甲胎蛋白異質體在原發性肝癌臨床診斷中的應用*

肖 瀟，何羽童，房 萌，季 君，高致遠，楊 園，高春芳

甲胎蛋白異質體在原發性肝癌臨床診斷中的應用*

肖 瀟，何羽童，房 萌，季 君，高致遠，楊 園，高春芳

目的通過臨床大樣本數據回顧性分析血清甲胎蛋白（AFP）和甲胎蛋白異質體（AFP-L3）診斷原發性肝癌（PLC）的價值。方法2015年1月～2015年12月東方肝膽外科醫院診治的PLC患者7097例，同期診治的肝硬化（LC）患者122例。采用化學發光法檢測血清AFP水平，采用凝集素捕獲微量離心柱法檢測AFP-L3，將AFP-L3/AFP比值大于10%定義為AFP-L3陽性。結果7097例PLC患者血清AFP水平為61.7（5.4，1226.0）μg/L，顯著高于 122 例 LC 患者的 3.6（2.5,10.95） μg/L（P＜0.05），AFP-L3陽性率為 8.2（-，26.1）%，而在肝硬化患者未檢出AFP-L3陽性（P＜0.05）；以血清AFP≥20 μg/L或/和AFP-L3≥10%任一陽性為截斷點，診斷PLC的準確度為63.1%，優于AFP（60.3%）和AFP-L3（47.9%）單獨診斷的結果；AFP-L3陽性率隨著AFP水平的升高而升高；血清AFP陰性的PLC和AFP陽性的LC患者AFP-L3陽性率分別為39.6%和7.7%，顯著低于血清AFP陽性PLC患者的73.7%（P＜0.05）；在2103例具有病理學診斷的PLC患者，1976例肝細胞癌（HCC）患者血清AFP水平為50.8（4.8，1015.0）μg/L，6例混合型肝癌患者血清AFP水平為74.9（4.55，39248.3）μg/L，AFP-L3陽性率分別為5.3（-，24.6）%和 8.4（-，18.8）%，均顯著高于 121 例肝內膽管細胞癌患者【2.8（2.2，5.15） μg/L，P＜0.05】和【-（-，-）%，P＜0.05】。結論大樣本的結果顯示PLC患者血清AFP和AFP-L3存在較高的陽性率，其診斷效能較好。

原發性肝癌；甲胎蛋白；甲胎蛋白異質體；診斷

作者單位：200438上海市 第二軍醫大學東方肝膽外科醫院實驗診斷科

原發性肝癌（primary liver cancer，PLC）在世界惡性腫瘤中位居第五位[1]，在我國肝癌病死率更是居于男性惡性腫瘤的首位[2]。該病早期缺乏特異性表現易被漏診，但起病緩慢，侵襲性強，預后極差。因此，早期發現對于疾病診斷、治療、預后都有重要意義[3]。目前，甲胎蛋白（alpha-fetoprotein，AFP）是檢測PLC患者的主要血清指標，但慢性肝炎，肝硬化（LC）、妊娠期婦女血清AFP也會升高。所以，其靈敏度和特異度并不十分高[4]。研究發現，肝臟疾病往往伴隨多種蛋白的異常糖基化[5]，根據與小扁豆素（lens culinaris agglutinin，LCA）親和力的不同可將AFP糖蛋白分為LCA非結合型AFP-L1、弱結合型AFP-L2和LCA結合型AFP-L3。將結合型AFP-L3稱為AFP異質體，后者為一種異常糖基化的AFP，AFP-L3含量不受AFP總含量的影響，不同性別和年齡患者其含量也無顯著性差異，但與PLC發生密切相關，成為新一代具有典型性的腫瘤標志物[6]。雖然AFP-L3在臨床已經應用多年，但其應用價值尚缺循證醫學大數據證據的支持。本文主要通過大樣本回顧性分析PLC和LC患者血清AFP和AFP-L3水平變化，特別研究了兩者的相關性及其在不同病理學類型PLC患者的水平差異，以期客觀地評價AFP-L3在臨床診斷PLC患者方面的價值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2015年1月～2015年12月本院住院治療的PLC患者7097例，男性6011例，女性1086例；年齡 3～85歲，平均年齡（55.31±11.08）歲。LC患者122例，男86例，女36例；年齡18～85歲，平均年齡（53.93±12.56）歲。PLC的診斷結合臨床、病理學檢查、B超、CT、MRI檢查進行，符合《原發性肝癌診療規范（2011年版）》修訂的標準，剔除嚴重腎功能損害和肝臟外惡性腫瘤患者。HCC患者均未經過肝臟外科切除、肝動脈化療栓塞、射頻消融等相關治療。LC的診斷則經臨床資料和影像學檢查綜合分析。經手術治療具有病理學診斷的病例2105例，包括HCC 1976例，ICC 121例，混合型肝癌6例，LC2例。

1.2 血清學測定 抽取空腹靜脈血3 ml，3000 r/m離心10 min，分離血清，于6小時內完成AFP和AFP-L3檢測。采用電化學發光法檢測血清AFP水平（羅氏公司E601，AFP水平參考區間為0～20μg/L，大于等于20μg/L時為陽性。當AFP水平＞1210μg/L時，經稀釋液稀釋后再測）；利用親和吸附原理檢測血清AFP-L3（北京熱景生物技術有限公司）。血清AFP-L3通過特異性結合預裝在親和吸附離心管中的親和介質LCA，將洗脫的吸附液再用羅氏E601測定AFP水平（AFP-L3）以及處理前標本的AFP（總AFP）水平，計算AFP-L3%，計算公式為AFP-L3%=AFP-L3×2.5/總AFP×100%。依照說明書，當AFP-L3%≥10%判定為陽性。當總AFP＜10μg/L時，AFP-L3%為陰性。

1.3 統計學方法 應用SPSS 19.0統計軟件進行數據分析。計量資料以（±s）或 M（IQR）表示，分別采用t檢驗、非參數檢驗，計數資料采用x2檢驗。繪制ROC曲線評價AFP和AFP-L3的診斷價值，以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 PLC和LC患者血清AFP和AFP-L3水平的比較 與LC比，PLC患者血清AFP和AFP-L3水平升高，差異有統計學意義（P＜0.05，表1）。

表1 兩組血清AFP和AFP-L3【M（IQR）】水平比較

2.2 AFP與AFP-L3在PLC診斷中的效能評價 以LC為對照組，繪制AFP和AFP-L3診斷的ROC曲線，結果顯示，AFP診斷PLC的ROC曲線下面積為0.763（95%CI 0.730～0.796），AFP-L3 診斷 PLC 的ROC 曲線下面積為 0.747（95%CI 0.718～0.776，圖1）。以血清AFP=20 μg/L為截斷點，其診斷PLC的靈敏度為60.03%，特異度為78.69%，準確度為60.34%；以血清AFP-L3=10%為截斷點，其靈敏度為47.10%，特異度為96.72%，準確度為47.94%。當各自的截斷點不變，即AFP≥20μg/L或AFP-L3≥10%任一陽性時，兩者聯合診斷PLC的靈敏度為62.84%，特異度為77.05%，準確度為63.08%（表2）?？梢?，AFP與AFP-L3任一陽性即診斷的準確度優于單一指標的診斷效能。

2.3 不同血清AFP水平患者血清AFP-L3陽性率比較（表 3） 在240例AFP陰性（AFP在10～20μg/L）的PLC患者中，AFP-L3陽性200例（39.6%）；在4259例AFP陽性（AFP＞20μg/L）的PLC患者中，AFP-L3陽性3142例（73.7%），兩者比較差異有統計學意義（P＜0.05）。AFP-L3陽性率隨著AFP水平的升高而升高；在96例AFP陰性（AFP在10～20μg/L）的LC患者中，AFP陽性率為2.2%，在26例AFP陽性（AFP＞20μg/L）的LC患者中，AFP-L3陽性2例（7.7%），兩組差異有統計學意義（P＜0.05）。

2.4 具有病理學診斷結果的患者血清AFP和AFP-L3水平分析 經過非參數檢驗，結果顯示，HCC組與ICC組患者血清AFP水平和AFP-L3陽性率差異有統計學意義（P＜0.05）；混合型肝癌組與ICC組血清AFP水平和AFP-L3陽性率差異有統計學意義（P＜0.05，表 4）。

圖1 血清AFP和AFP-L3診斷PLC的ROC曲線分析

表2 血清AFP和AFP-L3診斷PLC患者的效能（%）比較

表3 不同血清AFP水平患者AFP-L3陽性率（%）比較

表4 不同類型肝癌患者血清AFP【M（IQR）】和AFP-L3(%）比較

3 討論

雖然原發性肝癌患者的病死率極高，但近年來由于治療技術的提高，其總體生存率也有所提高，但5 a生存率仍不到10%[7]。腫瘤標志物在腫瘤的形成、發展過程中會不斷變化，我們通過分子生物學、免疫學等方法對其進行檢測，從而輔助診斷是否患有腫瘤并評價患者預后。臨床上，AFP大于400μg/L常被認為高度提示PLC[8]，但數據證明病毒性肝炎、LC患者也會出現AFP水平的升高，干擾了對PLC的鑒別診斷。研究指出，AFP-L3陽性患者比血清AFP水平升高患者發展成為PLC的可能性更大[9]。我們對大樣本數據經分層分析結果提示，隨著AFP水平的升高AFP-L3陽性率也升高，進一步證明了AFP-L3輔助AFP診斷PLC的作用。我們的研究報道與文獻報道中提示的隨腫瘤臨床分期提高和腫瘤增大AFP-L3陽性率也升高[10]相一致。AFP-L3對HCC療效的監測也有著重要的意義[11]。本組2例LC患者血清AFP在10～20μg/L之間，AFP-L3異質體為陽性，結合該2例患者均為失代償期，合并慢性膽囊炎，其中1例經MRI檢查提示疑似存在門靜脈栓子。2例患者經治療，預后均差。對于AFP-L3陽性的患者更具有潛在的發生癌癥的可能，更需注意后期隨訪[12]。有文獻報道也稱，AFP-L3＞10%可以作為肝癌的預警診斷[13]。

目前，ICC已是繼HCC之后第二大原發性肝臟惡性腫瘤，約占PLC的5%～10%[14]。我們研究發現ICC患者AFP陰性者為93.4%（113/121），經病例資料查閱后核實AFP陽性的8例ICC患者中有6例術中查看肝臟存在子灶或門靜脈癌栓，提示具有更強的轉移性和侵襲性。所以，對于AFP陰性的PLC患者也不能忽視ICC的存在，如果AFP-L3陽性更應該警惕腫瘤轉移和侵襲的可能。

AFP是一種由肝臟和卵黃囊合成的單鏈糖蛋白，作為PLC的首選診斷指標，仍有20%～40%的患者處于陰性狀態[15]。血清AFP水平與細胞AFP的表達相關，往往取決于瘤體的大小。因此，有時候僅憑AFP的檢測很難區別肝臟良性疾病與惡性腫瘤。AFP-L3陽性的PLC具有快速生長和早期轉移的特征。對于AFP低水平，特別是微小肝癌患者，檢測AFP-L3有助于早期診斷。通常，采用植物凝集素結合能力法對AFP-L3進行分離，然后應用化學發光法再定量測定，該方法操作簡便[16]，但由于受到儀器靈敏度的限制，當血清AFP水平小于10μg/L時，將無法測定AFP-L3的比率。本組2333例患者血清AFP水平小于10μg/L而未進行AFP-L3測定，不排除其中存在陽性結果的可能。最新進入臨床應用的微流控檢測法已經將AFP-L3檢測的靈敏度提高到血清AFP等于 0.3μg/L[17]，可對低水平AFP的PLC患者進行AFP-L3百分比分析，但目前國內尚缺乏應用的大數據。對于低水平AFP患者，這種超敏AFP-L3的檢測方法是否能補償一些不足尚有待進一步證實。

我國PLC特別是HCC的發生與HBV感染相關。近年來，隨著乙肝疫苗免疫接種的普及，HBV感染率被有效降低，2006年我國1～59歲HBV攜帶率為7.18%，2014年中國疾病預防控制中心調查顯示，1～4歲人群HBV感染率為0.32%，5～14歲感染率為0.94%，15～29歲人群感染率為4.38%[18]，與過去相比較已明顯下降。而以代謝性異常為代表的非病毒性感染相關的PLC將逐漸上升，因此也應引起重視[19]。ICC的發生也呈現上升趨勢[20]。因此，需加強對于AFP陰性PLC患者腫瘤標志物的研究，為輔助臨床早期診斷及隨訪提供幫助。

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（收稿：2016-11-20）

（本文編輯：陳從新）

Diagnostic value of serum alpha-fetoprotein and lentil lectin-reactive alpha-fetoprotein in patients with primary livercancer

XiaoXiao，HeYutong，FangMeng，etal.DepartmentofMedicalLaboratory，Eastern Hepatobiliary Hospital，Second Military Medical University，Shanghai 200438，PR China

Objective To retrospectively analyze serum alpha-fetoprotein （AFP） and lentil lectin-reactive alpha-fetoprotein ratio（AFP-L3%） in the diagnosis of patients with primary liver cancer （PLC）.Methods A cohort of 7097 patients with PLC was recruited in Eastern Hepatobiliary Surgery Hospital between January 2015 and December 2015.At the same period，122 patients with liver cirrhosis（LC） were enrolled.Serum AFP and AFP-L3 were detected by electrochemiluminescence and lectin microcentrifugalcolunm，respectively.The positivity of AFP-L3 was defined as the ratio of AFP to L3/AFP was higher than 10%.Results Serum AFP level in 7097 patients with PLC was 61.7（5.4，1226.0） μg/L，much higher than 3.6（2.5，10.95） μg/L（P＜0.05） in 122 patients with LC，and the AFP-L3 positivity was 8.2（-，26.1）%，significantly higher than in patients with LC as all were negative in the latter（P＜0.05）；the accuracy in diagnosis of PLC was 63.1%，higher than 60.3%by serum AFP or 47.9%by AFP-L3 alone when either of serum AFP≥20μg/L and/or AFP-L3≥10%as the cut-off-value；the positivity of AFP-L3 increased as serum AFP levels increased；the positivity of AFP-L3 in PLC patients with negative serum AFP and in LC patients with positive serum AFP were 39.6% and 7.7% ，respectively，both significantly lower than 73.7%（P＜0.05） in PLC patients with positive AFP；serum AFP levels and positivities of AFP-L3 were 50.8（4.8，1015.0） μg/L and 5.3（-，24.6）% in 1976 patients with histology-proven hepatocellular carcinoma （HCC），and 74.9（4.55，39248.3）μg/L and 8.4（-，18.8）%in 6 patients with histology-proven mixed hepatoma，both higher than【2.8（2.2，5.15）μg/L，P＜0.05】and【-（-，-）%，P＜0.05】in 121 patients with histologically diagnosed intrahepatic cholangiocarcinoma.Conclusion Our big data confirm again AFP and AFP-L3 have a higher positive rate in PLC，and its diagnostic value is good.

Hepatoma；Alpha-fetoprotein；Lentil lectin-reactive alpha-fetoprotein；Diagnosis

10.3969/j.issn.1672-5069.2017.05.015

國家自然科學基金資助項目（編號：81301516/81271925）；上海市科委基金資助項目（編號：15JC1404100）

肖瀟，女，29歲，大學本科，技師。主要從事臨床免疫學與檢驗學研究。E-mail:hsiao_33@163.com

共同第一作者：何羽童，女，21歲，大學本科，見習技師。主要從事臨床分子生物學與檢驗學研究。E-mail:derahyt@163.com

高春芳，E-mail:gaocf1115@163.com