開始生長果子的時(shí)候摘取下來的胎果，其大小與桂圓差不多（圖2）。將胎果清洗消毒，曬干保存一段時(shí)間，胎果的顏色逐漸變深，便制成了新會柑胎仔。新會柑胎仔一般用來泡茶或者煲湯，口感和香味不遜色于陳皮，近年來越來越受到廣東本地人們的喜愛。然而，盡管針對新會陳皮的研究報(bào)道眾多，但未見任何新會柑胎仔的研究報(bào)道。本研究采用高效液相色譜（High Performance Liquid Chromatography，HPLC） 和分光光度法兩種檢測手段，首次分析和對比了新會柑胎仔、1年青皮、5年陳皮及10年陳皮4種樣品的4種黃酮類成分含量，為新會柑胎仔應(yīng)用于功能食品的研究和開發(fā)中提供依據(jù)和參考。

圖2 新會柑胎仔Fig.2 Xinhui tangerine buds

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新會柑胎仔、5年陳皮、10年陳皮：廣東省江門市新會區(qū)天馬村，由新會陳皮協(xié)會提供。1年青皮：廣東省江門市新會區(qū)梅江村，由江門市新會區(qū)新寶堂陳皮有限公司提供。

橙皮苷標(biāo)準(zhǔn)品（批次號為H1319078）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；柚皮苷、川陳皮素、橘皮素標(biāo)準(zhǔn)品（批次號分別為 K21F3C1、P10A6F2261、H09M7K14409）：上海源葉生物科技有限公司。色譜分析和分光光度分析所用溶劑均為色譜純級別。其他未說明試劑均為分析純級別。

1.2 儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀（LC-20A）：島津儀器；紫外可見分光光度計(jì)（UV-8000S）：上海元析儀器有限公司；超聲波儀（KQ-600KDE）：昆山市超聲儀器有限公司；離心機(jī)（TD5A-WS）：長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品提取方法

分別將柑胎仔、1年青皮、5年陳皮及10年陳皮烘干，粉碎，過80目篩，用密封袋封好樣品粉末保存?zhèn)溆谩８魅》勰?50 mg，加入25 mL甲醇，超聲提取30 min，過濾，離心，即得10 mg/mL樣品溶液。

1.3.2 液相色譜分析方法

1.3.2.1 色譜條件

色譜柱：Welchrom?C18，150 mm×4.6 mm×5 μm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；檢測波長：283 nm；流動相：A為0.5%醋酸水溶液，B為乙腈，采用梯度洗脫（方法參數(shù)如表1所示）；流速為1.0 mL/min。

表1 梯度方法參數(shù)Table 1 Gradient method parameters

1.3.2.2 4種黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

稱取4種標(biāo)準(zhǔn)品柚皮苷5.4 mg、橙皮苷5.2 mg、橘皮素3.2 mg、川陳皮素3.9 mg，混合溶于10 mL甲醇中，得到儲備液，然后再稀釋為6個(gè)濃度梯度，分別為柚皮苷 0.010 8 mg/mL～0.54 mg/mL，橙皮苷 0.010 4 mg/mL～0.52 mg/mL，橘皮素 0.006 4 mg/mL～0.32 mg/mL，川陳皮素0.007 8 mg/mL～0.39 mg/mL。以標(biāo)準(zhǔn)品濃度（單位mg/mL）為橫坐標(biāo)，上述色譜條件下所得的峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行回歸計(jì)算，得出回歸方程和相關(guān)系數(shù)。

1.3.3 分光光度分析方法

1.3.3.1 檢測波長的確定

陳皮中的黃酮類化合物主要分為兩大類：黃酮苷類和多甲氧基黃酮類。經(jīng)過對4種黃酮成分進(jìn)行全波長掃描，同一類黃酮成分的最大吸收波長相近。因此，選取橙皮苷作為黃酮苷類代表，在橙皮苷的最大吸收波長283 nm下，測定黃酮苷類成分的含量。選取橘皮素為多甲氧基黃酮類代表，在橘皮素的最大吸收波長328 nm下，測定多甲氧基黃酮類成分的含量。

1.3.3.2 橙皮苷標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

稱取橙皮苷標(biāo)準(zhǔn)品5.0 mg，置于25 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，搖勻制成0.20 mg/mL儲備液。將儲備液稀釋，配得濃度分別為 0、2.0、5.0、8.0、11、14、17 μg/mL的待測溶液。在283 nm波長處測定吸光度，每個(gè)濃度樣品平行測定3次，取平均值。以橙皮苷濃度C（μg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度A為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3.3 橘皮素標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

步驟同 1.3.3.2，橘皮素標(biāo)準(zhǔn)溶液為 0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0 μg/mL，檢測波長為 328 nm。

1.3.3.4 測定樣品待測溶液中黃酮含量

為了提高測定的準(zhǔn)確度，將10 mg/mL樣品儲存溶液分別稀釋至3種濃度的待測溶液：0.1、0.2、0.3 mg/mL。每一個(gè)待測溶液平行測定3次，取平均值吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線所得的回歸方程，計(jì)算出兩類黃酮含量的百分比。

2 結(jié)果與分析

2.1 HPLC分析

2.1.1 4種黃酮標(biāo)準(zhǔn)品的分離

考察了甲醇-醋酸水溶液，乙腈-醋酸水溶液兩種體系流動相，以及流動相中不同比例對樣品分離的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 4種黃酮標(biāo)準(zhǔn)品混合物色譜圖Fig.3 The chromatogram of the mixture of four reference standards

結(jié)果表明，采用乙腈-0.5%醋酸水溶液體系作為流動相時(shí)，4種黃酮苷類成分有較好的分離。采用梯度洗脫較等度洗脫，能明顯改善各特征峰的分離效果，既能滿足基線分離的要求，又有適宜的保留時(shí)間。最終，在1.3.2.1所述的色譜條件下，4種黃酮化合物的峰能完全分離。經(jīng)分別對4種標(biāo)準(zhǔn)品分析可知，保留時(shí)間為 20.8、21.6、34.4、36.1 min的物質(zhì)分別是柚皮苷（標(biāo)準(zhǔn)品1#）、橙皮苷（標(biāo)準(zhǔn)品2#）、川陳皮素（標(biāo)準(zhǔn)品4#）、橘皮素（標(biāo)準(zhǔn)品 3#）。

2.1.2 橙皮苷、橘皮素及川陳皮素的標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

所檢測的4種黃酮標(biāo)準(zhǔn)品均微溶于甲醇，經(jīng)對其溶解度進(jìn)行測試，確定標(biāo)準(zhǔn)溶液所能達(dá)到最大濃度約為0.5 mg/mL。因此，在此濃度水平下，對標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行梯度稀釋。由于在樣品檢測中，4種測試樣品中均未檢測到柚皮苷，由此只繪制橙皮苷、橘皮素及川陳皮素3條黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見圖4。

圖4 橙皮苷、橘皮素及川陳皮素的HPLC標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 HPLC standard curves of hesperidin，tangeritin and nobiletin

如圖4所示，在檢測濃度范圍內(nèi)，3種黃酮濃度與各自的峰面積均成線性。橙皮苷的回歸方程為y=16 670 084x-17 826（R2=0.999 8），橘皮素的回歸方程為 y=27 725 247x-17 950（R2=0.999 8），川陳皮素的回歸方程為 y=19 163 512x-11 088（R2=0.999 8）。

2.1.3 樣品的液相色譜分析

在同樣的色譜條件下，相同濃度的柑胎仔（樣品1）、1年青皮（樣品 2）、5年陳皮（樣品 3）及 10年陳皮（樣品4）的樣品溶液分析結(jié)果如圖5所示。

圖5 4種樣品液相色譜圖Fig.5 Liquid chromatography spectra of 4 samples

由圖5可知，4種樣品中的黃酮成分均以橙皮苷為主，其次是橘皮素和川陳皮素，而柚皮苷含量很低，幾乎檢測不到。將各個(gè)峰面積代入標(biāo)準(zhǔn)品的回歸方程中，可求得樣品溶液中各種黃酮的濃度。然后，根據(jù)樣品溶液濃度為10 mg/mL，計(jì)算出樣品中各種黃酮成分所占的質(zhì)量百分比。檢測結(jié)果如表2所示。

表2 HPLC檢測黃酮含量結(jié)果Table 2 Results of flavonoids content determination by HPLC

由表2可知，4種樣品中的橙皮苷含量均達(dá)到《中國藥典》標(biāo)準(zhǔn)（不得少于2.5%），尤其是柑胎仔的橙皮苷含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于其他3種樣品，高達(dá)12.8%。此外，新會柑胎仔的橘皮素和川陳皮素的含量分別為0.3%、0.6%，也略高于其他3種樣品。其他3種樣品總體相比較，10年新會陳皮黃酮含量較高，1年新會陳皮次之，5年新會陳皮最低。

2.2 分光光度分析

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

橙皮苷和橘皮素的分光光度標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖6。

圖6 橙皮苷和橘皮素的分光光度標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.6 Spectrophotometric standard curves of hesperidin and tangeritin

如圖6所示，橙皮苷在2.0 μg/mL至17 μg/mL的濃度范圍內(nèi)，濃度與吸光度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，回歸方程為y=0.034 7x+0.003 3（R2=0.999 9）。橘皮素在4.0 μg/mL至9.0 μg/mL的濃度范圍內(nèi)，濃度與吸光度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，回歸方程為y=0.074 4x-0.005 8（R2=0.999 0）。

2.2.2 樣品黃酮含量的測定

為了增加檢測的準(zhǔn)確性，將每一種樣品配制3個(gè)濃度（0.1、0.2、0.3 mg/mL）的待測溶液，分別在 283 nm和328 nm處測吸光度，平行測定3次，取吸光度平均值，由標(biāo)準(zhǔn)曲線分別算出兩類黃酮成分的濃度。然后，根據(jù)待測溶液的濃度，將黃酮濃度換算成黃酮占樣品粉末重量的百分比，3個(gè)濃度所得結(jié)果取平均值，其結(jié)果如表3所示。

表3 分光光度檢測黃酮含量結(jié)果Table 3 Results of flavonoids content determination by spectrophotometry

結(jié)果表明，采用分光光度的方法，其結(jié)果與HPLC檢測大致一致。對黃酮苷類成分而言，柑胎仔中的含量約為其他3種樣品的2倍，青皮和陳皮相比較，10年陳皮的黃酮苷類成分較高，占陳皮質(zhì)量的6.1%，這也一定程度上驗(yàn)證了陳皮“陳久者良”一說。對多甲氧基黃酮類成分而言，4種樣品的差別不大，但是柑胎仔中多甲氧基黃酮類的含量仍然明顯高于其他樣品，占柑胎仔質(zhì)量的2.5%。

分光光度法的檢測結(jié)果與HPLC結(jié)果相比較，趨勢大致一致，但也略微有所不同。對于單一成分的定量檢測，HPLC檢測的結(jié)果更準(zhǔn)確。但是，柑橘屬植物中的黃酮成分較復(fù)雜，已經(jīng)報(bào)道就多達(dá)60多種[7]。因此，采用分光光度檢測，更適用于檢測某一大類黃酮成分的含量。

3 結(jié)論

本研究采用HPLC和分光光度兩種檢測手段，分析和比較了新會柑胎仔、1年青皮、5年陳皮、10年陳皮中橙皮苷、橘皮素以及川陳皮素等黃酮成分含量。兩種分析檢測結(jié)果均表明，新會柑胎仔中的黃酮含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他3種樣品。HPLC定量分析檢測結(jié)果表明，新會柑胎仔中的橙皮苷含量極高，高達(dá)12.8%，是其他樣品的3倍～5倍。新會柑胎仔中的橘皮素和川陳皮素成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.3%和0.6%，亦明顯高于青皮和陳皮。分光光度分析結(jié)果表明，新會柑胎仔中的黃酮苷類成分約為青皮或陳皮的2倍，多甲氧基黃酮類成分同樣明顯高于其他樣品，兩種檢測結(jié)果基本相符。目前，新會柑胎仔醇提物的生物活性測試正在本實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行，其功能成分對其生物活性產(chǎn)生的影響亦在研究中。總之，本研究結(jié)果表明，新會柑胎仔這一廣東地區(qū)特色農(nóng)產(chǎn)品具有較大的研究價(jià)值和較好的應(yīng)用開發(fā)前景，本研究為新會柑胎仔的研究填補(bǔ)了空白，為廣陳皮行業(yè)的發(fā)展提供一條新思路，也為新會柑胎仔應(yīng)用于功能食品的研究與開發(fā)中提供了研究基礎(chǔ)和試驗(yàn)依據(jù)。

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Quantitative Determination and Comparison of Flavonoids of Xinhui Tangerine Buds，Mandarin Orange Peel and Chenpi

SHENG Zhao-jun，GE Si-yuan，ZHANG Kun，TAN Yong-quan，LIU Ze-xuan，LI Yu-lin，XIE Fang-ying，CHEN Xiao-le
（School of Chemical and Environmental Engineering，Wuyi University，Jiangmen 529020，Guangdong，China）

2017-03-16

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.20.028

廣東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2016A030310441）；五邑大學(xué)博士啟動基金（2016BS18）；五邑大學(xué)青年科研基金（2015zk03，2016td01）

盛釗君（1987—），女（土家），講師，博士，研究方向：天然資源的綜合利用及藥物開發(fā)。