腫瘤壞死因子α對腸上皮細胞株HT-29的核轉錄因子κB信號通路的激活作用研究

姚 暉，王明明，陳旺盛，任 磊，徐 亮

（西南醫科大學附屬醫院 胃腸外科，四川瀘州 646000）

腫瘤壞死因子α對腸上皮細胞株HT-29的核轉錄因子κB信號通路的激活作用研究

姚 暉，王明明，陳旺盛，任 磊，徐 亮★

（西南醫科大學附屬醫院 胃腸外科，四川瀘州 646000）

目的：研究腫瘤壞死因子α（TNF-α）對腸上皮細胞株HT-29的核轉錄因子κB（NF-κB）信號通路的激活作用及鼠尾草酚對TNF-α誘導HT-29的NF-κB激活的影響。方法：將HT-29細胞分為空白對照組、TNF-α組和低、中、高劑量鼠尾草酚組。用CCK-8法檢測HT-29細胞活力；Western-blot方法檢測IκBα、Pi-IκBα和Pi-IKKα/β蛋白表達；用NF-κB轉錄活性試劑盒檢測HT-29細胞NF-κB轉錄活性。結果：實驗各組的HT-29細胞活力比較無顯著性差異 （P＞0.05）；TNF-α刺激可誘導HT-29的IκBα磷酸化及降解；鼠尾草酚能使TNF-α誘導 HT-29 的 IKKα/β 和 IκBα 磷酸化顯著受抑制（均 P＜0.05），并且可顯著降低 NF-κB 的轉錄活性（P＜0.05）。結論：TNF-α可激活HT-29的NF-κB經典信號通路，鼠尾草酚對TNF-α誘導的NF-κB激活有抑制作用。

鼠尾草酚；腫瘤壞死因子-α；核轉錄因子-κB；炎癥性腸病

腸上皮細胞是機體的第一道防線，行使固有免疫的許多功能[1]。腸黏膜長時間過度激活，并產生過多促炎因子是腸道炎癥的重要病理改變[2]。克羅恩?。–D）患者[3]和潰瘍性結腸炎（UC）患者[4]結腸內發現有高水平的腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）表達，這提示 TNF-α 在炎癥性腸病 （inflammatory bowel disease，IBD）的發病中起重要作用。TNF-α信號通路會導致一系列基因轉錄，核轉錄因子（nuclear factor-κB，NF-κB）的激活是介導這一過程的關鍵因素[5]。NF-κB激活后會導致下游相關炎癥基因如細胞因子、趨化因子等轉錄。鼠尾草酚（carnosol）是一種源自植物迷迭香提取物的多酚類單體，許多研究表明它具有抗炎、抗氧化和抗增殖作用[6～9]。本研究擬探討TNF-α對腸上皮細胞株HT-29的NF-κB經典信號通路的激活作用及鼠尾草酚對NF-κB激活的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及材料

Carnosol（美國 Caymen公司），DMEM 培養基、胎牛血清（Gbico公司，美國），人重組TNF-α（美國Invitrogen公司），CCK-8檢測試劑盒（上海同仁化學研究所），TransAMTM NF-κB試劑盒（美國 Active Motif公司），兔抗人 Phospho-IKKα/β 多克隆抗體、小鼠抗人IκBα單克隆抗體、小鼠抗人Phospho-IκBα 單克隆抗體（美國 Cell signaling公司），小鼠抗人GAPDH單克隆抗體 （美國Santa cruz生物公司），羊抗小鼠二抗IgG-HRP、羊抗兔二抗IgG-HRP（北京博奧森生物技術有限公司），全蛋白提取試劑盒 （南京凱基生物科技發展有限公司），PVDF膜（美國 Milipore公司）。

1.2 主要儀器

超凈工作臺 （美國Thermo Forma公司），CO2恒溫細胞培養箱（美國Thermo Forma公司），恒溫孵箱（日本Sanyo公司），全自動酶標儀Multiskan MK3（芬蘭 Thermo公司）。

1.3 細胞培養

腸上皮細胞株HT-29購自中科院上海細胞庫。用含10%FBS的DMEM培養液 （含青霉素100U/ml，鏈霉素 100U/ml），置于 37℃、5%CO2飽和濕度培養箱培養，2～3d更換培養液。

1.4 實驗分組

HT-29細胞培養48 h，生長至90%密度，再同步化培養12h。將實驗細胞分為：空白對照組、TNF-α 組（10ng/ml TNF-α）和低、中、高劑量鼠尾草酚組（10ng/ml TNF-α＋10、20、40μmol/L 鼠尾草酚）。鼠尾草酚組用不同劑量鼠尾草酚預處理18h，再加入TNF-α刺激6h，然后進行指標檢測。

1.5 CCK-8法檢測HT-29細胞活力

細胞接種于96孔板培養48h，生長至80%密度。換成無血清培養基，同步化培養12h。加入藥物分組再培養24h，每組設3個復孔。每孔加入10μl的CCK-8，培養2h。用酶標儀測定450nm吸光度（OD 值）。

1.6 Western-blot法檢測 HT-29 細胞 IκBα、Pi-IκBα、Pi-IKKα/β 和 GAPDH 的表達

提取HT-29細胞總蛋白，經10%SDS-PAGE電泳后轉PVDF膜，將PVDF膜用含5%脫脂奶粉的TBST緩沖液中搖床37℃封閉1h。PVDF膜浸泡于稀釋好的第一抗體，室溫下搖床孵育1h。漂洗后的PVDF膜再浸泡于用辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫下搖床孵育1h。PVDF膜漂洗后用增強化學發光法（ECL）檢測目的蛋白條帶。

1.7 NF-kB轉錄活性試劑盒法檢測HT-29細胞NF-κB的轉錄活性

制備HT-29細胞核提取物。試劑盒96孔板中每孔加入30μl完全結合緩沖液?？瞻讓φ湛准尤?0μl完全裂解緩沖液，樣品孔每孔加入20μl（5μg）核提取物，浸泡于搖床輕搖1h。每孔用緩沖液洗3次后加入NF-κB抗體，室溫下靜置1h。緩沖液洗3次后，加入二抗，室溫下靜置1h。每孔加入100μl顯色液，室溫下避光孵育5min。用酶標儀在450nm波長下測出每孔的OD值。

1.8 統計學方法

應用SPSS18.0統計學軟件進行數據分析，多樣本均數的比較采用單因素方差分析，兩樣本間的比較采用配對t檢驗。

2 結果

2.1 實驗各組HT-29細胞活力的比較

圖1 鼠尾草酚和TNF-α對HT-29活力的影響

圖2 TNF-α對HT-29細胞IκBα磷酸化及降解的影響

圖3 鼠尾草酚對TNF-α誘導下HT-29的Pi-IKKα/β和Pi-IκBα蛋白表達的影響

結果如圖1顯示，在試驗濃度下，TNF-α和鼠尾草酚對HT-29細胞活力無顯著影響（各組間比較 P＞0.05）。

2.2 TNF-α對HT-29細胞 IκBα磷酸化及降解的影響

如圖2所示，TNF-α刺激可誘導 IκBα磷酸化，pi-IκBα蛋白表達在5min就達到高峰，隨著時間推移，30min降到最低水平，60min后再次出現高峰，一直維持到12h。TNF-α刺激后，IκBα開始泛素化降解，30min達到最低谷，60min后IκBα蛋白表達水平恢復到刺激前水平。

2.3 鼠尾草酚對TNF-α誘導HT-29細胞Pi-IKKα/β 和 Pi-IκBα 的表達的影響

結果如圖3所示，與空白對照組比較，TNF-α刺激組 Pi-IKKα/β 和 Pi-IκBα 表達顯著增加（P＜0.05）。與TNF-α刺激組比較，低、中、高劑量鼠尾草酚組的Pi-IKKα/β和Pi-IκBα表達顯著受到抑制（P＜0.05）。

2.4 鼠尾草酚對HT-29細胞NF-κB的轉錄活性的影響

如圖4所示，與空白對照組比較，TNF-α刺激組的NF-κB亞基p65和p50同DNA的結合活性顯著增強（P＜0.05）。與 TNF-α 刺激組比較，低、中、高劑量鼠尾草酚組的p65和p50亞基同DNA的結合活性顯著受到抑制（P＜0.05）。

3 討論

在腸道慢性炎癥狀態下，多種促炎因子表達增加。TNF-α主要由單核細胞巨噬細胞分泌，導致腸道多種細胞包括腸上皮細胞處于炎癥激活狀態[10]。分化的腸上皮細胞株HT-29表現出成熟腸上皮細胞的特性，故很多藥物研究把HT-29細胞作為研究腸黏膜疾病的模型[11]。本研究發現，人重組TNF-α可誘導HT-29細胞IκBα磷酸化及降解，由于IκBα磷酸化激活是NF-κB通路的關鍵步驟，故我們的試驗結果提示TNF-α誘導下的HT-29細胞可以作為研究炎癥性腸?。↖BD）的腸上皮細胞模型。

鼠尾草酚是迷迭香的提取物的主要成份之一，屬于二萜酚類化合物。最近研究發現[12]，鼠尾草酚能抑制TNF-α誘導下臍靜脈內皮細胞的細胞粘附分子ICAM-1和VCAM-1的表達。但其對腸上皮細胞的抗炎機制尚未完全闡明，為此我們進一步研究了鼠尾草酚對TNF-α誘導下NF-κB信號通路激活產生的影響。在促炎因子TNF-α、IL-1等刺激下，腸上皮細胞NF-κB會大量激活，引發下游大量炎癥相關因子轉錄。通過結合TNFR1和 （或）TNFR2，TNF-α通過TNFR相關因子2（TRAF2）和Ser/Thr激酶受體相互作用蛋白傳遞信號，導致 IκB 激酶（IKK）磷酸化激活[13]。 IKKα/β的激活，接著又會導致IκB-α的磷酸化激活[14]。磷酸化的IκBα降解后釋放激活NF-κB二聚體，后者入核導致下游基因的轉錄。以上就是TNF-α激活的NF-κB經典信號通路。我們的實驗發現，鼠尾草酚可以導致TNF-α誘導的HT-29細胞NF-κB經典信號通路的激活被抑制。但鼠尾草酚具體作用于NF-κB信號通路哪個位點，是直接作用還是間接作用，以及是否會抑制腸上皮細胞下游炎癥相關基因的激活，尚有待于進一步研究。

鼠尾草酚屬于多酚類物質，至今已發現的植物多酚已有8000多種，組成人們食物中規模最大次級代謝產物群。細胞和動物研究發現，許多植物多酚具有抗腸道炎癥作用，其中姜黃（curcumin）是首個用于IBD臨床研究的植物多酚類藥物[15]。鼠尾草酚與姜黃同為植物多酚，其抑制內皮細胞細胞粘附分子表達，以及抑制腸上皮細胞NF-κB通路激活的藥理作用，使其有望用于IBD緩解誘導后長期的維持治療。

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Study of tumor necrosis factor-α on activation of the nuclear factor-κB pathway in intestinal epithelial cell line HT-29

YAO Hui，WANG Ming-ming，CHEN Wang-sheng，et al//Journal of China-Japan Friendship Hospital，2017 Aug，31（4）：222-225

Objective：To study the effect of tumor necrosis factor（TNF）-α on activation of nuclear factor（NF）-κB pathway in intestinal epithelial cell line HT-29 as well as effect of carnosol on NF-κB pathway in TNF-α-stimulated HT-29.Methods：HT-29 cells were divided into five groups：control group，TNF-α group，and low- ，mid- ，high-dose carnosol groups.Cell counting kit-8 （CCK-8）was used for analysis of HT-29 viability.Expression of IκBα、Pi-IκBα and Pi-IKKα/β in HT-29 were evaluated by Western-blot.NF-κB-DNA binding activation of HT-29 was analyzed with the TransAM NF-κB Family Kit.Results：There were no significant differences on cell viability in five groups （P＞0.05）.TNF-α could induce IκBα phosphorylation and degradation in HT-29.Carnosol significantly inhibited IKKα/β and IκBα phosphorylation and NF-κB-DNA binding activation in TNF-α-stimulated HT-29 （P＜0.05）.Conclusion：TNF-α induces activation of NF-κB classic pathway in HT-29 and carnosol inhibits TNF-α-induced activation of NF-κB in HT-29.Carnosol can be used in inflammatory bowel disease （IBD）due to its anti-inflammatory properties targeting intestinal epithelial cells.

carnosol；tumor necrosis factor-α；nuclear factor-κB；inflammatory bowel disease

R286

A

1001-0025（2017）04-0222-04

10.3969/j.issn.1001-0025.2017.04.006

Author’s addressDepartment of Gastrointestinal Surgery，The Affiliated Hospital of Southwest Medical University， Luzhou 646000，Sichuan Province，China

西南醫科大學附屬醫院博士人才基金資助項目（201143）

* 本文通訊作者。

姚 暉（1974-），男，主治醫師，醫學博士。

2016-09-24

2017-01-26