硫代黃素T與溶菌酶淀粉樣纖維結合的熒光停流動力學

馬剛,秦哲，劉思陽，商艷麗，賈寶環

(河北大學 化學與環境科學學院，藥物化學與分子診斷教育部重點實驗室，河北 保定 071002)

硫代黃素T與溶菌酶淀粉樣纖維結合的熒光停流動力學

馬剛,秦哲，劉思陽，商艷麗，賈寶環

(河北大學 化學與環境科學學院，藥物化學與分子診斷教育部重點實驗室，河北 保定 071002)

蛋白淀粉樣纖維與多種疾病有關，如阿爾茨海默病、帕金森病、Ⅱ型糖尿病等.熒光染料硫代黃素T(ThT)廣泛地應用于淀粉樣纖維的定性和定量測定.但從目前的研究來看，ThT與淀粉樣纖維結合的動力學機理研究尚非常少見.本研究應用熒光停流動力學技術對鹽酸胍誘導的溶菌酶淀粉樣纖維和ThT的結合動力學進行了研究，提出ThT與溶菌酶淀粉樣纖維結合的動力學符合雙位點平行反應機理模型.本研究對深入理解熒光染料分子與蛋白淀粉樣纖維的作用有借鑒意義.

硫代黃素T；溶菌酶；淀粉樣纖維；動力學

蛋白纖維化是一種獨特的蛋白聚集行為.在纖維化過程中，單體蛋白通過自組裝過程形成纖維狀的蛋白聚集體[1-2]，這種蛋白聚集體又被稱為淀粉樣纖維.研究表明，許多威脅人類健康的疾病都和某種特定蛋白在組織和細胞中的纖維化沉積有關.這些疾病包括熟知的阿爾茲海默病、帕金森病、Ⅱ型糖尿病等多種退形性疾病.這類疾病可以被統一歸為淀粉樣蛋白沉積疾病[3].蛋白淀粉樣纖維與這些重大疾病的密切關聯使相關研究近年來在國內外方興未艾[2,4-9].蛋白淀粉樣纖維的定性定量檢測無疑是蛋白纖維化研究中的一個重要內容.其中，基于硫代黃素T(thioflavin T，簡稱ThT)熒光染料的熒光光譜技術廣泛地應用于淀粉樣纖維的定性和定量測定[10-11].ThT屬于芳香族化合物，如圖1所示，中間的C—C鍵連接了苯并噻唑和苯胺環，2個芳香環可以以C—C鍵為軸自由轉動.當ThT被激發后由于該自由轉動的存在而導致熒光淬滅.但當ThT與蛋白淀粉樣纖維結合后，芳香環的轉動受到了抑制，則會發出熒光.一般實驗中，人們使用450 nm左右的光對ThT進行激發，如果ThT結合了蛋白淀粉樣纖維，便會在480 nm左右發射很強的熒光；如果體系中不存在蛋白淀粉樣纖維，ThT在480 nm處幾乎不發熒光[11].一般而言，該熒光的強度和體系中蛋白淀粉樣纖維的量成正比，因此，ThT熒光檢測法常用于淀粉樣纖維的定量分析，比如用于測量淀粉樣纖維的S-型生成動力學曲線.

ThT在蛋白纖維化研究中的重要作用，使人們對其多種物理化學性質產生了極大興趣.目前有許多研究報道致力于深刻理解ThT的光物理性質以及ThT和蛋白淀粉樣纖維的作用位點和作用模式[12-13]．相比這些研究，有關ThT和蛋白淀粉樣纖維結合的動力學過程，文獻中報道非常少見[14-15].在非常早期的熒光動力學研究中，LeVine[14]研究了ThT與Aβ1-40多肽形成的纖維的結合動力學，其傾向于認為ThT和纖維的結合過程是一個多步連續反應過程，包括1個類似雙分子反應的結合過程和3個連續的復合物構型順變過程.而近期的熒光動力學研究中，Sabate等[15]研究了ThT與HET-s多肽形成的纖維的結合動力學，他們傾向于認為ThT和纖維的結合就是一個簡單的類似雙分子一步結合的過程.這主要是因為淀粉樣纖維的結合位點是一種不易發生構象變化的剛性β-折疊結構，而早期LeVine的假說中提出的淀粉樣纖維結合ThT后會發生構象變化的情況與這一理論預期不符.筆者新近利用紫外吸收停流動力學技術的研究也支持Sabate的論點[16]，即ThT與淀粉樣纖維的結合動力學是一個多位點平行反應，每個位點上的結合過程都是簡單的雙分子一步反應.

為更加深入地理解ThT結合蛋白淀粉樣纖維的動力學過程，本文將以雞卵清溶菌酶形成的蛋白淀粉樣纖維為模型體系，應用基于ThT熒光檢測的停流動力學技術，研究ThT和纖維結合的動力學過程并提出和動力學實驗結果相匹配的機理模型.

圖1 ThT的分子結構Fig.1 Molecular structure of ThT

1 材料與方法

1.1 實驗試劑

雞卵清溶菌酶蛋白(以下簡稱溶菌酶)、剛果紅(>85%)、鹽酸胍(>99%)由美國Sigma-Aldrich公司購得.ThT(超純級)由美國AnaSpec公式購得.磷酸氫二鉀(>99%)、磷酸二氫鉀(>99%)由阿拉丁購得.超純水(電阻率18.2 MΩ·cm)由美國密理博公司的Millipore超純水機制得.

1.2 溶菌酶淀粉樣纖維的制備及預處理方法

溶菌酶纖維的制備條件參照文獻[17].配制2 mg/mL溶菌酶、3 mol/L鹽酸胍、20 mmol/L 磷酸鹽緩沖溶液 (pH=6.3)，經0.22 μm濾膜過濾.放入恒溫混勻儀中孵育4 h，孵育溫度為50 ℃，頻率為900 r/min.經孵育后，上述溶液由澄清變為渾濁.用原子力顯微鏡、ThT熒光分析法、剛果紅染色法、紅外光譜對制備的纖維進行表征和確認.

在進行動力學研究前，需要對溶菌酶淀粉樣纖維進行預處理.預處理的目的是獲得分散良好的穩定膠體體系，從而提高動力學數據的穩定性.預處理過程中，先進行離心處理，以去除鹽酸胍以及緩沖溶液對后續實驗的影響.離心機轉速為10 000 r/min，每次離心10 min，共離心3次.每次離心后棄去上清液，然后加入超純水混勻再重懸.經3次離心處理后，將獲得的蛋白淀粉樣纖維在冰浴環境下進行超聲，功率為130 W，超聲時間1 s，間隔時間5 s，總時間5 min.經過預處理，溶菌酶纖維懸濁液變為穩定的在純水中的膠體溶液.所獲得的溶液可以進一步用純水稀釋以獲得動力學實驗所需濃度.

1.3 溶菌酶纖維的ThT熒光分析

采用日立F-7000熒光分光光度計對溶菌酶淀粉樣纖維進行ThT熒光檢測.激發波長450 nm，狹縫寬度5 nm；發射波長460～600 nm，狹縫寬度10 nm.檢測器光電倍增管的電壓為500 V.取新制備的2 mg/mL溶菌酶纖維10 μL加入到1 mL 10 μmol/L ThT的磷酸鹽溶液中，混勻后用1 cm石英池進行熒光測量.單純的10 μmol/L ThT磷酸鹽溶液的熒光光譜做空白對照.

1.4 溶菌酶纖維的剛果紅染色分析

剛果紅染色分析實驗在德國Implen紫外可見超微量分光光度計上進行.剛果紅濃度為5 μmol/L，緩沖體系為10 mmol/L磷酸鹽溶液，pH =7.4并含有體積分數0.5% 的乙醇.染色分析時，取新制備的2 mg/mL的溶菌酶纖維30 μL加入到1 mL剛果紅溶液中，充分作用后測量紫外可見光譜.單純的剛果紅溶液做空白對照.

1.5 溶菌酶纖維的紅外光譜分析

對溶菌酶纖維的固態樣品進行紅外測試.固態樣品制備方式如下：將前述經離心水洗去除鹽酸胍后的樣品冷凍干燥，然后進行紅外測試.紅外光譜測試采用德國Bruker公司Vertex 70傅里葉變換紅外光譜儀.光譜采集使用衰減全反射(ATR)模式.數據采集的分辨率為 4 cm-1，掃描次數32次.

1.6 溶菌酶纖維的原子力顯微鏡形貌表征

原子力圖像通過俄羅斯的NT-MDT Solver P47 掃描探針顯微鏡，采用輕敲模式測得.測量時，將預處理前的溶菌酶纖維溶液用高純水稀釋2倍，然后滴在新鮮剝離的云母表面.靜置5 min后，用去離子水沖洗云母表面，自然風干后測樣.

1.7 動力學實驗方法

動力學實驗采用SFM-300停流動力學裝置進行實驗.實驗時，1個樣品室加入0.4 mmol/L ThT，另外2個樣品室儲存加入9.6 μmol/L預處理過的溶菌酶纖維.進行停流動力學實驗時，3個樣品室中的樣品按ThT：淀粉樣纖維：淀粉樣纖維=1∶2∶2的體積比，同時打入到停流反應池內.混合后，ThT的濃度為80 μmol/L，溶菌酶纖維濃度為7.7 μmol/L.基于以往研究，鹽酸胍誘導的溶菌酶纖維的位點數目基本上每3個溶菌酶單體構成一個結合位點[18]，這樣80 μmol/L 的ThT和7.7 μmol/L的溶菌酶纖維的濃度組合可以保證ThT的量相對于溶菌酶纖維上的位點而言是大大過量的，保證纖維上的所有結合位點均被結合.熒光激發波長為435 nm，PMT上加裝450 nm的濾光片.數據采集間隔：0～2 s內每50 ms監測1次，2～10 s內每100 ms監測1次.

2 結果與討論

2.1 溶菌酶淀粉樣纖維的表征

首先對預處理前鹽酸胍誘導的溶菌酶纖維采用原子力顯微鏡進行形貌表征，如圖2所示，纖維高度大約為20 nm.這里需要指出的是，鹽酸胍誘導法制備的淀粉樣纖維的形貌與筆者之前研究的淀粉樣纖維的形貌有較大的不同[19]，這主要是由于纖維化具體條件的差異.之前筆者的研究中采用酸性和加熱的條件，使溶菌酶先進行水解，生成一系列較小分子量的多肽，這些多肽再進一步進行纖維化，這樣獲得的纖維較為光滑和細長.但缺點是成分復雜，不適合進行定量動力學分析.在本研究中，使用鹽酸胍誘導法獲得的溶菌酶蛋白由純的溶菌酶單體構成，成分單一，適合動力學研究，而且其結合位點大致數目在從前文獻中也有報道.

對上述鹽酸胍誘導法獲得的溶菌酶纖維，筆者進行了ThT熒光表征、剛果紅染色分析和紅外光譜表征.ThT與溶菌酶纖維結合的熒光光譜如圖3所示.通過和單純ThT溶液在相同條件下測得的熒光光譜對比.發現當ThT與溶菌酶纖維結合后，當激發波長為450 nm時，熒光發射光譜在480 nm附近會產生明顯的熒光增強，而單純ThT溶液在這個區域基本無熒光.

圖2 溶菌酶纖維的原子力形貌表征Fig.2 AFM image of lysozyme fibrils

圖3 ThT與溶菌酶纖維結合后的熒光光譜和單純ThT熒光光譜對比Fig.3 Fluorescence spectrum of ThT bound onto lysozyme fibrils and ThT control

剛果紅與溶菌酶纖維結合的紫外可見光譜如圖4所示.通過和單純剛果紅溶液在相同條件下測得的光譜對比，發現當剛果紅與溶菌酶纖維結合后，在540 nm處出現吸收峰增強.這是淀粉樣纖維的一個特征光譜標志[20].圖5中檢測了溶菌酶纖維的紅外光譜.淀粉樣纖維的形成必然伴隨β-折疊結構的產生.β-折疊結構在蛋白紅外光譜的酰胺Ⅰ帶1 640 cm-1以下區域有特征吸收峰[21].這個峰的存在可以作為蛋白淀粉樣纖維成功制備的一個佐證.如圖5所示，其在1 629 cm-1附近有明顯的吸收峰，這個峰就來自淀粉樣纖維中β-折疊結構.

圖4 剛果紅與溶菌酶纖維結合后的紫外可見吸收光譜和單純剛果紅吸收譜的對比Fig.4 UV-Vis spectroscopy of Congo red bound onto lysozyme fibril and Congo red control

圖5 溶菌酶纖維的紅外光譜Fig.5 FTIR spectrum of lysozyme fibril

2.2 ThT結合溶菌酶纖維的熒光停流動力學研究

應用熒光檢測的方法，結合停流技術研究了ThT結合溶菌酶纖維的動力學過程.實驗中，為了確保動力學反應在ThT過量的條件下進行，使ThT大過量，即在ThT濃度為80 μmol/L、淀粉樣纖維濃度為7.7 μmol/L的條件下進行熒光停流動力學實驗.圖6為熒光變化曲線，筆者看到隨著反應時間的推移，ThT熒光先呈現一個快速上升的過程，這一過程大約持續2 s，之后呈現緩慢上升的過程，最后在10 s左右趨于平緩變化.

圖6 ThT與淀粉樣纖維結合的停流動力學曲線Fig.6 Stop-flow kinetic curve of ThT binding onto amyloid fibril

對這一動力學曲線，進行了數學擬合.發現單指數擬合效果不好.雙指數可以獲得非常好的擬合效果，(函數形式:y=A1e-k1t+A2e-k2t)相關系數R2為0.999，同時把相關擬合參數列于表1.

表1 ThT與溶菌酶纖維結合的動力學參數Tab.1 kinetic parameters of ThT binding onto amyloid fibril

2.3 平行反應動力學模型的建立和推導

筆者提出應用多位點平行反應模型來解釋觀察到的雙指數擬合現象，具體推導如下.假設淀粉樣纖維上存在多個可以與ThT進行結合的位點，如圖7所示：

圖7 ThT與淀粉樣纖維結合的多位點平行反應模型Fig.7 Multi-site parallel mechanism of ThT binding onto amyloid fibril

其中a、b、c… 分別為0時刻ThT和纖維上各結合位點的濃度，x1、x2… 分別為t時刻纖維上各結合位點結合的ThT的濃度，也等同于各個位點在t時刻被消耗掉的濃度.則各平行反應的反應速率如下：

(1)

(2)

?

當a遠大于b、c、時，對本研究而言也就是相當于ThT過量的情況，

(3)

(4)

?

將上式積分可得：

x1=b-bexp(-k1at)，

(5)

x2=c-cexp(-k2at)，

(6)

?

因為在熒光條件下，所得信號為各結合位點上ThT的總和，所以

x=x1+x2+…=(b+c+…)-bexp(-k1at)-cexp(-k2at)-…

(7)

因為熒光強度與濃度成正比，所以體系實測的總熒光強度為

Ix=(Ib+Ic+…)-Ibexp(-k1at)-Icexp(k2at)-…

(8)

由以上(8)推導看出，熒光動力學曲線為雙指數方程形式，符合多位點平行反應機理模型.具體到筆者的溶菌酶纖維體系，其雙指數熒光動力學形式說明我們溶菌酶纖維上有2個結合位點，每個結合位點上ThT均以一個簡單的一步結合的方式與纖維結合，2個位點上的結合動力學反應平行發生.

3 結論

本文應用停流動力學技術研究了ThT與溶菌酶淀粉樣纖維結合的快速動力學過程，發現ThT和溶菌酶纖維結合的熒光增長曲線符合雙指數增長模式，提出了一個雙位點平行反應動力學模型.筆者希望本研究對進一步深入理解熒光染料分子與淀粉樣纖維之間的相互作用提供有益借鑒.

[1] NELSON R,EISENBERG D.Structural models of amyloid‐like fibrils[J].Advances in Protein Chemistry，2006,73: 235-282.DOI:10.1016/S0065-3233(06)73008-X.

[2] SAWAYA M R,SAMBASHIVAN S,NELSON R,et al.Atomic structures of amyloid cross-beta spines reveal varied steric zippers[J].Nature,2007,447: 453-457.DOI:10.1038/nature05695.

[3] CHITI F,DOBSON C M.Protein misfolding,functional amyloid,and human disease[J].Annual Review of Biochemistry,2006,75: 333-366.DOI: 10.1146/annurev.biochem.75.101304.123901.

[4] LANSBURY P T,LASHUEL H A.A century-old debate on protein aggregation and neurodegeneration enters the clinic[J].Nature,2006,443: 774-779.DOI:10.1038/nature05290.

[5] SACHSE C,FAENDRICH M,GRIGORIEFF N.Paired beta-sheet structure of an a beta(1-40)amyloid fibril revealed by electron microscopy[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,2008,105: 7462-7466.DOI: 10.1073/pnas.0712290105.

[6] TYCKO R,WICKNER R B.Molecular structures of amyloid and prion fibrils: Consensus versus controversy[J].Accounts of Chemical Research,2013,46: 1487-1496.DOI: 10.1021/ar300282r.

[7] 張嵐,楊延蓮,王琛.調節分子對茁淀粉樣蛋白的聚集調控及細胞毒性抑制效應[J].生物物理學報， 2010,26: 649-661.

ZHANG L,YANG Y L,WANG C.Regulation of aggregation and cytotoxicity of β-Amyloid by molecular modulators[J].ACTA Biophysica sinica,2010,26：649-661.

[8] 劉鵬,趙玉芬,李艷梅.Tau蛋白介導阿爾茲海默病的機理及相關藥物[J].中國科學:化學， 2010,40: 906-913.

LIU P,ZHAO Y F,LI Y M.Advances in Tau-mediated neurodegeneration and Tau-focused drug for Alzhehimer’s disease[J].Scientia Sinica Chimica,2010,40：906-913.

[9] 劉夫鋒,董曉燕,孫彥.海藻糖抑制淀粉質多肽42構象轉變的分子動力學模擬[J].物理化學學報， 2010,26(6): 1643-1650.

LIU F F,DONG X Y,SUN Y.Molecular dynamics simulation of the conformational transition of amyloid peptide 42 inhibited by trehalose[J].Acta Physico-Chimica Sinica,2010,26(6): 1643-1650.

[10] NAIKI H,HIGUCHI K,HOSOKAWA M,et al.Fluorometric determination of amyloid fibrils in vitro using the fluorescent dye,thioflavin T1[J].Analytical Biochemistry,1989,177: 244-249.DOI: 10.1016/0003-2697(89)90046-8.

[11] LEVINE H,3RD.Quantification of beta-sheet amyloid fibril structures with thioflavin T[J].Methods in Enzymology,1999,309: 274-284.DOI: 10.1016/S0076-6879(99)09020-5.

[12] WOLFE L S,CALABRESE M F,NATH A,et al.Protein-induced photophysical changes to the amyloid indicator dye thioflavin T[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,2010,107: 16863-16868.DOI: 10.1073/pnas.1002867107.

[13] AMDURSKY N,EREZ Y,HUPPERT D.Molecular rotors: What lies behind the high sensitivity of the thioflavin-T fluorescent marker[J].Accounts of Chemical Research,2012,45: 1548-1557.DOI: 10.1021/ar300053p.

[14] LEVINE H,3RD.Stopped-flow kinetics reveal multiple phases of thioflavin T binding to alzheimer beta (1-40)amyloid fibrils[J].Archives of Biochemistry and Biophysics,1997,342: 306-316.DOI:10.1006/abbi.1997.0137.

[15] SABATE R,LASCU I,SAUPE S J.On the binding of thioflavin-T to HET-s amyloid fibrils assembled at pH 2[J].Journal of Structural Biology,2008,162: 387-396.DOI:10.1016/j.jsb.2008.02.002.

[16] QIN Z,SUN Y,JIA B H,et al.Kinetic mechanism of thioflavin T binding onto the amyloid fibril of hen egg white lysozyme[J].Langmuir,2017,33: 5398-5405.DOI: 10.1021/acs.langmuir.7b00221.

[17] VERNAGLIA B A,HUANG J,CLARK E D.Guanidine hydrochloride can induce amyloid fibril formation from hen egg-white lysozyme[J].Biomacromolecules,2004,5: 1362-1370.DOI: 10.1021/bm0498979.

[18] SULATSKAYA A I,KUZNETSOVA I M,TUROVEROV K K.Interaction of thioflavin T with amyloid fibrils: Stoichiometry and affinity of dye binding,absorption spectra of bound dye[J].Journal of Physical Chemistry B,2011,115: 11519-11524.DOI: 10.1021/jp207118x.

[19] ZOU Y,LI Y,HAO W,et al.Parallel beta-sheet fibril and antiparallel beta-sheet oligomer: New insights into amyloid formation of hen egg white lysozyme under heat and acidic condition from FTIR spectroscopy[J].Journal of Physical Chemistry B,2013,117: 4003-4013.DOI: 10.1021/jp4003559.

[20] KLUNK W E,JACOB R F,MASON R P.Quantifying amyloid by congo red spectral shift assay[J].Methods in Enzymology，1999,309: 285-305.DOI:10.1016/S0076-6879(99)09021-7.

[21] BARTH A,ZSCHERP C.What vibrations tell us about proteins[J].Quarterly Reviews of Biophysics,2002,35: 369-430.DOI: 10.1017/S0033583502003815.

(責任編輯：梁俊紅)

Fluorescence-detectedstopped-flowkineticinvestigationofthioflavinTbindingontotheamyloidfibriloflysozyme

MAGang,QINZhe,LIUSiyang,SHANGYanli,JIABaohuan

(Key Laboratory of Medicinal Chemistry and Molecular Diagnosis of Ministry of Education,College of Chemistry and Environmental Science,Hebei University,Baoding 071002,China)

Deposition of amyloid fibrils in tissues and organs is relevant to a wide range of devastating human diseases,including Alzheimer’s disease,Parkinson’s disease,and type Ⅱ diabetes.Thioflavin T (ThT)is widely used as a fluorescent probe for qualitative and quantitative detections of amyloid fibrils.Yet the exact kinetic mechanism of ThT binding onto amyloid fibril remains elusive.In this study,we used fluorescence-detected stopped-flow technique to study the binding mechanism of ThT onto the amyloid fibril of hen egg white lysozyme induced by guanidine hydrochloride.We proposed a kinetic binding mechanism to interpret our experimental observations.Our results showed that the binding of ThT onto lysozyme fibril follow a dual-site parallel binding mechanism.We believe our work is beneficial for better understanding of the interaction between fluorescent dye and amyloid fibril.

thioflavin T;lysozyme;amyloid fibril;kinetics

O643

A

1000-1565(2017)05-0476-07

10.3969/j.issn.1000-1565.2017.05.006

2017-03-26

國家自然科學基金資助項目(21075027)；河北省自然科學基金資助項目(B2011201082；B2016201034)

馬剛 (1971—)，男，北京人，河北大學教授，博士，主要從事與蛋白纖維化聚集相關的研究.E-mail：gangma@hbu.edu.cn

馬剛 (1971—)，男，北京人，河北大學教授，博士，主要從事與蛋白纖維化聚集相關的研究.E-mail：gangma@hbu.edu.cn；商艷麗(1979—)，女，河北保定人，河北大學副教授，博士，主要從事材料化學方面的研究.E-mail：ylshang@hbu.edu.cn