p38 MAPK通路參與舒巴坦誘導的大鼠腦缺血耐受

羨曉輝，高俊俠，齊 杰，李文斌

(河北醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院病理生理學教研室，河北 石家莊 050017)

·論著·

p38 MAPK通路參與舒巴坦誘導的大鼠腦缺血耐受

羨曉輝，高俊俠，齊 杰，李文斌*

(河北醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院病理生理學教研室，河北 石家莊 050017)

目的探討p38 MAPK信號通路在舒巴坦誘導大鼠腦缺血耐受中的作用。方法25只無特定病原體的Wistar大鼠分為5組，每組5只。①假手術組：側腦室注射生理鹽水10 μL，隨后行全腦缺血的假手術，手術只暴露和分離雙側椎動脈及雙側頸總動脈，不阻斷其血流；②全腦缺血組：首先側腦室注射生理鹽水10 μL，隨后即刻行8 min全腦缺血手術；③舒巴坦+全腦缺血組：首先給大鼠側腦室注射舒巴坦溶液(360 nmol，10 μL)，隨后即刻行8 min全腦缺血手術；④SB203580+舒巴坦+全腦缺血組：首先給大鼠側腦室注射SB203580溶液(5 nmol，10 μL)，30 min后給予舒巴坦(360 nmol，10 μL)側腦室注射，隨后即刻行8 min全腦缺血手術；⑤SB203580組：首先給大鼠側腦室注射SB203580(5 nmol，10 μL)，30 min后按照假手術組的方法，注射生理鹽水及行腦缺血假手術。末次手術后7 d處死動物，取腦組織進行硫堇染色，觀察大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)細胞的形態(tài)和神經(jīng)細胞密度，并進行組織分級。結果全腦缺血組大鼠海馬CA1區(qū)大片神經(jīng)細胞破壞、死亡，細胞排列疏松、紊亂，散在大量細胞碎片，神經(jīng)細胞密度降低明顯，組織學分級明顯升高；舒巴坦+全腦缺血組組織學分級明顯減低,神經(jīng)細胞密度明顯升高; SB203580+舒巴坦+全腦缺血組神經(jīng)細胞密度明顯降低，組織學分級明顯升高。結論p38 MAPK參與了舒巴坦預處理誘導的大鼠腦缺血耐受。

缺氧，腦；舒巴坦；大鼠

隨著中國社會老齡化程度日益加重以及社會生活、工作節(jié)奏的日益加快，缺血性腦損傷在臨床呈現(xiàn)多發(fā)勢態(tài)，嚴重威脅著大眾的健康。缺血性腦損傷的機制復雜[1]，其中興奮性氨基酸的大量釋放造成的興奮性神經(jīng)毒性作用在缺血性腦損傷發(fā)病過程中占有重要地位[2]。突觸間隙內(nèi)谷氨酸的清除主要依賴高親和性的興奮性氨基酸轉運系統(tǒng)進行，尤其是膠質(zhì)細胞上的谷氨酸轉運體(glialglutamatetransporter-1，GLT-1)，在很多腦區(qū)的谷氨酸穩(wěn)態(tài)維持中發(fā)揮重要作用。因此，調(diào)制腦內(nèi)GLT-1的功能是缺血性腦損傷防治的重要策略之一。研究表明，β內(nèi)酰胺類抗生素如頭孢曲松鈉可以上調(diào)大鼠海馬CA1區(qū)GLT-1的表達，從而使神經(jīng)細胞提高對腦缺血的耐受性[3]，但由于頭孢曲松鈉為臨床一線抗生素，大量應用會出現(xiàn)諸如菌群失調(diào)、耐藥菌株出現(xiàn)、嚴重胃腸道反應等，限制了其在臨床缺血性腦損傷防治中的應用。舒巴坦也屬于β內(nèi)酰胺類藥物，且抗菌作用弱，不良反應小。本研究應用大鼠全腦缺血模型，觀察舒巴坦預處理對全腦缺血再灌注引起的海馬CA1區(qū)神經(jīng)細胞遲發(fā)性死亡的影響，并進一步應用SB203580抑制p38MAPK通路活性，以探討p38MAPK通路在舒巴坦誘導的大鼠腦缺血耐受中的作用。

1 材 料 與 方 法

1.1 實驗動物及試劑 健康雄性無特定病原體Wistar大鼠25只，體質(zhì)量260～300g，購自河北省實驗動物中心。所有實驗動物單籠飼養(yǎng)，自由食水，在實驗室適應環(huán)境2d后用于實驗。動物實驗操作流程符合河北醫(yī)科大學動物實驗操作規(guī)范。主要試劑：舒巴坦標準品(中國食品藥品檢定研究院)，硫堇(美國Sigma)，SB203580 (美國PeproTech)。

1.2 實驗分組 各組動物分別側腦室預置給藥套管后，隨機分為以下5組，每組5只。①假手術(sham)組：首先側腦室注射生理鹽水 10μL，隨后即刻行全腦缺血的假手術；②全腦缺血組(ischemia)：首先側腦室注射生理鹽水 10μL，隨后即刻行8min全腦缺血手術；③舒巴坦+全腦缺血組(sulbactam+ischemia)：首先給大鼠側腦室注射舒巴坦溶液(360nmol，10μL)，隨后即刻行8min全腦缺血手術。④SB203580+舒巴坦+全腦缺血組(SB203580+sulbactam+ischemia)：首先給大鼠側腦室注射SB203580溶液(5nmol，10μL)，30min后給予舒巴坦(360nmol，10μL)側腦室注射，隨后即刻行8min全腦缺血手術，方法同舒巴坦+腦缺血組；⑤SB203580+假手術組(SB203580+sham)：首先給大鼠側腦室注射SB203580(5nmol，10μL)，30min后按照假手術組方法，注射生理鹽水及行腦缺血假手術。各組動物于全腦缺血假手術或全腦缺血再灌注后7d斷頭處死，進行腦組織病理學觀察，評價神經(jīng)細胞的存活情況。

1.3 手術操作及模型建立

1.3.1 側腦室置管與注射 實驗中舒巴坦、SB203580均采用側腦室注射給藥。首先進行大鼠側腦室置管，小動物麻醉機給予異氟烷持續(xù)吸入，在腦立體定位儀上進行固定，選用俯臥位，于大鼠顱骨頂部正中切開皮膚，刮剝顱頂骨膜，雙氧水局部處理，保持顱骨骨面干燥，參照大鼠腦解剖圖譜，確定側腦室定位位置，于前囟向右側1.5mm、向后0.8mm，在顱骨上用牙科鉆開孔，將給藥套管經(jīng)孔置入，套管插管深度3.8～4.0mm，牙科水泥固定，作為側腦室給藥的入路。術后動物單籠飼養(yǎng)，自由食水。動物恢復7d后，待手術應激消除、血腦屏障修復后，用于進一步實驗。

按照實驗時間點，使用PE連接管連接微量注射器和套管注射內(nèi)芯，旋開套管螺帽并拔出，將注射內(nèi)芯插入到側腦室套管內(nèi)，利用微量注射泵推動針栓給藥，10min完成注射，留針10min，防止藥物溢出。注射過程中注意安撫動物，使之保持安靜。注射結束后旋緊套管螺帽，繼續(xù)進行下一步實驗。

1.3.2 全腦缺血模型的制備 參考Pulsinelli等[4]的方法，應用小動物麻醉機給予大鼠異氟烷持續(xù)吸入，取俯臥位固定動物，于枕骨后背側，沿頸部正中1.5cm縱形切口，鈍性分離頸旁肌，充分暴露出第一頸椎翼狀孔，用預熱的電灼針在翼狀孔中燒灼，凝閉雙側椎動脈。用慶大霉素注射液沖洗切口，間斷縫合關閉切口。術后待動物恢復2d后，選用恢復良好的動物進行全腦缺血的下一步實驗。

椎動脈凝閉的大鼠在異氟烷麻醉下，仰臥位固定，頸部正中縱行開口，分離雙側頸總動脈。停止異氟烷吸入，待動物清醒后用動脈夾阻斷雙側頸總動脈血流，行成全腦缺血，持續(xù)8min后恢復雙側頸總動脈血流灌注。慶大霉素沖洗，縫合切口，回籠單籠飼養(yǎng)，于規(guī)定時間點進行處死、取材。手術過程中，白熾燈照射以維持動物體溫。成功形成全腦缺血的標準為：大鼠雙側頸總動脈被夾閉后，出現(xiàn)意識喪失，雙側瞳孔對光反射消失，瞳孔散大80%～100%，動物翻正反射消失。在缺血期中，上述意識喪失或神經(jīng)反射的改變均未恢復，動物保持平穩(wěn)呼吸，無抽搐，術后無偏癱或癲癇。全腦缺血的Sham手術只暴露和分離雙側椎動脈及雙側頸總動脈，不阻斷其血流，其余操作同全腦缺血手術。

1.4 腦組織病理學評價 快速剝離大腦，于視交叉后1～3mm冠狀切取腦組織，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，5μm組織切片，梯度脫蠟置水后進行組織切片硫堇染色，比較大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)細胞的神經(jīng)細胞密度(neuronaldensity,ND)和組織學分級(histologicalgrading,HG)改變，以確定不同條件下神經(jīng)細胞遲發(fā)性死亡情況。

1.4.1HG參照Kitagawa等[5]和Kato等[6]建立的神經(jīng)系統(tǒng)組織學分級方法，光學顯微鏡下觀察，對海馬CA1區(qū)神經(jīng)細胞的病理學改變確定分級。分級標準如下：0級，目標區(qū)域未見神經(jīng)細胞死亡；Ⅰ級，目標區(qū)域可見散在神經(jīng)細胞死亡；Ⅱ級，目標區(qū)域可見大片神經(jīng)細胞死亡；Ⅲ級，目標區(qū)域幾乎全部神經(jīng)細胞死亡。每只動物選擇3張切片，每張組織切片雙側均進行分級，采用雙側的平均等級為最終HG結果進行統(tǒng)計。

1.4.2ND在光學顯微鏡(40×)下觀察海馬CA1區(qū)，對每1mm2區(qū)段內(nèi)細胞膜完整、細胞核飽滿且核仁清晰的神經(jīng)細胞數(shù)目進行計數(shù)，每只動物選擇3張切片，每張組織切片兩側海馬分別計數(shù)3個區(qū)段，取平均數(shù)作為ND值進行統(tǒng)計分析。

1.5 統(tǒng)計學方法 應用Prism6.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)。計量資料比較分別采用F檢驗和q檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)細胞的形態(tài)學改變 假手術組：海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)細胞約為3～4層，整齊、致密排布，可見清晰、完整的細胞輪廓，胞內(nèi)有大量尼氏體著色，細胞核充實飽滿，核仁清晰(圖1A)。全腦缺血組：8min全腦缺血引起了海馬CA1區(qū)明顯的神經(jīng)細胞損傷，鏡下可見大片神經(jīng)細胞破壞、死亡，細胞排列疏松、紊亂，散在大量細胞碎片，殘存的細胞收縮，呈不規(guī)則狀，核濃染，核仁消失(圖1B)。舒巴坦+全腦缺血組：僅有散在細胞死亡，大部分細胞可見清晰、完整的細胞輪廓，整齊排列，層次清楚(圖1C)。SB203580+舒巴坦+缺血組：阻斷了舒巴坦介導的神經(jīng)保護作用，鏡下可見海馬CA1區(qū)分布著大量死亡的神經(jīng)細胞碎片及不規(guī)則形狀的殘存細胞，細胞核深染，核仁消失(圖1D)。SB203580 + 假手術組：未造成大鼠海馬CA1區(qū)的神經(jīng)細胞的明顯改變(圖1E)。

圖1 大鼠海馬硫堇染色顯微圖片(硫堇染色×400)A.可見清晰、完整的細胞輪廓,胞內(nèi)有大量尼氏體著色,細胞核充實飽滿,核仁清晰;B.可見大片神經(jīng)細胞破壞、死亡,細胞排列疏松、紊亂,散在大量細胞碎片,殘存的細胞收縮,呈不規(guī)則狀,核濃染,核仁消失;C.僅有散在細胞死亡,大部分細胞可見清晰、完整的細胞輪廓,整齊排列,層次清楚;D.可見海馬CA1區(qū)分布著大量死亡的神經(jīng)細胞碎片及不規(guī)則形狀的殘存細胞,細胞核深染,核仁消失;E.未造成大鼠海馬CA1區(qū)的神經(jīng)細胞的明顯改變Figure1 Representativethionin-stainedphotomicrographsofhippocampusofrats(thionicstaining×400)

2.2 各組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)細胞組織學分級比較 全腦缺血組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)細胞組織學分級較假手術組明顯升高；與全腦缺血組比較，舒巴坦+全腦缺血組組織學分級明顯降低；與舒巴坦+全腦缺血組相比較，SB203580+舒巴坦+全腦缺血組應用SB203580后，組織學分級明顯升高；SB203580+假手術組組織學分級與假手術組無明顯差別。見圖2。

圖2大鼠海馬CA1區(qū)組織學分級

Figure2ThehistologicalgradeintheCA1hippocampusofrats

2.3 各組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)細胞密度比較 全腦缺血組大鼠海馬CA1區(qū)ND值較假手術組明顯降低(P<0.05)；與全腦缺血組比較，舒巴坦+全腦缺血組ND值明顯升高(P<0.05)；與舒巴坦+全腦缺血組相比較，SB203580+舒巴坦+全腦缺血組ND值明顯降低(P<0.05)。 SB203580+假手術組海馬CA1區(qū)ND值未見明顯變化，與假手術組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 表1 各組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)細胞密度比較Table 1 Comparison of neuronal density in the CA1 hippocampus of rats among groups

*P<0.05 與假手術組比較 #P<0.05 與全腦缺血組比較

△P<0.05與舒巴坦+全腦缺血組比較(q檢驗)

3 討 論

腦缺血性損傷的發(fā)病機制復雜，涉及細胞能量代謝障礙、興奮性氨基酸毒性作用、炎癥反應過度[7]、細胞凋亡、細胞內(nèi)外離子穩(wěn)態(tài)破壞、NO失衡、自由基損傷[8]等多個方面。其中興奮性氨基酸釋放導致的興奮性神經(jīng)毒性作用被人們廣泛關注[9]。腦血流的中斷導致神經(jīng)細胞能量代謝障礙[10]，細胞膜功能下降，細胞內(nèi)外離子穩(wěn)態(tài)破壞(細胞內(nèi)高Na+[11]、Ca2+[12]，細胞外高K+)，導致神經(jīng)細胞去極化，突觸前膜谷氨酸大量釋放，同時細胞外高鉀抑制了突觸前膜對谷氨酸的再攝取[13-14]，最終導致突觸間隙內(nèi)谷氨酸大量堆積，與突觸后膜的相應受體結合，使神經(jīng)細胞持續(xù)興奮，導致神經(jīng)細胞的損傷[15]。本研究結果顯示，大鼠進行8 min全腦缺血后7 d，海馬CA1區(qū)神經(jīng)細胞大量死亡，細胞層次缺失，可見大量的細胞碎片，核濃染，固縮；與假手術組比較，全腦缺血組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)細胞組織學分級明顯升高，ND明顯降低。表明8 min的全腦缺血造成了大量神經(jīng)細胞遲發(fā)性死亡。

在遭受缺血打擊時，主要分布于星形膠質(zhì)細胞上的GLT-1的改變直接決定著神經(jīng)細胞的存活與否，其功能的調(diào)制在腦缺血性疾病的發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。腦缺血預處理可通過上調(diào)大鼠海馬CA1區(qū)GLT-1的表達，提高突觸間隙谷氨酸的清除能力，使神經(jīng)細胞損傷減輕[16]。頭孢曲松鈉預處理[3]也可以上調(diào)GLT-1的表達而誘導腦缺血耐受，但是由于頭孢曲松鈉為臨床一線抗生素，抗菌作用強大，臨床大量使用會帶來諸如菌群失調(diào)、耐藥菌株出現(xiàn)、真菌感染、嚴重胃腸道反應等多種不良后果。這些不良反應限制了頭孢曲松鈉應用于防治臨床缺血性腦損傷。舒巴坦也屬于β內(nèi)酰胺類藥物，其化學結構中雖然也具有β內(nèi)酰胺環(huán)，與頭孢曲松鈉類似，但其抗菌作用要遠遠弱于頭孢曲松鈉，且不良反應小，臨床上一般與其他β內(nèi)酰胺類抗生素聯(lián)合用藥，以增強抗生素的抗菌效應。在本研究中顯示，預先給予舒巴坦預處理可以使神經(jīng)細胞對隨后發(fā)生的全腦缺血打擊耐受性增強，大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)細胞輪廓清晰，排列整齊，僅有少量細胞死亡；與全腦缺血組比較，其組織學分級明顯降低，ND明顯升高(P<0.05)。表明舒巴坦預處理也可以誘導大鼠腦缺血耐受，但其機制有待進一步深入研究。

p38 MAPK屬于應激活化的蛋白激酶，是MAPKs家族的重要成員，細胞缺氧、活性氧、炎癥因子增多等因素均可能激活p38 MAPK信號通路，參與多種病理生理過程。諸多研究顯示p38 MAPK通路的大量活化參與了腦缺血性疾病時細胞的損傷過程。小鼠大腦中動脈阻塞后2 h缺血區(qū)的p38 MAPK活性明顯增加，可呈現(xiàn)明顯高峰[17]。大鼠全腦缺血時，在損傷嚴重的區(qū)域，p38 MAPK表達和活化明顯增多[18]，促進了炎癥因子的增多，炎癥因子又進一步激活p38 MAPK，兩者相互協(xié)同，促進了缺血性腦病時神經(jīng)細胞的死亡。而抑制p38 MAPK通路活性，可以使腦外傷大鼠的二次腦損傷發(fā)生概率大大降低[19]。通過預處理等方式調(diào)節(jié)p38 MAPK的表達，使其表達量適度增高也介導了缺血早期機體的內(nèi)源性保護機制出現(xiàn)。Zhang等[20]報道，腦缺血預處理可以使大鼠海馬CA1區(qū)p38 MAPK表達適度增高，介導GLT-1的表達增高，從而減輕隨后的缺血打擊造成的神經(jīng)細胞遲發(fā)性死亡；抑制p38 MAPK的表達，這種神經(jīng)保護作用也被阻斷。上述研究結果表明p38 MAPK在腦缺血耐受的誘導過程中發(fā)揮著重要的作用。鑒于此，本研究中進一步探討了p38 MAPK信號通路在舒巴坦誘導的腦缺血耐受中的作用，結果顯示預先給予SB203580抑制p38 MAPK信號通路后，舒巴坦預處理誘導的這種神經(jīng)保護作用也被抑制，海馬CA1區(qū)分布著大量死亡的神經(jīng)細胞碎片及不規(guī)則形狀的殘存細胞，細胞核深染，核仁消失；與舒巴坦+全腦缺血組相比，其組織學分級明顯增高，ND明顯減低。表明p38 MAPK信號通路可能參與了舒巴坦誘導的腦缺血耐受過程。

綜上所述，p38 MAPK信號通路參與了舒巴坦預處理誘導大鼠腦缺血耐受，但由于p38 MAPK信號通路與腦缺血后的多種病理生理過程相關，故舒巴坦預處理時，p38 MAPK通路活化的下游機制有待進一步研究。

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(本文編輯：許卓文)

p38MAPKsignalingpathwayparticipatesinthesulbactam-inducedbrainischemictoleranceinrats

XIANXiao-hui,GAOJun-xia,QIJie,LIWen-bin*

(DepartmentofPathophysiology,theCollegeofBasicMedicalScience,HebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050017,China)

ObjectiveTo investigate the role of p38 MAPK signaling pathway in sulbactam-induced brain ischemic tolerance in rats.MethodsThe model of rat global cerebral ischemia was used. After a stainless steel cannula was implanted in the right lateral ventricle，25 healthy male Wistar rats were randomly divided into the following groups(n=5 in each group). ①Sham group(normal saline+sham): the rats were administrated with normal saline of 10 μL via the cannula first, and then the sham operation for global cerebral ischemia was performed. ②Global cerebral ischemia group(ischemia): normal saline(10 μL) was administrated via the cannula first and then performed 8 minutes of global cerebral ischemia immediately. ③Sulbactam+ischemic group: sulbactam solution(10 μL, 360 nmol) was administrated via the cannula first and then performed 8 minutes of global cerebral ischemia immediately. ④SB203580+sulbactam+ischemic group: SB203580(10 μL, 5 nmol) was administrated via the cannula 30 minutes before sulbactam(10 μL, 360 nmol) and then performed 8 minutes of global cerebral ischemia immediately. ⑤SB203580+sham group: SB203580 solution(10 μL, 5 nmol) was administrated via the cannula first and then performed sham operation for global cerebral ischemia immediately. The neuropathological evaluation including histological grade(HG) and neuronal density(ND) was performed using the method of thionic staining to observe the survival situation of neurons in CA1 hippocampus.ResultsGlobal cerebral ischemia for 8 min induced obvious delayed neuronal death(DND)which resulted in large area of neuronal absence in the CA1 hippocampus with the significant increase in HG and decrease in ND. Pre-treatment with sulbactam effectively prevented the DND normally induced by the global brain ischemia. Compared with ischemic group，the HG was significantly reduced, and the ND increased significantly. Pretreatment with SB203580, an inhibitor of p38 MAPK signal pathway, blocked the neuroprotective effect mediated by sulbactam. Compared with sulbactam+ischemic group, the ND was significantly decreased, and the HG increased significantly.Conclusionp38 MAPK signaling pathway may participate in the sulbactam-induced brain ischemic tolerance in rats.

hypoxia,brain;sulbactam;rat

R845.22

A

1007-3205(2017)10-1117-06

2017-08-02；

2017-08-11

河北省高等學校科學技術研究青年基金項目(QN2015210)

羨曉輝(1978-)，男，河北冀州人，河北醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院病理生理學教研室講師，醫(yī)學博士，從事神經(jīng)病理生理學研究。

*通訊作者。E-mail:Liwbsjz@163.com

10.3969/j.issn.1007-3205.2017.10.001