樹枝狀聚合物納米藥物的制備及性能表征

單玉萍， 陳 陽， 周思源， 汪世陽

(長春工業大學 化學與生命科學學院， 吉林 長春 130012)

樹枝狀聚合物納米藥物的制備及性能表征

單玉萍， 陳 陽*， 周思源， 汪世陽

(長春工業大學 化學與生命科學學院， 吉林 長春 130012)

以甲氨蝶呤作為藥物負載，采用紫外可見分光光度計研究了不同代數(G2.0、G4.0、G4.5、G8.0)polyamidoamine樹枝狀大分子(PAMAM)對甲氨蝶呤的包覆效果，結果表明,相同末端-NH2基團不同代數的PAMAM樹枝狀大分子載藥量依次為G8.0>G4.0>G2.0，而具有-COOH基團的G4.5PAMAM樹枝狀大分子的包覆效果相對最差。

PAMAM樹枝狀大分子； 甲氨蝶呤； 納米藥物； 藥物負載

0 引 言

MTX是一種二氫葉酸還原酶抑制劑，其與二氫葉酸還原酶有高度親和力，比二氫葉酸結合二氫葉酸還原酶的能力高出10倍，使二氫葉酸不能轉變為四氫葉酸，造成DNA合成障礙，干擾RNA，從而抑制細胞的生長，是廣譜抗腫瘤藥物。與此同時,對體內尤其是增殖迅速的組織,如粘膜、骨髓等同樣也可以造成損害，導致一系列的臨床癥狀，表現出對人體較大的毒性作用[1-2]。人們一直努力開發能夠減少副作用的新型藥物轉運體系，以降低MTX的毒副作用。聚酰胺-胺型樹枝狀大分子(PAMAM)具有穩定、無免疫原性，對生物活性劑轉運效率等特點[3-4]，是近年來國外開發的一類新型功能高分子，引起相關領域普遍關注[5]。PAMAM分子在結構上具有高度的集合對稱性、精確的分子結構、大量的官能團、分子內存在空腔及分子鏈增長具有可控性等許多獨特的性質，使其有可能成為MTX最理性的包覆藥物。

PAMAM分子通過Michael加成和酰胺化反應的重復次數控制，每重復一次得到的樹枝狀大分子稱為一代[6-7]。聚酰胺-胺樹枝狀大分子由初始引發核、與初始引發核徑向連接的重復支化單元和與最外層重復支化單元連接的末端基組成，通過這種方法合成的樹枝狀大分子具有確定分子量、結構精確、分子形狀及尺寸可控，呈分散性[8]，還具有穩定、在使用劑量下無毒性、適時降解且降解產物無毒性等特點[9]。

聚酰胺-胺樹枝狀大分子表面官能團的數目隨代數的增加而呈指數增長，最終導致表面空間擁擠而產生幾何變化[10]，當代數較低時一般為開放性的分子構型，隨著代數的增加和支化的繼續，從第四代樹枝狀大分子開始就形成了較為封閉的、多孔的球狀結構，第八代則是表面幾乎無空隙的球狀結構[11]。

PAMAM獨特的多孔球狀結構，內部空腔不僅可物理包裹小分子藥物，通過靜電引力和氫鍵相互作用將藥物分子捕獲在樹枝狀大分子內或樹枝狀大分子間[12]，而且其端基官能團比同類聚合物具有更高的化學反應性，可以連接各種藥物、抗體等。該載藥系統可通過簡單攪拌包埋藥物，避免化學合成對藥物的破壞和釋放。當進入人體后，PAMAM載藥一方面通過擴散從大分子內部釋放出來，另一方面，在樹枝狀大分子表面以共價結合藥物分子可通過化學鍵的水解或者酶解進行釋放。

樹枝狀大分子作為藥物載體可延長藥物在血液中的滯留時間，控制藥物在體內的釋放效率，保護藥物以免受到環境的破壞，且可以通過改變酸堿度釋放藥物，實現靶向和控制釋放，具有很好的緩控釋作用和靶向性[13-14]。

目前，國外期刊多見于PAMAM分子作為藥物載體的緩控釋及靶向性等研究。此外，PAMAM分子體進入細胞的動態過程也有報導。葉玲[15]等研究了G5.0 PAMAM分子與藥物MTX的包合與釋放，結果表明，G5.0 PAMAM分子對藥物有很好的緩控釋作用。Yang B[16]等利用AFM力示蹤技術追蹤PAMAM單分子進入細胞的動態過程。首次明確了PAMAM單分子進入細胞所需的力和速率。但是對比不同代數PAMAM分子的載藥能力國內外罕有報導。

由于不同代數PAMAM結構的不同，將顯著影響對藥物的載藥量。文中將采用不同代數的PAMAM樹枝狀大分子作為載體，通過物理包覆方法，研究PAMAM包覆MTX負載率的影響，為樹枝狀聚合物納米藥物的制備提供實驗參考。

1 實驗部分

1.1試劑與儀器

PAMAM樹枝狀大分子G2.0、G4.0、G8.0、G4.5，均來自威海晨源高分子；

甲氨蝶呤MTX(Aladdin);

超濾管(3K);

移液槍(Eppendorf);

離心機(Eppendorf);

磁力攪拌器;

分析天平;

Cary 50型紫外可見分光光度計,上?？茖W儀器有限公司;

G2.0:Mw=3 256 g/mol，末端氨基數16，溶劑為甲醇溶液，質量分數40%；

G4.0:Mw=14 215 g/mol，末端氨基數64，溶劑為甲醇溶液，質量分數40%；

G8.0:Mw=233 383 g/mol，末端氨基數1 024，溶劑為甲醇溶液，質量分數40%；

G4.5:Mw=23 438 g/mol，末端羧基數128，固體粉末。

1.2物理包覆

稱取MTX 1 mg投入反應瓶中，加入1 mL去離子水，形成飽和溶液。按照摩爾比(MTX)/(PAMAM樹枝狀大分子)=1/50進行包覆。通過公式 [m/M(MTX)/50]*Mw(PAMAM樹枝狀大分子)/40%，計算得到需要的不同代數PAMAM樹枝狀大分子甲醇溶液的質量。反應體系用氮氣保護，密封，避光，控制溫度35 ℃，磁力攪拌器攪拌，轉速500 r/min，攪拌反應12 h。

由于G4.5PAMAM樹枝狀大分子為固體，故計算公式為[m/M(MTX)/50]*M(G4.5PAMAM樹枝狀大分子)。其余實驗步驟均同上。

1.3實驗處理

反應12 h后，取下反應瓶，將PAMAM樹枝狀大分子與MTX包覆物轉移至3 K的超濾管離心10 min，轉速10 000 r/min。由于PAMAM樹枝狀大分子與MTX的包覆物分子尺寸較大，留在超濾管上層，所以加入1 mL無水乙醇于超濾管中，離心清洗上層產品除去殘留雜質后，再用去離子水離心清洗，得到干凈的產物。G2.0、G4.0、G4.5、G8.0 PAMAM樹枝狀大分子與MTX包覆物的處理方法均與上述相同。得到的不同代數的PAMAM樹枝狀大分子與MTX包覆物產品均用UV-Vis進行表征。

2 結果與討論

不同代數PAMAM樹狀大分子示意圖如圖1所示。

圖1 G2.0、G4.0、G4.5、G8.0 PAMAM結構示意圖

所有代數PAMAM樹狀大分子都是對稱枝狀的球形結構。整數代PAMAM樹狀大分子有著共同的重復單元。

圖1(a)為G2.0 PAMAM樹狀大分子的結構式及示意圖，G2.0PAMAM樹狀大分子的末端有16個-NH2基團;

圖1(b)為G4.0PAMAM樹狀大分子示意圖，末端為64個-NH2基團;

圖1(c)為G4.5PAMAM樹狀大分子示意圖，末端為128個-COOH基團;

圖1(d)為G8.0PAMAM樹狀大分子結構示意圖，末端為1 024個-NH2基團。隨著PAMAM樹狀大分子代數增加，分子尺寸也隨之增大，分子球體表面化學基團數量呈指數增加。

通過實驗，將MTX藥物分子包覆進入不同代數的PAMAM樹枝狀大分子中。樹枝狀大分子負載藥物甲氨蝶呤的示意圖如圖2所示。

樹枝狀結構表示PAMAM樹枝狀化合物，球形結構表示MTX藥物分子。藥物分子經過包覆后可以進入PAMAM樹枝狀大分子內部間隙。實驗得到的產物用于后續表征測試分析。

不同代數 PAMAM樹枝狀大分子和MTX的UV-Vis圖譜如圖3所示。

(a) G2.0 PAMAM的UV-Vis圖譜

(b) G4.0 PAMAM的UV-Vis圖譜

(c) G4.5 PAMAM的UV-Vis圖譜

(d) G8.0 PAMAM的UV-Vis圖譜

(e) MTX的UV-Vis圖譜圖3 不同代數PAMAM樹枝狀大 分子和MTX的UV-Vis圖譜

由圖3可見，不同代數PAMAM樹枝狀大分子的紫外吸收峰形相似，在λ=279 nm附近均有紫外吸收特征峰，λ=210 nm附近具有較高的紫外吸收峰。其紫外吸收曲線的相似性可能是因為PAMAM樹枝狀大分子都具有相同的結構重復單元和對稱的枝化結構(見圖1)。而MTX在λ=370、302、265、205 nm處有紫外吸收峰，其中λ=370 nm處紫外吸收峰的峰值較低，而波長在302、265、205 nm處對應的紫外吸收峰高度相近。

通過實驗得到不同代數PAMAM樹枝狀大分子負載藥物MTX后形成的包覆產物的UV-Vis圖譜如圖4所示。

圖中(a)、(b)、(c)、(d)分別是G2.0、G4.0、G4.5、G8.0 PAMAM樹枝狀大分子與MTX形成納米藥物的UV-Vis圖譜。

(a) G2.0 PAMAM-MTX納米藥物的UV-Vis圖譜

(b) G4.0 PAMAM-MTX納米藥物的UV-Vis圖譜

(c) G4.5 PAMAM-MTX納米藥物的UV-Vis圖譜

(d) G8.0 PAMAM-MTX納米藥物的UV-Vis圖譜圖4 不同代數PAMAM-MTX納米藥物的UV-Vis圖譜

圖中,B1、B2、B3、B4是不同代數PAMAM-MTX納米藥物的UV-Vis圖譜。對照A1、A2、A3、A4不同代數PAMAM樹枝狀大分子紫外吸收曲線可以看出，包覆產物的紫外吸收曲線發生很大變化。其中波長在370、302、260 nm處的峰為產物的UV-Vis特征峰，所有產物的UV-Vis圖譜中，紫外吸收峰對應的波長位置相同。其中，λ=370 nm處是MTX的UV-Vis特征峰。PAMAM樹枝狀大分子包覆MTX后，MTX在λ=302 nm或260 nm處較強的UV-Vis特征峰掩蓋了PAMAM樹枝狀大分子在λ=275 nm附近較弱的UV-Vis特征峰，但在波長200～260 nm區間內PAMAM的UV-Vis特征峰未受影響，由此可知,MTX包覆進入了PAMAM內部空腔。

整數代的PAMAM樹枝狀大分子的末端都是相同的氨基，不同整數代PAMAM的末端樹枝狀結構的數量隨著代數的增加而呈指數增加，空間尺寸和內部空腔數量也隨之增大(見圖1)。由于載體大小不同，不同整數代PAMAM樹枝狀大分子包裹MTX藥物分子的量也不同。不同整數代的末端為氨基的PAMAM包覆MTX產物的UV-Vis圖譜如圖5所示。

圖5 不同整數代的末端為氨基的PAMAM 包覆MTX產物的UV-Vis圖譜

圖中：A、B、C三條曲線分別對應不同代數的PAMAM-MTX產物。不同代數的PAMAM-MTX納米藥物的UV-Vis峰對應波長位置基本相同。由于不同代數PAMAM包覆MTX的量不同，所以在λ=250 nm到λ=370 nm之間，PAMAM-MTX納米藥物中MTX的UV-Vis特征峰對應縱坐標的吸光度值大小也不同。在包覆反應實驗中，投入不同代數PAMAM樹枝狀大分子的物質的量相同，MTX投藥量均為1 mg，由此可知，PAMAM-MTX中MTX的量體現了不同整數代PAMAM包覆藥物的性能。由郎伯比爾定律A=lg(1/T)=Kbc可知，K為摩爾吸收系數，b為吸收層厚度，c為吸光物質的濃度，對于MTX在K、b、c為定值情況下，由于吸光度A值可確定不同整代數的PAMAM包覆MTX的實際效果。圖5中所示G2.0、G4.0、G8.0 PAMAM-MTX包覆量呈上升趨勢。G2.0包覆量最低，G8.0包覆量最高。這清晰表明,PAMAM樹枝狀大分子隨著代數增加，空間結構增大，內部空腔增多，其包覆藥物的能力也顯著提高。

G4.5PAMAM-MTX和G4.0PAMAM-MTX的UV-Vis對比圖如圖6所示。

圖6 G4.5PAMAM-MTX和G4.0PAMAM-MTX 的UV-Vis對比圖

圖6中,G4.0PAMAM-MTX和G4.5PAMAM-MTX納米藥物中MTX的量相差很大，G4.0 PAMAM包覆MTX的量明顯高于G4.5 PAMAM。G4.0和G4.5代PAMAM樹枝狀大分子相差半代，二者都是樹枝狀展開的球形空間結構。G4.5 PAMAM分子尺寸較G4.0 PAMAM略大，但二者末端基團不同，G4.0末端是-NH2，G4.5末端是-COOH。分子尺寸稍大的G4.5 PAMAM包覆藥物的性能比分子尺寸略小的G4.0 PAMAM差，這與二者末端不同官能團的性質有直接關系。G4.5 PAMAM末端的大量羧基在溶液中電離形成帶負電的球體，與同是帶羧基的MTX相互排斥，盡管G4.5 PAMAM分子尺寸較大，但分子球體表面大量的負電荷屏蔽了內部樹枝結構形成的空腔[17]，導致G4.5PAMAM樹枝狀大分子包覆藥物能力明顯下降。另外，PAMAM對pH有很強敏感性，由于G4.5PAMAM和MTX帶有大量羧基使得反應體系呈酸性而導致PAMAM樹枝狀結構僵化[18]，這也導致包覆藥物的能力會下降。所以，相對于PAMAM的分子大小來說，PAMAM樹枝狀大分子表面官能團的性質對載體包覆藥物能力影響更大。

3 結 語

采用物理包覆的方法制備的不同代收PAMAM-MTX納米藥物，整數代末端帶-NH2的PAMAM包覆藥物MTX的性能從高代數到低代數依次減弱。這是因為樹枝狀結構呈指數減小后，內部空腔減小導致的。另外，G4.5代PAMAM樹枝狀大分子和MTX末端大量羧基在溶液中電離而使溶液為酸性，由于PAMAM樹枝狀大分子對pH敏感，在酸性溶液中分子變得僵硬，這也對包覆效果有很大影響。而類似G4.5這樣的半代PAMAM樹枝狀大分子末端是-COOH形成表面帶負電的球面，帶有負電的球面會與溶液中因MTX電離產生的-COOH末端產生排斥作用，從而大大降低PAMAM樹枝狀大分子包覆藥物的性能。

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Preparationandcharacterizationofpolyamidoaminedendrimersnano-drugs

SHAN Yuping, CHEN Yang*, ZHOU Siyuan, WANG Shiyang

(School of Chemistry & Life Science, Changchun University of Technology, Changchun 130012, China)

Taking Methotrexate (MTX) as drug encapsulation, the encapsulation effect of different algebra (G2.0、G4.0、G4.5、G8.0)polyamidoamine dendrimers (PAMAM)to MTX is investigated with UV-visible spectrophotometer. The results indicate that encapsulation rate of the PAMAM with -NH2base is as following: G8.0>G4.0>G2.0; while the encapsulation effect of G4.5PAMAM with -COOH is the worst.

PAMAM dendrimers； Methotrexate (MTX)； nano-drugs； drug encapsulation.

O 652.1

A

1674-1374(2017)04-0386-07

2017-04-16

吉林省自然科學基金資助項目(20160520133JH)

單玉萍(1982-)，女，漢族，黑龍江尚志人，長春工業大學教授，博士，主要從事細胞膜上跨膜轉運動態過程研究,E-mail:shanyp@ccut.edu.cn. *通訊作者：陳 陽(1994-)，男，漢族，吉林德惠人，主要從事樹枝狀聚合物包覆納米藥物的制備及性能表征方向研究,E-mail:chenyang5186@126.com.

10.15923/j.cnki.cn22-1382/t.2017.4.12