UPLC-Q-Orbitrap HRMS同時檢測水產品中磺胺和喹諾酮類藥物殘留

楊璐齊 李 蓉 高永清 張朋杰 張鵬云，

(1. 廣東藥科大學，廣東 中山 528458；2. 中山出入境檢驗檢疫局，廣東 中山 528400)

UPLC-Q-Orbitrap HRMS同時檢測水產品中磺胺和喹諾酮類藥物殘留

楊璐齊1,2李 蓉2高永清1張朋杰2張鵬云1，2

(1. 廣東藥科大學，廣東 中山 528458；2. 中山出入境檢驗檢疫局，廣東 中山 528400)

建立了水產品中21種磺胺類(SAs)和12種喹諾酮類(QNs)藥物殘留的超高效液相色譜-四級桿/靜電場軌道阱高分辨質譜(UPLC-Q-Orbitrap HRMS)多殘留檢測方法。樣品經過乙腈提取，乙腈飽和正己烷脫脂，內標法定量。結果表明，33種目標化合物在質量濃度為0.1～100 ng/mL時線性關系良好，r2≥0.996 0，定量限(LQD)為2 μg/kg。平均加標回收率為54.3%～120.4%，相對標準偏差(RSDs)為1.7%～11.9%。該方法操作簡便、靈敏度高、特異性強，可以滿足日常檢測要求。

高分辨質譜；水產品；磺胺類；喹諾酮類

Abstract： An Ultra-High Performance Liquid Chromatography-Quadrupole/Electrostatic Field Orbitrap High-resolution Mass Spectrometry method (UPLC-Q-Orbitrap HRMS)has been developed for the determinations of the drug residues of 21 SAs and 12 QNs in aquatic products.The sample was extracted by acetonitrile, cleaned up by acetonitrile saturated normal hexane and quantified in internal standard method.The results showed that 33 products presented a good linear relation in the range of 0.1～100 ng/mL.r2>0.996. The limits for qualitative detection was 2 μg/kg. The average recoveries at three spike levels ranged were 54.3%～120.4%, with RSDs ranging 1.7%～11.9%. The developed method was easy operation high sensitivity, which can meet the requirements of daily inspection.

Keywords： high-resolution mass spectroscopy; aquatic products; sulfonamides; quinlones

近年來，中國食品安全事件頻發[1]，食品安全問題關涉到每一個人的切身利益，直接影響著社會的和諧與穩定[2]。磺胺類(Sulfonamides，SAs)和喹諾酮類(Quinlones，QNs)藥物為廣譜抑菌藥，具有抗菌譜廣、高效、低毒、價格低廉等特點，在水產、畜牧養殖中被廣泛使用[3-4]。同時SAs對人體腎臟和肝臟有毒副作用，破壞人的造血系統，從而引起溶血性貧血[5]；QNs可發生嚴重的光敏反應和光毒性反應，對人體的中樞神經系統造成不良影響，導致重癥肌無力、呼吸肌無力而危及生命，且具有潛在的致癌性和遺傳毒性[6]。因此，國際食品法典委員會(CAC)和美國規定食品與飼料中SAs的最高殘留限量為100 μg/kg[7]；歐盟制定了可食動物肌肉[8]中磺胺類總量的最高殘留限量(MRL)≤100 μg/kg；日本規定食品中不得檢出SAs[5]；中國規定磺胺類在所有食品動物肌肉中的最高殘留限量為100 μg/kg，達氟沙星、恩諾沙星在除牛、羊、家禽等以外其他動物肌肉中的最高殘留限量為100 μg/kg，沙拉沙星在魚的“肌肉+皮”中的最高殘留限量為30 μg/kg[9]。

近年來SAs與QNs的檢測方法有酶聯免疫法[10-11]、液相色譜法[12-13]、液相色譜-串聯質譜法[14-16]、液相色譜-高分辨質譜法[16-18]等。酶聯免疫法通常用于樣品的快速篩查，該方法易受樣品基質中類似物質干擾而產生假陽性[19]。液相色譜法的靈敏度較低，且無法提供目標物結構信息不能用于確證方法[20]。液相色譜-串聯質譜法由于靈敏度高、結果準確，是目前檢測獸藥殘留的常用標準方法[21-22]。隨著人們生活水平的提高，對膳食結構的合理調整，水產品消耗量不斷增大，目前尚未見文章報道采用高分辨質譜同時檢測其中的SAs和QNs。本試驗擬建立超高效液相色譜-四級桿/靜電場軌道阱高分辨質譜同時檢測水產品中21種SAs和12種QNs藥物殘留的檢測方法，旨在為大批量水產品中磺胺與喹諾酮類獸藥殘留建立一種前處理簡單、結果準確的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

高分辨質譜儀：Q-Exacitv型，配電噴霧離子源及Trace Finder 3.3 EFS數據處理系統，美國Thermo Fisher公司；

超高效液相色譜儀：Ultimate 3000型，美國Thermo Fisher公司；

離心機：SIGMA 2-16K型，德國Sartorius-sigma公司；

濃縮儀：BHCHI Synocre型，瑞士步琪公司；

純水凈化儀：Mili-Q 型，法國Milipore公司；

乙腈、正己烷、乙酸乙酯、甲醇：色譜級，美國默克公司；

鯇魚：市購；

無水硫酸鈉：分析純，中國廣州化學試劑廠(使用前在650 ℃的馬弗爐內灼燒4 h)；

22種獸藥標準品、12種獸藥內標標準品：德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司。

1.2 標準溶液配制

1.2.1 標準儲備溶液 分別稱取適量的上述標準品及內標于10 mL容量瓶中，用甲醇定容，配制成100 μg/mL的標準儲備溶液，置于-18 ℃保存。

1.2.2 混合標準溶液 分別取一定量上述標準儲備溶液用甲醇稀釋成1 μg/mL的混合標準溶液，在2～4 ℃保存；分別取一定量上述內標標準儲備溶液用甲醇配制成100 ng/mL的混合內標溶液，在2～4 ℃保存。臨用前按需要混合稀釋為標準工作溶液。

1.3 樣品前處理

準確稱取經攪拌器均質的水產品樣品2.00 g至50 mL離心管中，添加濃度為100 ng/mL的混合內標溶液100 μL，加入10 mL乙腈，以14 000 r/min勻漿30 s，加入4 g無水硫酸鈉渦漩30 s，以4 500 r/min離心5 min。準確吸取5 mL樣品提取液至15 mL離心管中，在45 ℃下用氮氣將試管內的溶劑吹干，殘渣用體積比為10∶90的乙腈—0.1 %甲酸水溶液定容至1 mL，渦漩30 s，超聲3 min，加入5 mL乙腈飽和正己烷，漩渦1 min，靜置30 min，取下層液體1.5 mL轉移至2 mL的高速離心管中，以12 000 r/min離心5 min，取下清液經0.22 μm濾膜過濾后上機。

1.4 儀器條件

1.4.1 液相色譜條件 色譜柱：WatersAcquity UPLC?BEH C18(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)；柱溫：30 ℃；流動相：A(含0.1%甲酸的水溶液)和B(含0.1%甲酸的甲醇溶液)；梯度洗脫程序見表1；流動相流速：0.3 mL/min；進樣量：10 μL。

表1 液相色譜梯度洗脫程序

1.4.2 質譜條件 離子源：HESI；掃描模式：Full MS/ddMS2(Top1)；全掃描范圍(m/z)：100～1 000；分辨率：一級全掃描70 000、二級17 500；質譜駐留時間(AGC)： Full MS 1 e6、MS/MS 2 e5；歸一化碰撞能：20，40，60；頂點激發：3～6 s；動態排除：6 s；噴霧電壓： 3 200 V；鞘氣流速(N2)：0.276 MPa；輔助氣流速(N2)：0.069 MPa；加熱溫度：325 ℃；離子傳輸管溫度：350 ℃；透鏡電壓：60 V；各化合物質譜信息見表2。

2 結果與分析

2.1 色譜條件的優化

對21種SAs和12種QNs獸藥同時進行分析，因其藥物極性差異較大，采用梯度洗脫。首先對比流動相中有機相分別為含0.1%甲酸的乙腈溶液、含0.1%甲酸的甲醇溶液、乙腈、甲醇時，發現在有機相中加入甲酸后響應值更高，可能是甲酸提供質子，離子源打碎目標物時提高了碎片的離子化程度。同時發現同分異構體SMD、SMP、SMM在流動相含有0.1%甲酸的水溶液和含0.1%甲酸的甲醇溶液條件下，分離效果較好。對比色譜柱Waters Acquity UPLC?BEH C18(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)與Thermo Accucore RP-MS(2.1 mm×100 mm，2.6 μm)，結果發現使用前者QNs峰型較好。最終選用Waters Acquity UPLC?BEH C18(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)色譜柱，含0.1%甲酸的水溶液和含0.1%甲酸的甲醇溶液為流動相。圖1 為添加濃度為10 ng/mL的33種目標物的提取離子流圖。

2.2 質量準確度

使用高分辨質譜檢測目標化合物的精確質量數對于同時準確定性和定量非常重要，本研究使用超高效液相色譜—四級桿/靜電場軌道阱高分辨質譜所測的33種目標物均達到了良好的質量準確度。表3列舉了其中6種物質的理論質荷比與實測質荷比，其質量準確度均小于±1×10-6，完全滿足定性和定量要求。

2.3 前處理條件的選擇和優化

因檢測的目標物可以溶于非極性或中等極性溶劑，分別考察了有關文獻報道的乙酸乙酯[23]、含1%甲酸的乙腈[5]、乙腈[24]、含2%甲酸的乙腈溶液的提取效果，見圖2。由圖2可知，4種提取液磺胺甲氧噠嗪的回收率均差異不大；STZ、SPD、SAA用含2%甲酸的乙腈溶液提取效率較低；乙腈具有較好的蛋白沉淀作用。因此，采用乙腈作為提取液。

表2 45種物質的質譜信息及保留時間

1. 磺胺嘧啶 2. 磺胺索嘧啶 3. 磺胺噻唑 4. 磺胺甲基嘧啶 5. 磺胺二甲嘧啶 6. 磺胺吡啶 7. 甲氧芐啶 8. 磺胺鄰二甲氧嘧啶 9. 磺胺間二甲氧嘧啶 10. 噁喹酸 11. 磺胺甲噻二唑 12. 磺胺氯噠嗪 13. 磺胺甲惡唑 14. 磺胺苯酰 15. 司帕沙星 16. 磺胺甲氧噠嗪 17. 磺胺-5-甲氧嘧啶 18. 磺胺間甲氧嘧啶 19. 磺胺異惡唑 20. 加替沙星 21. 磺胺苯吡唑 22. 磺胺喹噁啉 23. 氟甲喹 24. 磺胺醋酰 25. 氟羅沙星 26. 氧氟沙星 27. 恩諾沙星 28. 雙氟沙星 29. 沙拉沙星 30. 諾氟沙星 31. 環丙沙星 32. 達氟沙星 33. 磺胺胍

圖1 魚肉中添加回收21種SAs和12種QNs的提取離子流圖

鹽析劑在樣品提取時可防止樣品中的水分及雜質進入提取液，同時可以實現脫水和鹽析，還可使蛋白質變性分散防止樣品結塊影響提取效率。對比使用無水硫酸鎂和無水硫酸鈉時，發現加入無水硫酸鎂時或因其吸水放熱提高了提取環境的溫度，諾氟沙星等幾種物質使用無水硫酸鎂鹽析的回收率明顯低于使用無水硫酸鈉的，見圖3。進一步對比添加4，6，8 g無水硫酸鈉，各目標物的添加回收率無明顯差異，最終選擇4 g無水硫酸鈉作為鹽析劑。

圖2 提取液對目標物提取效率的影響

圖3 鹽析劑對提取效率的影響

2.4 線性范圍與定量限的確定

配制質量濃度為0.1～200.0 ng/mL的系列標準溶液，在優化后的色譜和質譜條件下進行檢測，對相對應化合物在質譜中的響應面積Y與目標化合物的標記濃度值X進行線性擬合，得到目標化合物的線性范圍及其相對應的決定系數(r2)。結果顯示，各化合物的r2值均≥0.996 0(見表4)。由于高分辨率質譜儀基線極低，信噪比不再適合于確定檢出限和定量限[25]，故本方法中定量限為化合物在線性范圍內同時滿足回收率值為60%～120%的最低濃度值2 μg/kg。該指標優于同類檢測標準，滿足所有國家和地區的限量要求。

2.5 方法的回收率與精密度

選取空白基質(陰性樣品)鯇魚，進行3個濃度水平的加標回收試驗，考察方法的準確度。采用精確質量數、保留時間、同位素分布和二級碎片離子4個指標來對結果進行分析，方法定量時對有相應同位素內標的目標物采用內標法定量，其余采用外標法定量。方法的加標平均回收率為54.3%～120.4%，相對標準偏差為1.7%～11.9%，見表4，滿足食品理化檢測方法的技術要求。

2.6 方法應用

用建立的方法對收集的25個水產樣品進行了檢測。喹諾酮類藥物均未檢出；在其中1個南美對蝦樣品中檢出磺胺鄰二甲氧嘧啶(SDX)，鯇魚、北極貝、鰻魚、羅非魚4個樣品中檢出磺胺吡啶(SPD)。圖4列舉了標準溶液中的SDX和SPD與代表性陽性樣品南美對蝦中SDX和羅非魚中SPD的對比圖。陽性定量結果在2～3 μg/kg，均低于限量要求。說明此次收集的水產養殖魚中磺胺類和喹諾酮藥物殘留處于安全水平。雖然本次試驗所檢測樣品處于安全水平，但是食品安全直接關系到人們的生命健康，對嚴重危害食品安全的行為實行刑法規制是現代社會的必然選擇[26]。

圖4 SDX和SPD陽性樣品的提取離子流圖

3 結論

為了順應獸藥殘留檢測快速、簡便、準確以及高通量的發展趨勢，本研究將超高效液相色譜-四級桿/靜電場軌道阱高分辨質譜儀與快速前處理方法結合，建立了水產品中21種SAs和12種QNs獸藥殘留同時檢測的方法，樣品只需進行簡單的提取、濃縮、離心、過濾，即可上機檢測。方法的測定低限滿足國內外對水產品中SAs和QNs獸藥殘留的限量要求。該方法簡便、靈敏、準確，滿足日常檢測和監管需求。

表4 空白基質中3個添加水平的平均回收率和相對標準偏差

[1] 李洪峰. 食品安全社會共治的現實困境與發展對策[J]. 食品與機械, 2016, 32(4): 234-236.

[2] 王立新. 中國食品安全問題的法律治理路徑[J]. 食品與機械, 2014, 30(5): 107-109, 112.

[3] 李鋒格, 蘇敏, 李曉巖,等. 分散固相萃取-超高效液相色譜-串聯質譜法測定雞肝中磺胺類、喹諾酮類和苯并咪唑類藥物及其代謝物的殘留量[J]. 色譜, 2011(2): 120-125.

[4] GUIDI L R, SANTOS F A, RIBEIRO A C, et al. A simple, fast and sensitive screening LC-ESI-MS/MS method for antibiotics in fish[J]. Talanta, 2017, 163: 85-93.

[5] 孫偉紅, 冷凱良, 王志杰, 等. HPLC-MS/MS內標法同時測定水產品中18種磺胺類藥物殘留量[J]. 食品科學, 2009(24): 294-298.

[6] 仲兆金. 喹諾酮類藥物的毒性[J]. 國外醫藥: 抗生素分冊, 2001(1): 31-33.

[7] Codex Alimentarius Commission. CAC/MRL 2-2015 Maximum Residue Limits (Mrls) and Risk Management Recommendations (Rmrs) for Residues of Veterinary Drugs In Foods [S/OL].(2015-08-12)[2017-08-20].http://down.foodmate.net/standard/sort/11/46551.html.

[8] European Union. Regulation (EC) No 470/2009 of the European parliament and of the council of 6 May 2009 laying down Community procedures for the establishment of residue limits of pharmacol-ogically active substances in foodstuffs of animal origin, repealing Council Regulation (EEC) No 2377/90 and amending Directive 2001/82/EC of the European Parliament and of the Council and Regulation (EC) No 726/2004 of the European Parliament and of the Council[S/OL].(2009-06-05)[2017-08-20].http://down.foodmate.net/standard/sort/44/28727.html.

[9] 中華人民共和國農業部. 動物性食品中獸藥最高殘留限量 中華人民共和國農業部公告第235號[S/OL].(2002-12-24)[2017-08-20]. http://www.moa.gov.cn/zwllm/tzgg/gg/200302/t20 030226_59300.htm.

[10] 張鴻雁, 崔小軍, 耿金培, 等. 動物源性食品中磺胺類藥物的多殘留酶聯免疫測定方法研究進展[J]. 食品研究與開發, 2008(9): 181-183.

[11] 于雪芝. 基于單鏈抗體的牛奶中21磺胺和20氟喹諾酮類藥物殘留生物發光免疫分析方法研究[D]. 北京: 中國農業大學, 2016: 52-74.

[12] 吳翠琴, 雷金妹, 李韻靈, 等. 基于離子液體的分散液液微萃取-柱前熒光衍生高效液相色譜法測定水樣中8種磺胺類藥物[J]. 色譜, 2014(12): 1 362-1 367.

[13] 張麗媛, 王穎, 張東杰. IL-HLLME-HPLC法測定酸奶中磺胺類抗生素[J]. 食品與機械, 2013, 29(6): 71-75.

[14] ZHANG Zhi-wen, LI Xiao-wei, DING Shuang-yang, et al. Multiresidue analysis of sulfonamides, quinolones, and tetracyclines in animal tissues by ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Food Chem, 2016, 204: 252-262.

[15] TIAN He, WANG Jia-qi, ZHANG Yang-dong, et al. Quantitative multiresidue analysis of antibiotics in milk and milk powder by ultra-performance liquid chromatography coupled to tandem quadrupole mass spectrometry[J]. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci, 2016, 1 033-1 034: 172-181.

[16] 孟哲, 石志紅, 呂運開, 等. 超高效液相色譜-高分辨四級桿飛行時間質譜法快速篩查乳制品中磺胺類與氟喹諾酮類藥物[J]. 分析化學, 2014(10): 1 493-1 500.

[17] 孔聰, 周哲, 汪洋, 等. 超高壓液相色譜串聯高分辨質譜篩查漁用投入品中禁限用藥物[J]. 分析化學, 2017(2): 245-252.

[18] WANG Jian. Development and validation of a multiclass method for analysis of veterinary drug residues in milk using ultrahigh performance liquid chromatography electrospray ionization quadrupole orbitrap mass spectrometry[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2015, 63(41): 9 175-9 187.

[19] 林品言, 杜紅梅. 酶聯免疫法快速檢測水產品中磺胺類藥物殘留[J]. 當代水產, 2016(10): 94-95.

[20] 中華人民共和國國家質量監督檢驗檢疫總局, 中國國家標準化管理委員會. GBT 27404—2008 實驗室質量控制規范食品理化檢測[S]. 北京: 中國標準出版社, 2008: 27.

[21] 中華人民共和國國家質量監督檢驗檢疫總局, 中國國家標準化管理委員會. GB/T 21316—2007動物源性食品中磺胺類藥物殘留量的測定方法液相色譜-質譜/質譜法[S]. 北京: 中國標準出版社, 2007: 1.

[22] 中華人民共和國國家質量監督檢驗檢疫總局, 中國國家標準化管理委員會. GB/T20751—2006鰻魚及其制品中十五中喹諾酮類藥物殘留量的測定液相色譜-串聯質譜法[S]. 北京: 中國標準出版社, 2006: 2.

[23] 中華人民共和國農業部. 農業部985號公告-12-2007 水產品中磺胺類藥物殘留量的測定液相色譜[S]. 北京: 中國標準出版社, 2007: 5.

[24] 唐煒, 李龍飛. 固相萃取-HPLC法檢測食品中四種磺胺類獸藥殘留[J]. 食品研究與開發, 2013(18): 62-65.

[25] 木合他拜爾, 嚴華, 徐姍, 等. QuEChERS-超高效液相色譜-高分辨串聯質譜技術檢測雞肉中6種抗球蟲藥物[J]. 色譜, 2015(11): 1 199-1 204.

[26] 劉曉丹. 中國食品安全刑法規制的實踐困境與完善路徑[J]. 食品與機械, 2017, 33(1): 65-67.

Simultaneous determination of suIfonamides and quinIones infish by UPLC-Q/Orbitrap HRMS

YANG Lu-qi1，2LIRong2GAOYong-qing1ZHANGPeng-jie2ZHANGPeng-yun1，2

(1.GuangdongPharmaceuticalUniversity,Zhongshan,Guangdong528458,China;2.ZhongshanEntry-ExitInspectionandQuarantineBureau,Zhongshan,Guangdong528400,China)

10.13652/j.issn.1003-5788.2017.08.010

國家質檢總局科技計劃項目(編號：2015IK260)；廣東省省級科技計劃項目(編號：2014A040401011，2015A050502010)；中山市社會公益重大專項(編號：2015B2295)

楊璐齊，女，廣東藥科大學在讀研究生。

李蓉(1969—)，女，中山出入境檢驗檢疫局研究員，學士。E-mail:lirong828@126.com 高永清(1958—)，男，廣東藥科大學教授，碩士。 E-mail：yongqingg@163.com

2017—04—08