貝伐單克隆抗體對二乙基亞硝胺誘導的原發性肝癌大鼠的防治作用及其對肝癌組織VEGF表達的影響

張鋒利，田 華，吳潔瓊

貝伐單克隆抗體對二乙基亞硝胺誘導的原發性肝癌大鼠的防治作用及其對肝癌組織VEGF表達的影響

張鋒利，田 華，吳潔瓊

目的研究抗血管內皮生長因子（VEGF）單克隆抗體對二乙基亞硝胺（DEN）所致原發性肝癌大鼠的干預作用及其對肝組織VEGF表達的影響。方法將30只SD大鼠隨機分為正常組、模型組和藥物干預組。采用聯合應用四氯化碳和DEN法制備原發性肝癌模型，并給予抗VEGF單克隆抗體腹腔注射干預，在正常組和模型組則給予等體積生理鹽水注射。連續干預12 w。實驗結束，取血和肝組織行相關檢查，采用免疫組化法檢測肝組織VEGF表達。結果藥物干預組大鼠肝質量、肝表面癌結節數，癌變率和肝臟指數分別為（17.51±2.53）g、（6.86±0.82）個、30%和（4.10±0.79），均明顯低于模型組的【（23.71±3.01）、（21.91±2.75）、100.0%和（5.90±1.01），P＜0.05】；與模型組比，藥物干預組大鼠血清 AST、ALT和 TBIL水平分別為（101.58±19.83） IU/L、（241.52±36.58）IU/L和（62.93±3.03）μmol/L，均明顯低于模型組（P＜0.05）；病理學檢查結果顯示，與模型組比，藥物干預組動物肝組織損傷明顯減輕；免疫組化檢測結果則顯示，模型組、正常組和藥物干預組VEGF相對表達量分別為（35.21±6.92）、（1.00±0.00）和（11.53±3.81），差異顯著（P＜0.05）。結論抗VEGF單克隆抗體對DEN誘導的原發性肝癌大鼠具有較好的抑瘤作用，而這種作用可能與其抑制了肝組織VEGF表達有關。

原發性肝癌；二乙基亞硝胺；抗血管內皮生長因子單克隆抗體；大鼠

作者單位：712000 陜西省寶雞市 陜西中醫藥大學第二附屬醫院消化內科（張鋒利，吳潔瓊）；陜西中醫藥大學（田華）

原發性肝癌是我國死亡率高居第2位的癌癥，約占所有惡性腫瘤死亡人數的20%[1，2]。因此，尋求一種肝癌的新型治療方法是臨床亟需攻克的重要課題[3，4]。血管內皮生長因子（VEGF）是腫瘤血管生成過程中的關鍵蛋白之一，對于促進內皮細胞增殖及新生血管形成等具有重要的作用，也是目前抗腫瘤治療的重要靶點[5，6]。貝伐單克隆抗體是一種新型抗VEGF單克隆抗體，對于非小細胞肺癌、結直腸癌和乳腺癌等均具有良好的治療效果[7]。有部分研究顯示抗VEGF抗體對肝癌具有一定的治療療效，發現其與順鉑等化療藥物聯合用藥對體外抑制腫瘤活性及對荷瘤小鼠有治療作用[8]。本研究觀察了抗VEGF單克隆抗體對二乙基亞硝胺（DEN）所致原發性肝癌大鼠的抑制作用，期望為臨床應用該藥治療肝癌提供一定的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑與動物 87HD型全自動定量酶標儀（武漢賽博公司），Olympus 78UI型顯微照相系統（日本Olympus公司），RXL-01型全自動生化分析儀（美國安捷倫公司），X-22r型高速離心機（德國EP公司）。抗VEGF單克隆抗體（貝伐，美國Sigma公司，批號98120932），羧甲基纖維素鈉（武漢博士德公司，批號 20150124），DEN（Sigma 公司，純度＞99%，使用前配成DEN溶液100 mg/L，隔日更換，并避光存放），兔抗VEGF抗體（美國Sigma公司，批號98168127），檢測血生化指標的試劑盒購自武漢博士德生物公司（批號分別為2014112309、201412 0987和2014123125）。清潔級SD大鼠30只，雌雄各半，體質量【158.2±19.1）g，購自西安交通大學醫學院實驗動物中心，生產許可證號：SCXK（陜）2014-0093】。

1.2 原發性肝癌模型的制備 取30只大鼠，隨機分為正常組、模型組和藥物干預組。按文獻[10]報道的方法制備原發性肝癌模型，給予大豆油配制的50%四氯化碳溶液3 ml·kg-1于大鼠后肢皮下注射，2次/w，連續4 w。休息2 w，于第5 w開始，給予大鼠飲用95 μg/ml的DEN水溶液，每日新鮮配置，連續飲用12 w；在正常組大鼠，則在后肢皮下注射等量的大豆油，方法同上；在藥物干預組大鼠自飲用DEN溶液的同時即開始給予抗VEGF單克隆抗體1.025 mg·kg-1腹腔注射，qod，在正常組和模型組則給予等體積的生理鹽水注射，連續干預12 w。在末次給藥24 h，用乙醚麻醉大鼠，于腹主動脈取血4 mL，低溫離心 2 min（3000 r/m），分離血清，于 -80℃冰箱保存待檢。取血完成后，采用放血法處死大鼠，剖開腹腔，剪取肝臟。稱量肝臟質量，記錄癌變只數，表面癌結節數，并計算癌變率（癌變只數/總數×100%）及肝臟指數（肝臟質量/體質量×100%）。取肝組織2塊，1 cm×1 cm×1 cm，以10%甲醛溶液固定，分別用于組織病理學檢查和免疫組化檢測。

1.3 血生化指標檢測 常規進行。

1.4 肝組織VEGF檢測 采用sABC法行免疫組化染色，以DAB顯色，在光學顯微鏡下觀察到胞漿出現棕黃色顆粒者即為陽性細胞，在顯微鏡下每張切片觀察10個高倍（400×）視野，采用Image-proplus 6.0圖像分析軟件對陽性染色細胞進行定量分析，取均值。

1.5 統計學處理 應用SPSS 22.0軟件對數據進行處理，計量資料以（±s）表示，采用 t檢驗；用百分率描述計數資料，采用x2檢驗，P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠肝臟一般情況比較 與模型組比，正常組和藥物干預組大鼠肝臟癌變率、肝臟質量、表面癌結節數和肝臟指數均顯著降低，差異均具有統計學意義（P＜0.05，表1）。

表1 各組大鼠肝臟一般指標（%，±s）比較

表1 各組大鼠肝臟一般指標（%，±s）比較

正常組與模型組比，①P＜0.05；藥物干預組與模型組比，②P＜0.05

?

2.2 各組大鼠肝功能指標的比較 藥物干預組大鼠血清AST、ALT和TBIL水平比模型組顯著降低，差異均具有統計學意義（P＜0.05，表 2）。

表2 各組大鼠肝功能指標（n=10，±s）的比較

正常組與模型組比，①P＜0.05；藥物干預組與模型組比，②P＜0.05

?

2.3 各組大鼠肝組織病理學變化的比較 正常組大鼠肝組織細胞形態正常，以肝中央靜脈為中心呈放射狀向四周排列，管壁無增厚，門管區清晰，無炎性細胞浸潤，肝小葉結構正常（圖1A）；模型組大鼠癌細胞呈現不同程度的分化，癌細胞異型較為明顯，核仁突出，排列成巢狀（圖1 B）；3只藥物干預大鼠肝組織出現了癌變，癌細胞排列呈梁狀，異型較為明顯，核仁較為突出，間質少，可見出血（圖1 C）。其余未出現癌變的7只大鼠肝組織內存在壞死性肝硬化，可見較寬的纖維間隔和形態不一的假小葉，肝細胞不同程度的變性、水腫及壞死（圖1 D）。

圖1 各組大鼠肝組織病理學表現（HE，400×）A：正常組；B：模型組；C：藥物干預癌變組；D：藥物干預未癌變組

2.4 各組大鼠肝組織VEGF表達情況比較 肝組織VEGF陽性呈棕黃色，分布于細胞核中，呈彌漫性顆粒狀分布。模型組大鼠肝組織VEGF呈強陽性表達，藥物干預組呈陽性表達，強度明顯弱于模型組，正常大鼠肝組織偶見VEGF陽性細胞（圖2）。定量分析結果顯示，模型組、正常組和藥物干預組VEGF相對表達量分別為（35.21±6.92）、（1.00±0.00）和（11.53±3.81），差異顯著（P＜0.05）。

圖2 各組大鼠肝組織VEGF表達情況（sABC，400×）A：正常組；B：模型組；C：藥物干預癌變組；D：藥物干預未癌變組

3 討論

肝癌是目前臨床上最常見的消化道惡性腫瘤之一。隨著肝切除術技術的迅猛發展及其他臨床醫學的不斷進步，較以往而言肝癌的臨床治療療效已取得了較大的進步。但總體來說，肝癌患者長期生存率仍不容樂觀，還需要對患者進行更系統的優化治療[11-13]。VEGF是一種高度特異性的新型促血管內皮細胞生長因子，由2個分子質量1.7～2.2萬的糖蛋白亞單位所組成，相對分子質量范圍為3.1～4.3萬。該蛋白可通過特異性結合血管內皮細胞表面受體而發揮改變細胞外基質、促進內皮細胞增殖、促進新生血管形成及增加血管通透性等生物學效應[14，15]。抗VEGF單克隆抗體是目前全球第一個被批準用于治療腫瘤患者的藥物，能發揮血管生長抑制作用，對VEGF的生物效應產生特異性阻斷作用，從而產生腫瘤血管新生抑制作用，延緩腫瘤的生長和轉移[16，17]。迄今為止，美國FDA已批準該藥用于轉移性乳腺癌、轉移性結直腸癌及晚期非小細胞肺癌等疾病的治療[18]。近期，抗VEGF單克隆抗體在肝癌中的應用亦取得令人鼓舞的結果，但相關研究主要為臨床療效觀察。在體外表現出抗腫瘤細胞活性，抑制荷瘤小鼠腫瘤生長[19，20]。我們應用抗VEGF單克隆抗干預DEN所致原發性肝癌大鼠，發現其也具有預防或抑制腫瘤生長作用，或許為將其應用于臨床提供一定的實驗依據。

本研究在造模方法上，首先利用氯仿攻擊肝細胞，導致肝細胞變性壞死，促進肝細胞的修復及增生，然后采用DEN對增殖狀態下的肝細胞進行攻擊，可最大程度地發揮致癌效果，該方法亦是經典原發性肝癌造模手段之一。結果顯示本研究模型大鼠均造模成功，亦再次證實了該方法的可靠性[21]。在藥物干預組大鼠，癌變率、肝臟質量、表面癌結節數及肝臟指數均低于模型組，病理學觀察結果亦顯示，抗VEGF單克隆抗體具有降低DEN誘導大鼠癌癥發生的作用。此外，藥物干預大鼠血清ALT和AST等肝功能生化指標均明顯低于模型組，提示抗VEGF單克隆抗體可有效緩解DEN所致的肝損傷。本研究采用免疫組化檢測，發現模型組大鼠肝組織VEGF強陽性，藥物干預組陽性程度減低。定量分析結果顯示，藥物干預組肝組織VEGF表達量明顯低于模型組，提示抗VEGF單克隆抗體可通過抑制原發性肝癌大鼠VEGF的表達，抑制腫瘤血管生成，最終發揮其抗癌作用。

盡管本課題結果較為客觀，但仍存在部分問題。首先，本研究雖根據藥物說明書選用了準確的給藥劑量，未對劑量進行調整，但作為動物實驗，后期研究中還應適當改變劑量，用于探討藥物的量效關系；其次，盡管抗VEGF單克隆抗體的藥物作用機制較為明確，本研究亦得到了完全吻合的結果，但其治療效果是否還存在其他的機制或作用通路，也是值得深入發掘的一項重要工作，后期還需完善；最后，由于動物實驗與人體實際的差別，本研究結論是否適合于臨床，還需要進行長期的驗證性研究。

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（收稿：2016-10-28）

（本文編輯：陳從新）

Inhibition of tumor growth and vascular endothelial growth factor expression of bevacizumab in rats with diethylnitrosamine-induced hepatic neoplasma

Zhang Fengli，Tian Hua，Wu Jieqiong.Department of Gastroenterology，Second Affiliated Hospital，Shaanxi TCM University，Baoji 712000，Shaanxi Province

Objective To investigate the inhibition of tumor growth and vascular endothelial growth factor（VEGF） expression of bevacizumab in rats with diethylnitrosamine-induced hepatic neoplasma.Methods 30 SD rats were randomly divided into control，modeland bevacizumab-intervened groups.The combination of tetrachloromethane and diethylnitrosamine（DEN）were used to establish liver cancer in rats. The bevacizumab or saline was given intraperitoneally for 12 weeks.The sera and liver tissues were obtained.The liver weights，surface carcinoma nodule numbers，canceration rates and liver index were detected.The VEGF expression was stained immunohistochemically.Results The liver weights，surface carcinoma nodule numbers，canceration rates and liver index were （17.51 ±2.53） g，（6.86 ±0.82），30% and （4.10 ±0.79） in the bevacizumab-intervened group，significantly lower than those in the model group [（23.71 ±3.01），（21.91 ±2.75），100.0% and （5.90 ±1.01），respectively，P ＜0.05]；serum AST，ALT and TBIL levels were （101.58 ±19.83） IU/L，（241.52 ±36.58） IU/L and（62.93±3.03） μmol/L in the bevacizumab-intervened group，significantly lower than those in the model group（P＜0.05）；Liverpathologicalexamination showed thatthe liverinjures，canceration and VEGF expression were alleviated in the bevacizumab-intervened group.Conclusions The application of Bevacizumab has a good inhibitory effect on DEN-induced canceration in rats，which warrants further study.

Hepatoma；Diethylnitrosamine；Bevacizumab；Rats

10.3969/j.issn.1672-5069.2017.05.014

張鋒利，女，37歲，大學本科，副主任醫師。主要從事肝臟病和功能性胃腸病防治研究。E-mail:zhangfengli197902@163.com

吳潔瓊，E-mail:2962128717@qq.com