不同種小鼠乙型肝炎模型的建立及其感染狀況研究*

周 云，李 盛，唐宗生，楊東亮，宋景嬌

不同種小鼠乙型肝炎模型的建立及其感染狀況研究*

周 云，李 盛，唐宗生，楊東亮，宋景嬌

目的探討建立急性或慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染小鼠模型的方法。方法采用高壓尾靜脈注射pAAV/HBV1.2表達質粒，建立急性或慢性HBV感染小鼠模型，采用ELISA法檢測HBV抗原，采用RT-PCR法檢測免疫相關分子基因，使用FACS檢測肝內淋巴細胞活化情況，采用酶聯免疫斑點實驗（ELISPOT）法檢測脾臟相關免疫細胞特征。結果成功建立急性和慢性高壓尾靜脈注射HBV感染小鼠模型；在急性BALB/c小鼠模型，血清HBsAg持續時間分別為（3.25±1.04） w，顯著短于慢性 C57BL/6 小鼠組【（10.0±3.74）w，P＜0.05）】；在 BALB/c小鼠模型，注射2.5 μg病毒質粒小鼠血清HBsAg持續時間為（3.67±1.03）w，顯著長于注射50 μg組【（2.33±0.52）w，（P＜0.05）】；在高壓尾靜脈注射后第10 d，BALB/c小鼠脾臟出現了HBcAg特異性T淋巴細胞。結論成功建立高壓尾靜脈注射HBV感染小鼠模型，發現宿主遺傳背景、免疫應答狀態和病毒劑量影響HBV感染小鼠模型的建立。

乙型肝炎；pAAV/HBV1.2表達質粒；高壓尾靜脈注射；小鼠

作者單位：430022武漢市 華中科技大學同濟醫學院附屬協和醫院感染性疾病科（周云，李盛，唐宗生，楊東亮）；附屬同濟醫院實驗醫學中心（宋景嬌）；河南大學醫學院（周云）

乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）感染呈全球范圍廣泛流行，慢性感染者達3.5億人。因此，HBV感染是全球一大公共衛生問題[1，2]。HBV感染可引起急性和慢性肝炎，并與肝硬化和肝癌的發生密切相關。成人感染HBV后通常表現為急性自限性肝炎，僅有5%會發展為慢性感染，而新生兒感染后約90%發展為慢性感染。然而，HBV慢性感染的機制尚不明確[3]。為了研究HBV感染的免疫病理發生機制，迫切需要建立合適的動物模型。小鼠為目前應用最廣泛的實驗動物之一，遺傳背景清晰，其免疫學特征已被廣泛研究。HBV轉基因小鼠模型已成為廣泛應用的小鼠模型。但是，小鼠屬于免疫耐受模型，不適合研究HBV清除機制[4]。因此，我們建立一種簡便、快捷、經濟實用的高壓尾靜脈注射感染HBV小鼠模型，可用于急慢性HBV感染的致病機制研究。

1 材料與方法

1.1 動物與試劑 SPF級雄性BALB/c和C57BL/6小鼠，6～8周齡，體質量為18～22 g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，飼養于華中科技大學同濟醫學院實驗動物中心。所有動物實驗均符合本校動物實驗倫理學委員會的規定。pAAV和pAAV/HBV1.2質粒由臺灣大學陳培哲教授惠贈。檢測HBsAg試劑盒購自上海科華生物工程股份有限公司；Endo-free Plasmid Maxi Kit購自美國OMEGA公司；ONE Step SYBR PrimerScript RT-PCR Kit購自日本TAKAR公司；動物組織總RNA提取試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；酶聯免疫斑點檢測試劑盒（ELISPOT）購自深圳達科為生物技術有限公司。重組HBcAg和HBsAg購自以色列ProSpec公司。PE標記抗鼠CD69抗體及同型對照購自美國Ebioscience公司。本實驗所用引物均購自德國QIAGEN公司。

1.2 HBV感染小鼠模型的建立 將10 μg重組質粒pAAV/HBV1.2溶于相當于小鼠體質量10%的生理鹽水，混勻后轉移至注射器備用。用75%酒精消毒小鼠尾部，再用遠紅外理療儀照射2～3 min，致小鼠尾靜脈充盈并清晰可見，在尾靜脈末端1/3處注入HBV重組質粒，在5～8 s內完成注射。在高壓尾靜脈注射后定期采血，連續采血12 w。采血方法為，給予1%戊巴比妥鈉150 μl腹腔注射，麻醉后用滅菌毛細管從小鼠眼眶內側采血約300 μl，離心分離小鼠血清，凍存于-80℃。在高壓尾靜脈注射后第10、20、30 d處死小鼠，取肝組織，部分肝組織用10%中性福爾馬林固定，用于石蠟切片，另一部分肝組織置液氮凍存后保存于-80℃冰箱。

1.3 血清HBsAg檢測 采用雙抗夾心ELISA法檢測，將小鼠血清與1×PBS按照1:10比例稀釋，充分混勻后加入96孔板，每孔加稀釋血清50 μl，同時設立陽性對照、陰性對照和空白對照，再加等體積的酶結合物，輕輕混勻，37℃孵育1 h，洗板5次，加顯色劑A液和B液各50 μl，37℃孵育30 min，加終止液50 μl，在酶標儀讀取450 nm吸光度值。

1.4 肝組織免疫相關分子mRNA檢測 取肝組織20 mg，加裂解液RL 300 μl，用研磨棒研磨組織，然后加入去離子水590 μl和蛋白酶K 10 μl，混勻后56℃水浴20 min。離心后取上清，緩慢加入0.5倍無水乙醇，轉入吸附柱中，離心后棄廢液，再加入去蛋白液350 μl，離心后棄液，再向柱中加入DNaseⅠ,離心后棄液，再加入漂洗液 500 μl，最后加去離子水50 μl，洗脫。以總RNA為模板，采用RT-PCR法檢測細胞因子和CD分子mRNA水平，按照 One Step SYBR PrimeScript RT-PCR Kit說明配制反應體系，PCR反應條件為95℃ 5 s，60℃20 s，共40個循環。以β-actin為內參，采用Pfaffl法計算目的基因水平。

1.5 小鼠脾細胞抗原刺激反應檢測 在高壓尾靜脈注射pAAV/HBV1.2后20 d，給予1%戊巴比妥200 μl腹腔注射，麻醉小鼠，摘眼球采血，斷頸處死小鼠，無菌分離小鼠脾臟，用玻璃注射器活塞研磨脾臟，使用小鼠淋巴細胞分離液分離淋巴細胞，調整細胞密度至4×106個細胞/毫升。接種脾淋巴細胞于96孔ELISPOT包被板，加抗原刺激物HBcAg、HBsAg、CMV 和 ConA，終濃度為 0.5 μg/ml，在37℃，5%CO2培養箱無菌培養30～36 h，在培養過程中不移動培養板。待斑點顯色反應，扣出孔內培養基，加入冰冷的去離子水200 μl，4℃靜置10 min，細胞處于低滲而裂解，用1×Washing Buffer洗板5次，加生物素標記抗體100 μl，37℃孵育1 h，洗板5次，再加酶聯親和素100 μl，37℃孵育1 h，洗板，加AEC顯色工作液100 μl，室溫避光靜置15～45 min，自來水沖洗板子正反面3～5次，終止顯色，采用ELISPOT斑點計數儀計數細胞。

1.6 肝內淋巴細胞活化檢測 在高壓尾靜脈注射pAAV/HBV1.2后第10 d、20 d和30 d，給予小鼠1%戊巴比妥200 μl腹腔內注射，采血后斷頸，處死小鼠，放置于75%酒精中浸泡3 min，切開皮膚和腹膜，暴露肝臟，將PBS10 ml緩慢通過肝門靜脈灌洗肝臟，將肝臟放置于70 μm濾網中研磨，加膠原酶Ⅱ裂解肝組織，用lympholyte-M液分離肝內淋巴細胞。加熒光抗體表面染色，每孔肝內淋巴細胞加PBS 100 μl，洗滌1次，加入抗PE-CD69抗體或同型對照（1:100），每孔 50 μl，4℃避光，抗原抗體結合反應30 min，再用PBS洗滌1次，在流式細胞儀Calibur檢測，觀察肝內T淋巴細胞活化情況。

1.7 統計分析 應用GraphPad Prism軟件作圖，應用SPSS 17.0統計軟件對實驗數據進行分析，計量資料以（±s）表示，采用兩獨立樣本 t檢驗，對血清HBsAg陽性持續率采用Kaplan-Meier分析，P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 不同小鼠血清HBsAg水平變化比較 在注射相同劑量的pAAV/HBV1.2情況下，BALB/c小鼠血清HBsAg持續時間為（3.25±1.04）w，顯著低于C57BL/6 組【（10.0±3.74）w，P＜0.01）】；自高壓尾靜脈注射后第1 d～注射后第12 w，經Kaplan-Meier分析，C57BL/6小鼠HBsAg持續陽性率顯著高于BALB/c小鼠（P＜0.05，圖 1），說明我們成功建立了高壓尾靜脈注射HBV感染小鼠模型，但是小鼠遺傳背景影響了HBsAg陽性持續時間。

圖1 不同遺傳背景小鼠血清HBsAg陽性水平和持續時間比較A：C57BL/6小鼠血清HBsAg陽性水平顯著高于BALB/c小鼠；B：C57BL/6小鼠血清HBsAg陽性持續時間顯著長于BALB/c 小鼠（n=8～14）

2.2 注射病毒劑量影響HBV持續時間 在BALB/c小鼠模型，注射 pAAV/HBV1.2 2.5 μg，血清HBsAg陽性持續時間為（3.67±1.03）w，顯著長于50 μg 劑量組【（2.33±0.52） w，P＜0.05，圖 2A】；經Kaplan-Meier分析，注射2.5 μg劑量組小鼠血清HBsAg陽性率顯著高于50 μg劑量組（P＜0.05，圖2B）。我們發現，在一定注射劑量范圍內，注射病毒質粒質量越多，血清HBsAg清除速度越快。

圖2 注射不同劑量pAAV/HBV1.2質粒BALB/c小鼠血清HBsAg陽性水平和持續時間比較A：在BALB/c小鼠模型，經高壓尾靜脈注射不同劑量pAAV/HBV1.2后，發現注射小劑量組（2.5 μg）小鼠HBsAg陽性水平顯著高于大劑量組（50 μg）小鼠；B：注射不同劑量pAAV/HBV1.2小鼠，血清HBsAg陽性持續時間比較，經Kaplan-Meier分析，發現大劑量組小鼠血清HBsAg持續時間反而顯著短于小劑量組小鼠（n=6）

2.3 不同遺傳背景小鼠肝組織免疫相關分子水平比較 在高壓尾靜脈注射pAAV/HBV1.2后第4 d，BALB/c小鼠和 C57BL/6小鼠肝組織 IFN-γ、IL-10、TGF-β和PDL-1 mRNA水平差異無統計學意義，但C57BL/6小鼠肝組織IL-6和FOXP3 mRNA 水平顯著高于 BALB/c小鼠（P＜0.05，圖 3），暗示C57BL/6小鼠血清HBsAg持續陽性可能與肝內免疫負調控分子FOXP3表達升高有關。

2.4 肝內T淋巴細胞活化動態變化 給予BALB/c小鼠高壓尾靜脈注射pAAV空載體對照質粒或pAAV/HBV1.2各10 μg，在注射后第10 d，注射pAAV/HBV1.2組小鼠肝內CD69+/CD8+T淋巴細胞活化比例顯著升高，在第20 d和30 d下降（P＜0.05，圖4）。

圖3 不同遺傳背景小鼠肝組織免疫相關分子mRNA水平比較 在高壓尾靜脈注射pAAV/HBV1.2后第4 d，發現C57BL/6小鼠肝組織IL-6和FOXP3 mRNA水平顯著高于BALB/c小鼠

圖4 肝內CD8+T淋巴細胞CD69分子動態變化 在BALB/c小鼠模型，在注射pAAV/HBV1.2后第10 d，肝內 CD8+T淋巴細胞被活化，而在第20 d和30 d，卻不再見到T淋巴細胞被活化

2.5 HBsAg和HBcAg特異性T淋巴細胞數量的比較 BALB/c小鼠在高壓尾靜脈注射pAAV或pAAV/HBV1.2 10 μg后第20 d，以分泌IFN-γ為特征，未發現HBsAg特異性T細胞，而HBcAg特異性T細胞數量顯著增加（P＜0.05，圖5），說明HBcAg能致敏淋巴細胞，可能在清除HBV感染過程中發揮作用。

圖5 HBsAg和HBcAg特異性T細胞數量變化 在BALB/c小鼠模型，經高壓尾靜脈注射pAAV/HBV1.2后第20 d，未見HBsAg特異性T細胞，而HBcAg特異性T細胞數量顯著增加（P＜0.05）

3 討論

HBV感染宿主范圍狹窄，目前僅人類和黑猩猩可感染HBV。由于倫理及經費等問題，應用黑猩猩進行科學研究受到了限制。HBV轉基因小鼠屬于免疫耐受模型，無法用于HBV自限性清除的研究[3，5]。本實驗將pAAV/HBV1.2質粒經高壓尾靜脈注射BALB/c小鼠體內，產生急性HBV復制過程，模擬人類急性自限性感染過程[4，6，7]。該模型既探討了HBV清除機制，又為HBV感染小鼠模型的建立提供技術上的支持。

HBV清除與動物遺傳背景和年齡相關。我們的實驗結果證明HBV在C57BL/6小鼠體內清除速度慢于BALB/c小鼠，與BALB/c小鼠對HBsAg所產生的特異性免疫應答強于C57BL/6小鼠有關[8]。宿主年齡越大，清除HBV速率越快，免疫功能健全的成人感染后常為自限性感染，而嬰幼兒感染多為持續性慢病毒感染[9，10]。

注射的病毒劑量影響HBV感染的持續時間[11，12]。具有正常免疫功能的小鼠，在給予小劑量的HBV腺病毒載體后，可以導致HBV感染持續存在，而大劑量HBV注射將導致病毒被快速清除[13]。

適應性免疫通常被認為在清除HBV方面發揮重要的作用[14，15]。病毒特異性細胞毒性T淋巴細胞（CTL）直接與感染的肝細胞接觸，并殺傷清除肝細胞。然而，這并不是最有效的清除方式[16]。特異性CTL分泌IFN-γ，通過抑制病毒復制及衣殼體組裝而呈非溶解性清除病毒[17，18]。在急性自限性感染時，HBV DNA在病毒復制高峰后2～3周下降90%，肝臟不出現明顯的病理性損傷，說明CD8+T細胞分泌的 IFN-γ 等細胞因子能非溶解性清除 HBV[14，19，20]。我們在急性HBV感染小鼠模型檢測到HBcAg特異性分泌IFN-γ的T淋巴細胞，因而認為HBcAg或其形成的核衣殼在清除HBV感染過程中起一定的作用。

[1]Burns GS，Thompson AJ.Viral hepatitis B:clinical and epidemiological characteristics.Cold Spring Harb Perspect Med，2014，4（12）:a024935.

[2]Liaw YF Chu CM.Hepatitis B virus infection.Lancet，2009，373（9663）:582-592.

[3]中華醫學會肝病學分會和感染病學分會.慢性乙型肝炎防治指南（2015年版）.實用肝臟病雜志，2016，19（3）：Ⅴ-ⅩⅩⅢ.

[4]Huang LR，Wu HL，Chen PJ，et al.An immunocompetent mouse model for the tolerance of human chronic hepatitis B virus infection. Proc Natl Acad Sci U S A，2006，103 （47）:17862-17867.

[5]Thomas E，Liang TJ.Experimental models of hepatitis B and C-new insights and progress.Nat Rev Gastroenterol Hepatol，2016，13（6）:362-374.

[6]Yang PL，Althage A，Chung J，et al.Hydrodynamic injection of viral DNA:a mouse model of acute hepatitis B virus infection.Proc Natl Acad Sci U S A，2002，99（21）:13825-13830.

[7]Lin YJ，Wu HL，Chen DS，et al.Hepatitis B virus nucleocapsid but not free core antigen controls viral clearance in mice.J Virol，2012，86（17）:9266-9273.

[8]Milich DR，Chisari FV.Genetic regulation of the immune response to hepatitis B surface antigen （HBsAg）.I.H-2 restriction of the murine humoral immune response to the a and d determinants of HBsAg.J Immunol，1982，129（1）:320-325.

[9]Chou HH，Chien WH，Wu LL，etal.Age-related immune clearance of hepatitis B virus infection requires the establishment of gut microbiota.Proc Natl Acad Sci U S A，2015，112（7）:2175-2180.

[10]Guidotti LG，Chisari FV.Immunobiology and pathogenesis of viral hepatitis.Annu Rev Pathol，2006，1:23-61.

[11]Tian Y，Chen WL，Kuo CF，et al.Viral-load-dependent effects of liver injury and regeneration on hepatitis B virus replication in mice.J Virol，2012，86（18）:9599-9605.

[12]Asabe S，Wieland SF，Chattopadhyay PK，et al.The size of the viral inoculum contributes to the outcome of hepatitis B virus infection.J Virol，2009，83（19）:9652-9662.

[13]Huang LR，Gabel YA，Graf S，et al.Transfer of HBV genomes using low doses ofadenovirus vectors leads to persistent infection in immune competent mice.Gastroenterology，2012，142（7）:1447-1503.

[14]Guidotti LG，Rochford R，Chung J，et al.Viral clearance without destruction ofinfected cells during acute HBV infection.Science，1999，284（5415）:825-829.

[15]Guidotti LG，Chisari FV.Noncytolytic control of viral infections by the innate and adaptive immune response.Annu Rev Immunol，2001，19:65-91.

[16]Chisari FV，Isogawa M，Wieland SF.Pathogenesis of hepatitis B virus infection.Pathol Biol，2010，58（4）:258-266.

[17]Guidotti LG，Isogawa M，Chisari FV.Host-virus interactions in hepatitis B virus infection.Curr Opin Immunol，2015，36:61-66.

[18]Tan A，Koh S，Bertoletti A.Immune response in hepatitis B virus infection.Cold Spring Harb Perspect Med，2015，5（8）:a021428.

[19]Wieland S，Thimme R，Purcell RH，et al.Genomic analysis of the host response to hepatitis B virus infection.Proc Natl Acad Sci USA，2004，101（17）:6669-6674.

[20]Thimme R，Wieland S，Steiger C，et al.CD8（+） T cells mediate viral clearance and disease pathogenesis during acute hepatitis B virus infection.J Virol，2003，77（1）:68-76.

（收稿：2016-10-26）

（本文編輯：陳從新）

Establishment of hepatitis B virus infection model in different mice by hydrodynamic injection of pAAV/HBV1.2 plasmid

Zhou Yun，Li Sheng，Tang Zongsheng，et al.Department of Infectious Disease，Union Hospital，Tongji Medical College，Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430022，China

Hepatitis B；pAAV/HBV1.2 plasmid；Hydrodynamic injection；Mice

10.3969/j.issn.1672-5069.2017.05.007

國家傳染病防治科技重大專項項目（編號：2008ZX10002-011）

周云，男，36歲，醫學博士。主要從事感染與免疫研究。E-mail:zyky120@126.com

宋景嬌，E-mail:jjsong@tjh.timu.edu.cn

【Abstrat】Objective To establish the acute or chronic HBV-infection mouse model.Methods Acute or chronic HBV-infection mouse model was established by hydrodynamic injection of pAAV/HBV1.2 plasmid.Serum HBsAg were detected by ELISA.The immune-related molecule mRNA were detected by real-time PCR.The activated lymphocytes in the livers were detected by FACS and ELISPOT was used to detect the HBV-specific cellular immune response.Results We successfully established the acute and chronic HBV-infection mouse model by hydrodynamic injection of pAAV/HBV1.2 plasmid；The duration of serum HBsAg secretion in acute HBV-infected BALB/c mice was （3.25±1.04） weeks，significantly shorter than that in chronic HBV-infected C57BL/6 mice[（10.0±3.74） weeks，P＜0.05]；The duration of serum HBsAg secretion in BALB/c mice injected with low dose （2.5μg） of pAAV/HBV1.2 plasmid was（3.67±1.03） weeks，significantly longer than that in high dose（50μg） group[（2.33 ±0.52） weeks，P ＜0.05]；On the tenth day after hydrodynamic injection，HBcAg special T lymphocytes appeared in the spleen of BALB/c mice.Conclusion HBV-infection mouse model is successfully established by hydrodynamic injection of pAAV/HBV1.2 plasmid and we find that mouse genetic background，immune response and viral doses will impact the establishment of this kind of HBV-infection mouse model.