破壁方式對(duì)蜂花粉抑制α-葡萄糖苷酶活性的影響

劉文靜 張志旭 秦 丹

(1. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2. 國(guó)家中醫(yī)藥管理局亞健康干預(yù)技術(shù)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410128；3. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128)

破壁方式對(duì)蜂花粉抑制α-葡萄糖苷酶活性的影響

劉文靜1張志旭2秦 丹3

(1. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2. 國(guó)家中醫(yī)藥管理局亞健康干預(yù)技術(shù)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410128；3. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128)

以不同破壁方式處理過(guò)的油菜蜂花粉為研究對(duì)象，提取水溶活性成分，以4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG)作為底物，對(duì)蜂花粉作為天然α-葡萄糖苷酶活性抑制劑的功效進(jìn)行了評(píng)價(jià)。結(jié)果表明：破壁方式對(duì)蜂花粉功能活性成分以及功效評(píng)價(jià)結(jié)果影響顯著，溫差破壁、超臨界二氧化碳破壁、超聲輔助酶解破壁及對(duì)照組對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率分別為(13.73±1.15)%，(-8.07±0.93)%，(16.70±0.87)%,(9.68±0.89)%；油菜蜂花粉多糖對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率在(3.46±0.31)%～(-0.78±0.03)%，無(wú)明顯線性關(guān)系；破壁后的樣品多糖含量顯著增加，但油菜蜂花粉多糖對(duì)α-葡萄糖苷酶活性無(wú)作用，可能與黃酮等其它成分相關(guān)。

蜂花粉；α-葡萄糖苷酶；破壁方式；降血糖；多糖

Abstract： The wall of rape bee pollens were broken by using different methods, and them the water-soluble ingredients were extracted. Therefore, the 4-Nitrophenylα-D-glucopyranoside (PNPG) was as substrate to evaluate the efficiency of bee pollen as a natural alpha glucosidase inhibitor. The results showed that the wall-breaking manners had significant effect on the active ingredient. The inhibition rate of thealphaglucosidase was found ordered as following, temperature difference (13.73±1.15)%, supercritical CO2(-8.07±0.93)%, ultrasonic assisted enzymatic (16.70±0.87)%,and untreated (9.68±0.89)%. Moreover, the inhibition rate of rape pollen polysaccharide on alpha glucosidase activity was fluctuated at (2.46±0.31)%～(-0.78±0.03)%, and there was no obvious linear relationship. Finally, after the walls were broken, the content of polysaccharides increased significantly, but rape pollen polysaccharide had no effect on alpha glucosidase activity. This might be related to flavonoids or other components.

Keywords： rapebee pollen; alpha glucosidase; wall-breaking manner; decrease blood glucose; polysaccharide

糖尿病是一種常見(jiàn)的內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病，現(xiàn)已在世界范圍內(nèi)嚴(yán)重威脅到人們的生命健康[1]。空腹血糖或餐后血糖維持在較高的水平是糖尿病前期的主要癥狀，也是導(dǎo)致糖尿病并發(fā)癥的重要因素。目前主要使用α-葡萄糖苷酶抑制劑類藥物作為降低餐后血糖、治療糖尿病的一線藥物[2-4]，主要包括：拜糖平(阿卡波糖)和米格列醇等。但這些藥物具有一定的副作用，會(huì)造成腸道系統(tǒng)紊亂等免疫疾病[5]。α-葡萄糖苷酶是一類能夠催化水解α-葡萄糖基的酶的總稱，分布廣泛，在人體內(nèi)可將飲食中的碳水化合物水解為單糖供人體吸收，是引起餐后血糖增加的重要酶類。因此，隨著糖尿病患者和潛在患者在全球范圍內(nèi)急劇增加，直接從日常飲食中尋找天然高效的α-葡萄糖苷酶抑制劑成為研究熱點(diǎn)。

蜂花粉是一種兼具食用與藥用價(jià)值的食品，富含營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)同時(shí)又有多種生理活性功能如增強(qiáng)免疫力、抗氧化、抗輻射、降血脂等[6-7]。近年來(lái)也有研究[8-9]報(bào)道了蜂花粉提取物具有降血糖的功效。蜂花粉細(xì)胞壁堅(jiān)硬，壁上存在萌發(fā)孔，可與外界聯(lián)通，但通常為閉鎖狀態(tài)，使得花粉細(xì)胞內(nèi)溶物難以溶出[10]。因此體外對(duì)蜂花粉進(jìn)行功效評(píng)價(jià)，必須進(jìn)行破壁處理，以釋放花粉的活性成分。破壁前后花粉品質(zhì)以及功能活性物質(zhì)會(huì)有所改變，這與破壁的方式存在很大的關(guān)聯(lián)性[11]。使用不同破壁方式處理的蜂花粉進(jìn)行α-葡萄糖苷酶活性抑制試驗(yàn)，據(jù)此可以推測(cè)產(chǎn)生抑制作用的主要成分。目前關(guān)于破壁方式影響蜂花粉降血糖功效方面的研究還未見(jiàn)報(bào)道。對(duì)于蜂花粉功能活性的研究當(dāng)前以醇提物為主，對(duì)水溶活性成分的報(bào)道比較少見(jiàn)。油菜蜂花粉在中國(guó)產(chǎn)量大，資源豐富，本試驗(yàn)擬以不同破壁方式處理的油菜蜂花粉水溶活性成分為研究對(duì)象進(jìn)行抑制α-葡萄糖苷酶的試驗(yàn)，以期對(duì)花粉中抑制α-葡萄糖苷酶的主要成分進(jìn)行篩選和評(píng)價(jià)，為開發(fā)出新的蜂花粉產(chǎn)品提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蜂花粉：油菜蜂花粉，市售；

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品：≥98%，國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司；

α-葡萄糖苷酶(α-glucosidase)：≥10 U/mg，美國(guó)Sigma公司；

4-硝基苯-α-D-喃葡萄糖苷(PNPG)：≥99%，美國(guó)Sigma公司；

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品、磷酸二氫鈉、磷酸氧二鈉、三氯乙酸、無(wú)水乙醇、3,5-二硝基水楊酸、無(wú)水碳酸鈉等：分析純，國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司；

纖維素酶：≥1 500 U/g，國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司；

果膠酶：≥50 U/g，國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司；

阿卡波糖：上海源葉生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)：UV-1800型，日本島津公司；

高速離心機(jī)：2-16R型，湖南恒諾儀器設(shè)備有限公司；

冷凍干燥機(jī)：Lab-1B-50E型，北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；

超聲清洗儀：KQ-5200B型，昆山美美超聲儀器有限公司；

酶標(biāo)儀：Multiskan FC型，美國(guó)Thermo Fisher公司；

掃描電鏡：JSM-6380LV型，日本JEOL公司。

1.3 方法

1.3.1 花粉破壁方式

(1) 溫差破壁：參照文獻(xiàn)[12]。

(2) 超臨界二氧化碳破壁：參照文獻(xiàn)[13]。

(3) 超聲輔助酶解破壁：參照文獻(xiàn)[14～15]略做改進(jìn)，取去雜研磨均勻的花粉10 g加入纖維素酶0.2 g，果膠酶0.8 g，40 ℃震蕩酶解3 h，超聲3 h。

(4) 未破壁花粉：研磨均勻后溶于水。

各破壁方法保證花粉的料液比為1∶8 (g/mL)，抽濾，離心(7 000 r/min，10 min)取上清液備用，殘?jiān)鋬龈稍锖箸R檢。

1.3.2 花粉黃酮、多糖、還原糖含量的測(cè)定 以葡萄糖為標(biāo)樣，用3，5-二硝基水楊酸法測(cè)定總糖和還原糖的含量?jī)烧咧罴礊槎嗵呛縖16]；以蘆丁為標(biāo)樣，采用亞硝酸鈉-硝酸鋁比色法測(cè)定總黃酮含量[17]。

1.3.3 粗多糖的提取 參照文獻(xiàn)[18～19]的方法略做改進(jìn)。將破壁花粉以1∶8 (g/mL)的比例溶于熱水，95 ℃蒸餾水回流提取1 h，提取過(guò)程中加入3%的三氯乙酸去蛋白，提取液減壓濃縮至原體積的1/2，加3倍體積無(wú)水乙醇沉淀12 h；取沉淀用蒸餾水溶解，離心(7 000 r/min，10 min)取上清液，再次加入3倍體積無(wú)水乙醇沉淀12 h，收集沉淀，冷凍干燥即得粗多糖。

1.3.4 蜂花粉水提物對(duì)底物(PNPG)的作用 分別在96孔板中加入不同破壁方式處理的花粉水提物10 μL按照1.3.5(1) 的方式測(cè)定吸光值。試驗(yàn)組：用緩沖溶液代替α-葡萄糖苷酶溶液；對(duì)照組：用緩沖溶液代替α-葡萄糖苷酶溶液和PNPG溶液。

1.3.5 酶反應(yīng)條件的篩選

(1) 酶反應(yīng)濃度的篩選：于96孔板中加入不同質(zhì)量濃度的α-葡萄糖苷酶溶液(0.000，0.893，1.786，3.571，5.357，7.143，8.929 μg/mL)140 μL，37 ℃孵育10 min，加入2.5 mmol/L 的PNPG 30 μL反應(yīng)一定時(shí)間，加入0.2 mol/L Na2CO380 μL終止反應(yīng)，于405 nm處測(cè)吸光值[5]。

(2) 酶反應(yīng)時(shí)間的篩選：取一定質(zhì)量濃度的α-葡萄糖苷酶溶液，37 ℃孵育10 min，加入2.5 mmol/L的PNPG 30 μL 反應(yīng)不同時(shí)間(0，10，15，20，25，30 min)后，加入0.2 mol/L Na2CO380 μL終止反應(yīng)，于405 nm處測(cè)吸光值。

(3) 最優(yōu)條件下試驗(yàn)樣品對(duì)酶的抑制作用：分別在96孔板中加入10 μL不同質(zhì)量濃度的葡萄糖溶液(0，10，20，30，40，50，60 mg/mL)、不同破壁方式處理的花粉水提物10 μL、不同質(zhì)量濃度的花粉多糖溶液(0.0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 mg/mL)按照1.3.5(1)的方式測(cè)定吸光值，對(duì)照組加10 μL緩沖溶液代替抑制劑，以3 mg/mL的阿卡波糖為陽(yáng)性對(duì)照，試驗(yàn)溫度37 ℃。每組平行試驗(yàn)3次。按式(1)計(jì)算抑制率[5]。

(1)

式中：

c——抑制率，%；

A1、A2——分別為對(duì)照樣的試驗(yàn)組與空白組的吸光值；

A3、A4——分別為樣品的試驗(yàn)組與空白組。

2 結(jié)果與分析

2.1 蜂花粉破壁率及主要抑酶成分含量變化

黃酮類化合物與多糖類物質(zhì)是蜂花粉水溶性物質(zhì)中的主要功能成分，并且結(jié)構(gòu)相對(duì)穩(wěn)定，近年來(lái)成為天然產(chǎn)物中的研究熱點(diǎn)。大量研究[20-23]表明，天然產(chǎn)物中的黃酮類和多糖類物質(zhì)具有降血糖的作用。本試驗(yàn)以總黃酮和多糖的溶出率為指標(biāo)結(jié)合破壁率，評(píng)價(jià)不同的花粉破壁方式，結(jié)果見(jiàn)表1。

由表1可知，各種破壁方式處理過(guò)的油菜蜂花粉破壁率及萌發(fā)孔打開率均明顯提高，證明破壁有效，破壁后的樣品多糖含量顯著增加，但總黃酮含量有增有減。相比于較溫和的溫差與超聲輔助酶法破壁方式，超臨界二氧化碳處理的花粉破壁率最高，但其總黃酮含量反而比未破壁的樣品低，說(shuō)明在超臨界二氧化碳激烈的破壁的過(guò)程中造成了某些成分的損失或改變，孫麗萍等[13]的研究也有相似的結(jié)論。

2.2 蜂花粉水提物對(duì)底物(PNPG)的作用

蜂花粉中本身含有多種酶類物質(zhì)，如α-淀粉酶等[24]，可能會(huì)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響。圖1顯示各處理方式得到的樣品試驗(yàn)組和對(duì)照組之間無(wú)顯著性差異，說(shuō)明花粉水提物本身并不會(huì)對(duì)底物產(chǎn)生影響進(jìn)而影響到試驗(yàn)結(jié)果。

表1 樣品破壁率、黃酮、多糖以及還原糖含量

圖1 樣品對(duì)底物的作用

2.3 酶反應(yīng)條件的篩選

通過(guò)對(duì)酶濃度和時(shí)間的篩選，確定最佳反應(yīng)條件為：酶質(zhì)量濃度1.786 μg/mL，反應(yīng)時(shí)間15 min。

2.4 蜂花粉水提物對(duì)a-葡萄糖苷酶的抑制作用

圖2的結(jié)果顯示不同破壁方式處理樣品對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率之間存在顯著性差異。超臨界二氧化碳流體處理的樣品減去還原糖后的抑制率出現(xiàn)負(fù)值(-8.07±0.93)%，另外3種樣品都為正值。溫差(13.73±1.15)%和超聲輔助酶法(16.70±0.87)%處理的樣品抑制率高于未處理樣品(9.68±0.89)%，說(shuō)明花粉破壁后有助于抑酶因子的溶出。4種樣品的總抑制率均低于陽(yáng)性對(duì)照的。這主要是因?yàn)榉浠ǚ鬯芤褐泻休^多葡萄糖，對(duì)葡萄糖苷酶有抑制作用(圖3)而使結(jié)果出現(xiàn)假陽(yáng)性，因此采用較低的試驗(yàn)濃度消除葡萄糖的影響，阿卡波糖選擇3 mg/mL的濃度是為了與后面的多糖試驗(yàn)濃度一致。蜂花粉成分復(fù)雜，富含多種生物活性物質(zhì)[25]，試驗(yàn)結(jié)果表明其中含有天然α-葡萄糖苷酶抑制成分，對(duì)比表1與圖2可知，樣品對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制效果與其中總黃酮含量呈正相關(guān)關(guān)系，可以推測(cè)蜂花粉中黃酮類化合物為α-葡萄糖苷酶抑制劑。

圖2 不同破壁方式處理的樣品的抑制率

超臨界二氧化碳流體處理的樣品對(duì)α-葡萄糖苷酶活性表現(xiàn)出促進(jìn)作用，可能是處理過(guò)程中瞬間釋放高壓使原本溶于二氧化碳流體中的功能活性成分隨之釋放到大氣中[26]，導(dǎo)致抑酶因子的損失或失活，使得總體上出現(xiàn)負(fù)值。基于目前油菜蜂花粉主要是作為一種食物，因此無(wú)論是在研究還是加工食用過(guò)程中都應(yīng)盡量使用相對(duì)溫和的破壁方式。

α-葡萄糖苷酶作用于α-1,4糖苷鍵，水解多糖為單糖，蜂花粉水提物中含有大量的單糖類物質(zhì)會(huì)對(duì)該酶起到負(fù)反饋抑制，出現(xiàn)假陽(yáng)性的結(jié)果。由圖3可知，葡萄糖濃度與抑制率近似呈直線關(guān)系，由此可推算不同濃度的還原糖對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用已排除干擾。

圖3 葡萄糖抑制率

2.5 粗多糖對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用

蜂花粉破壁后多糖含量顯著增加，可能是使其對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率上升的原因。花粉中黃酮類化合物已有前人作了系統(tǒng)的研究，但多糖類對(duì)α-葡萄糖苷酶活性作用的研究卻罕有報(bào)道[8]。蜂花粉多糖功能多樣且安全，備受人們喜愛(ài)并成為研究熱點(diǎn)，現(xiàn)已被應(yīng)用于醫(yī)藥、保健、化妝品等行業(yè)[27]。有研究[28]表明蜂花粉多糖類可以降低糖尿病小鼠的血糖值。因此，本試驗(yàn)提取水溶性粗多糖進(jìn)行α-葡萄糖苷酶抑制試驗(yàn)，由圖4可知，油菜蜂花粉多糖對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制率極低，在(3.46±0.31)%～(-0.78±0.03)%間波動(dòng)，且隨著多糖質(zhì)量濃度的增加，并沒(méi)有出現(xiàn)明顯的規(guī)律，說(shuō)明油菜蜂花粉粗多糖對(duì)α-葡萄糖苷酶活性沒(méi)有顯著影響。

圖4 多糖對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用

3 結(jié)論

本試驗(yàn)以油菜蜂花粉為研究對(duì)象，探索了蜂花粉水溶性成分對(duì)α-葡萄糖苷酶的作用，以及不同破壁方式對(duì)該作用的影響。試驗(yàn)證明：經(jīng)過(guò)分離提取的蜂花粉水溶性多糖對(duì)α-葡萄糖苷酶活性無(wú)影響，該結(jié)果對(duì)蜂花粉降糖機(jī)理進(jìn)行了理論補(bǔ)充，為后來(lái)的研究者提供了借鑒；蜂花粉水提物對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制率與黃酮含量呈正相關(guān)關(guān)系，破壁方式對(duì)其有顯著性影響；該結(jié)果證實(shí)了孫巖等[8-9]的結(jié)論，提示在生產(chǎn)和應(yīng)用過(guò)程中應(yīng)選擇合適的破壁方式處理蜂花粉。需要指出的是在相同抑制率的情況下，本試驗(yàn)中實(shí)際加入的總黃酮含量遠(yuǎn)低于孫巖等[8]的加入量，提示蜂花粉中可能還含有別的對(duì)α-葡萄糖苷酶有抑制作用的物質(zhì)有待研究與開發(fā)。

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Effects of wall breaking manners on the inhibition of alpha glucosidase activity in bee pollen

LIU Wen-jing1ZHANGZhi-xu2QINDan3

(1.CollegeofFoodScienceandTechnology,HunanAgriculturalUniversity,Changsha,Hunan410128,China;2.StateKeyLaboratoryofSubhealthInterventionTechnology,Changsha,Hunan410128,China; 3.CollegeofFoodScienceandTechnology,HunanAgriculturalUniversity,Changsha,Hunan410128,China)

10.13652/j.issn.1003-5788.2017.08.035

科技部國(guó)際科技合作專項(xiàng)(編號(hào)：2013DFA31790)

劉文靜，女，湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)在讀碩士研究生。

張志旭(1972—)，男，湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)講師，博士。 E-mail: 532000632@qq.com

2017—05—19