脂肪干細胞分化為血管內皮細胞及其治療下肢缺血性疾病的研究進展

徐桂珍++簡雪平++眭云鵬++馬麗++劉燕平+文輝才

[摘要]下肢缺血性疾病是臨床常見的嚴重危害中老年人健康的疾病之一，目前治療方法多樣，一般采用藥物、血管搭橋、介入手術等方式，但遠期療效較差，治療效果往往不甚理想。近年來，脂肪干細胞在治療下肢缺血性疾病方面的實驗研究逐漸增多。本文擬就目前脂肪干細胞分化為血管內皮細胞及其治療下肢缺血性疾病的研究現狀作一綜述，并對其存在的問題進行分析及展望。

[關鍵詞]脂肪干細胞；血管內皮細胞；下肢缺血；移植；分化

[中圖分類號]Q813.1 R654.4 [文獻標志碼]A [文章編號]1008-6455（2017）09-0122-03

Differentiation of Adipose-derived Stem Cells into Endothelial Cells and their Transplantation for Hindlimb Ischemia

XU Gui-zhen，JIAN Xue-ping，SUI Yun-peng，MA Li，LIU Yan-ping，WEN Hui-cai

（Department of Plastic and Cosmetic Surgery，the First Affiliated Hospital of Nanchang University，Nanchang 330006，Jiangxi，China）

Abstract： Ischemicdiseaseoflowerextremityisaseverediseasethreateninghumanhealth.Treatmentforischemicdiseasecommonlyusedrugs， vascular bypass，interventional surgery， but the long-term effect is unsatisfied.Thisreview aimstosummarizethedifferentiation of adipose-derived stem cells into endothelial cells and their transplantation for Hindlimb Ischemia， and to analyze current problems and to prospect the future.

Key words：adipose-derivedstemcells； vascularendothelial cells； hindlimb ischemia； transplantation；differentiation

隨著社會的發展和人口老齡化進程的加快，下肢缺血性疾病越來越困擾著中老年患者及其家人，已成為臨床上嚴重危害中老年人群體健康的常見疾病之一。目前，臨床針對下肢缺血性疾病的治療方法多樣，一般采用藥物、血管搭橋、介入手術等方式，但遠期療效較差，對于肢體嚴重缺血的患者需要進行截肢處理，因此治療效果往往不甚理想[1]。近年來，干細胞因其強大的多向分化能力和自我更新能力而不斷被研究，在臨床治療下肢缺血性疾病方面得到廣泛的應用。脂肪干細胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）不僅具有多向分化潛能和細胞因子分泌能力，更因其儲量豐富，獲取方便，免疫排斥反應弱，無倫理限制等特性，干細胞移植治療展現了較好的臨床應用前景，為下肢缺血患者帶來新的希望。現將近年來ADSCs向血管內皮細胞分化的基礎研究及其在下肢缺血性疾病中的應用進行綜述。

1 ADSCs的生物學特性

ADSCs主要位于機體脂肪組織中，屬于一種中胚層來源間充質干細胞，經膠原酶消化、離心、培養后所得。ADSCs在人類和動物體內獲取方式不一樣，人ADSCs可由脂肪抽吸或外科手術切取的方式獲取，動物ADSCs可由腹股溝脂肪、內臟脂肪等部位獲取。ADSCs的活性同時受到取材部位、方式以及供者年齡等因素的影響，一定程度上存在差異。在下腹部和大腿內側獲取的ADSCs其單位體積內的數量最高[2]。隨著年齡增長，ADSCs老化程度更高，表現出増殖、分化及遷移能力的相應降低[3]。

研究表明ADSCs在低血清或者無血清的條件下也能生長，并且其誘導潛能不受影響[4]。在低糖、低氧和低谷氨酸等條件下，ADSCs的濃度是骨髓中干細胞的100～300倍[5]。ADSCs的傳代培養平均倍增時間需要兩天，在10代左右仍然能保持穩定的倍增率，且衰老和死亡的細胞比例出現的較少。以上說明ADSCs是間充質干細胞中易于培養和大量應用的種子細胞。

ADSCs由于其形態上與骨髓來源干細胞相似，因此無法從形態學上將兩者進行區分。目前ADSCs尚無特異的表面標志物，ADSCs表面標志物也略有差別，主要受ADSCs培養方式的不同、細胞使用代數的變換、流式和免疫學檢查使用抗體來源不一致等因素的影響[6]。最常用的是通過分化表型逆推的方式鑒定ADSCs，流式細胞儀來鑒定ADSCs。研究表明[7]，ADSCs陽性表達CD29、CD44、CD49、CD71、CD90、CDl05，Sca-1等抗原，陰性表達CD31、CD34、CD45等抗原，通過免疫標志對細胞進行有效篩選，可以得到較純的干細胞，有助于ADSCs的進一步研究。

ADSCs可通過自身分泌或者旁分泌方式分泌抗炎、抗凋亡、免疫調節等因子。研究證實，ADSCs在缺血、缺氧及損傷的條件下可促進相關細胞因子的分泌，包括血管內皮生長因子（VEGF）、肝細胞生長因子（HGF）、b型成纖維細胞生長因子（bFGF）、基質源性血管因子（SDF-1）、前列腺素E2（PGE2）等。Hao等[8]發現ADSCs可通過調節PGE2的表達影響巨噬細胞IL-10、IL-6、TNF-α細胞因子的分泌，為損傷組織的再生及修復提供適宜的微環境。endprint

2 ADSCs向血管內皮細胞分化

2.1 在體外ADSCs向血管內皮細胞分化：ADSCs在條件培養基下可以向組織內多種細胞分化，在局部微環境下ADSCs能誘導分化成為骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞以及心肌細胞等。作為間充質干細胞的一員，ADSCs具有跨胚層分化的潛能，可被誘導分化為血管內皮細胞。

Miranville等[9]的實驗發現，在低濃度血清的培養基中，表面ADSCs可分化為具有功能性的血管內皮樣細胞，特異性表達CD31標記物和第VIII因子相關抗原。Amos等[10]的報道表明，在血管內皮細胞生長因子和外來剪切力的作用下，ADSCs重新排列，表達血管內皮細胞表面標志物、周細胞表面標志物和血管干細胞相關分子；Volz等[11]研究證實，ADSCs與內皮細胞共培養，在表皮生長因子（EGF）、氫化可的松（Hydrocortisone）誘導下可向血管內皮細胞方向分化。以上說明ADSCs經過一定的環境誘導可向成熟血管內皮細胞分化。

2.2 在體內ADSCs向血管內皮細胞分化和遷徙：近年來，ADSCs參與血管構建過程，在許多研究中得到證實。此外，ADSCs被不斷應用于移植治療各種難治性疾病，如糖尿病潰瘍、腦卒中、下肢缺血以及心肌梗死等，均表明ADSCs可改善缺血區域的供血和功能。新生血管生成主要包括兩階段，即血管發生和血管形成。血管發生主要是通過內皮祖細胞的分化、增殖、遷移，形成血管網，血管形成是在已經成熟的血管床基礎上形成毛細血管。據此理論，學者們提出了治療性血管形成和治療性血管生成兩個概念，為提高細胞治療組織的存活率、治療組織缺血性疾病提升了理論層次。由于ADSCs自分泌和旁分泌的作用特點，其不僅可以治療血管形成，也可以治療血管新生。Fischer等[12]研究證實，在內皮生長因子和外來剪切力的作用下，ADSCs可向成熟血管內皮細胞分化。Altman等[13]報道表明，植入的ADSCs在局部微環境下可以向血管內皮細胞方向分化。Borges等[14]將ADSCs和血管內皮細胞共同移植，能有效構建絨毛尿囊膜的微血管網絡，發揮ADSCs促進血管生成的作用。總結歸納ADSCs促進血管再生的機制可能為：①ADSCs自我分化成血管內皮細胞參與新生血管的形成；②ADSCs在損傷局部自身分泌以及調節周邊細胞表達多種細胞活性因子，促進局部血管新生，抑制細胞凋亡；③ADSCs與血管內皮細胞協同作用，從而促進血管新生。

3 ADSCs在下肢缺血中的應用

ADSCs是一種具有很強的自我更新能力和多向分化潛能的間充質干細胞，相比于臍帶血間充質干細胞及骨髓來源干細胞，ADSCs具有儲量豐富，獲取方便，無免疫排斥反應，不受醫學倫理問題束縛等優點，其在組織修復和再生醫學的各個領域被廣泛地研究。大量的研究證實，采用自體ADSCs移植治療缺血組織，可以促進下肢缺血的恢復。

3.1 細胞治療：近年來研究證實[15]，自體或者異體ADSCs移植治療下肢缺血，其治療結果是有效的。ADSCs可分化為成熟血管內皮細胞，并參與缺血下肢的微血管新生。在基因治療領域，導入的外源基因在ADSCs體內能夠穩定地表達，因此ADSCs可以作為目的基因的載體。近年來有報道介紹通過病毒介導VEGF、HGF等基因轉染，以及低氧預處理ADSCs，可以增強下肢缺血組織血管新生的能力。Shevchenko等[16]的研究用腺病毒介導的VEGF165基因轉染ADSCs，其仍然保持了成脂、成骨的分化能力和粘附特性，血管生成素-1（Ang-I）基因的mRNA表達水平顯著增加，而成纖維細胞生長因子-1（FGF-1）、干細胞生長因子（HGF）的水平無明顯變化；將轉染后的ADSCs與人工基質膠混合后植入小鼠皮下，發現ADSCs能夠顯著促進血管生成；用轉染后的ADSCs注射移植到小鼠缺血下肢肌肉內，VEGF165在ADSCs中得到持續性的高表達，并且血流恢復速度明顯優于未轉染組。

3.2 組織工程（微凝膠）：游離的ADSCs移植注射到動物病灶區域，會出現大量流失和死亡現象，導致細胞治療效率低、不穩定、重復性差[17]。因此，在臨床治療研究領域，尋找到一種高效、可控的方法應對以上問題顯得尤為重要。Lee等[18]將ADSCs與含有成纖維細胞生長因子-2（FGF2）的可降解緩釋凝膠共同注射到小鼠缺血下肢肌肉內，在注射后第4周和12周進行肌肉樣本分析發現，聯合處理后細胞存活率、新生毛細血管數量和相關促血管生長因子的表達量顯著高于ADSCs懸液組和單純FGF2凝膠組。以上結果表明FGF2緩釋凝膠和ADSCs共同移植可提高干細胞移植到缺血區域的長期保留率和促血管再生能力。Li等[19]將ADSCs與可注射明膠微冰膠進行體外預培養，其目的是促進ADSCs間的相互作用形成3D微組織，積累大量細胞外基質和活性因子。然后通過注射器定點注射使其聚集在治療區域，發現ADSCs可有效地應對機體病灶區域缺血、炎癥等惡劣環境，并且3D微組織相當于傳統游離細胞療法十分之一的間充質干細胞的用量，就可使得患有下肢缺血性疾病的小鼠實現血管和肌肉組織再生，避免截肢的發生。該種可注射型可降解明膠微冰膠能與ADSCs相互作用，為ADSCs創造一個較好的微環境，使細胞在其中粘附、生長和增殖，減少細胞在缺血部位的死亡率和流失率，保證缺血局部有足夠的細胞數量發揮治愈功能。Park等[20]通過3D培養法形成ADSCs球體混合基質膠注射到大鼠缺血患肢皮下，ADSCs能持續性地分泌各種細胞生長因子，起到促進患肢血管再生的作用，且治療效果優于ADSCs懸液混合基質膠注射組，該種方法不僅能促進周圍血管生長，同時能有效的促進內部血管生成。

3.3 物理輔助及其他聯合治療：2015年Prochroka等[21]學者提出一種雞尾酒療法，在含有多種細胞因子的人脂肪干培養基中，采用ADSCs培養基提取物治療兔下肢缺血模型，研究表明治療組下肢肌肉血管密度顯著高于對照組，說明ADSCs在體內局部缺血環境下分泌的多種細胞因子也可直接起到治療效果。2016年Yoshida等[22]報道使用ADSCs聯合帶蒂血管皮瓣治療大鼠下肢缺血模型的創面，實驗結果顯示在聯合治療組的效果較單純ADSCs治療組和單純帶蒂血管皮瓣治療組更好。Park等[23]提出使用ADSCs聯合微光照射治療小鼠下肢缺血，觀察到效果比單純注射更佳。endprint

以上研究顯示，通過改變ADSCs的培養方式，或者聯合其他治療方法，都能有效改善ADSCs治療下肢缺血的效果。

4 總結和展望

應用ADSCs治療下肢缺血，是一項具有巨大發展潛力的醫療技術，可為一系列難治性疾病提供新的治療方向，引起了各國臨床醫師、科研工作者及患者的關注。無論是基礎研究還是臨床研究均證實了ADSCs移植治療下肢缺血性疾病的有效性。目前此技術的應用仍處于起步階段，臨床研究大多是單中心小樣本報告病例總結式報告，未形成統一的評價標準，觀察時間短，樣本量少，說服力、科學性不強，未來亟待開展多中心前瞻性隨機對照研究。另，理論研究尚未不完善，其治療的安全性及有效性并沒有充分的數據可以證實，更多的研究依然是集中在動物實驗領域。隨著研究的不斷深入，ADSCs移植治療下肢缺血的機制將會得到更全面、具體的解釋，同時也將為下肢缺血等難治性疾病的防治帶來更多思路和方法，能使更多患者受益。

[參考文獻]

[1]Etsu，Suzuki，Daishi，et al.Adipose tissue-derived stem cells as a therapeutic tool for cardiovascular disease[J].World J Cardiol，2015，7（8）：454-465.

[2]Gir P，Brown SA，Oni G，et al.Fat grafting： evidence-based review on autologous fat harvesting， processing， reinjection， and storage[J].Plast Reconstr Surg，2012，130（1）：249-258.

[3]Kawagishi-Hotta M，Hasegawa S，Igarashi T，et al.Enhancement of individual differences in proliferation and differentiation potentials of aged human adipose-derived stem cells[J].Regn Ther，2017，6：29-40.

[4]Song SY，Chung HM，Sung JH.The pivotal role of VEGF in adipose-derived-stem-cell-mediated regeneration[J].Expert Opin Biol Th，2010， 10（11）：1529-1537.

[5]Dhanasekaran M，Indumathi S，Poojitha R，et al.Plasticity and banking potential of cultured adipose tissue derived mesenchymal stem cells[J].Cell Tissue Bank，2013， 14（2）：303.

[6]袁福康，秦金保，葉開創，等.脂肪干細胞治療下肢缺血的研究進展[J].現代生物醫學進展，2015，15（28）：5598-5600.

[7]Li K，Gao J，Zhang Z，et al.Selection of donor site for fat grafting and cell isolation[J].Aesthet Plast Surg，2013，37（1）：153.

[8]Hao C，Shintani S，Shimizu Y，et al.Therapeutic angiogenesis by autologous adipose-derived regenerative cells： comparison with bone marrow mononuclear cells[J].Am J Physiol-Heart C，2014，307（6）： H869.

[9]Miranville A，Heeschen C，Sengenès C，et al.Improvement of postnatal neovascularization by human adipose tissue-derived stem cells[J].Circulation，2004，110（3）：349.

[10]Amos P J，Shang H，Bailey AM，et al.IFATS Collection： The Role of Human Adipose-Derived Stromal Cells in Inflammatory Microvascular Remodeling and Evidence of a Perivascular Phenotype[J].Stem Cells，2008，26（10）：2682.

[11]Volz A C， Huber B， Schwandt A M， et al. EGF and hydrocortisone as critical factors for the co-culture of adipogenic differentiated ASCs and endothelial cells[J]. Differentiation，2017， 95： 21-30.

[12]Fischer LJ，Mcilhenny S，Tulenko T，et al.Endothelial differentiation of adipose-derived stem cells： Effects of endothelial cell growth supplement and shear force[J].J Surg Res，2009，152（1）：157-166.endprint

[13]Altman AM，Yan Y，Matthias N，et al.IFATS collection： Human adipose-derived stem cells seeded on a silk fibroin-chitosan scaffold enhance wound repair in a murine soft tissue injury model[J].Stem Cells，2009，27（1）：250.

[14]Borges J，Mueller MC，Padron NT，et al.Engineered adipose tissue supplied by functional microvessels[J].Tissue Eng，2004，9（6）：1263-1270.

[15]Sz?ke K，Brinchmann JE.Concise Review： Therapeutic Potential of Adipose Tissue-Derived Angiogenic Cells[J].Stem Cell Transl Med，2012，1（9）：658.

[16]Shevchenko EK， Makarevich PI，Tsokolaeva ZI，et al.Transplantation of modified human adipose derived stromal cells expressing VEGF165 results in more efficient angiogenic response in ischemic skeletal muscle[J].J Transl Med，2013，11（1）：138.

[17]Cheng AY， García AJ.Engineering the matrix microenvironment for cell delivery and engraftment for tissue repair[J].Curr Opin Bi，2013，24（5）：864.

[18]Lee TJ，Bhang SH，Yang HS，et al.Enhancement of long-term angiogenic efficacy of adipose stem cells by delivery of FGF2[J].Microvasc Res，2012，84（1）：1.

[19]Li Y，Liu W，Liu F，et al.Primed 3D injectable microniches enabling low-dosage cell therapy for critical limb ischemia[J].P Natl Acad Sci USA，2014，111（37）： 13511-13516.

[20]In-Su P，Kang JA，Jungmi K，et al.Therapeutic effect of human adipose-derived stromal cells cluster in rat hind-limb ischemia[J].Anat Rec，2014，297（12）： 2289-2298.

[21]Procházka V，Jur?íková J，La??ák O，et al.Therapeutic Potential of Adipose-Derived Therapeutic Factor Concentrate for Treating Critical Limb Ischemia[J].Cell Transplan，2015，25（9）：1623-1633.

[22]Yoshida S，Yoshimoto H，Hirano A，et al.Wound Healing and Angiogenesis through Combined Use of a Vascularized Tissue Flap and Adipose-Derived Stem Cells in a Rat Hindlimb Irradiated Ischemia Model[J].Plast Reconstr Surg，2016，22（2）：1486-1497.

[23]Park IS，Chung PS，Ahn JC.Enhanced angiogenic effect of adipose-derived stromal cell spheroid with low-level light therapy in hind limb ischemia mice[J]. Biomaterial，2014，35（34）：9280-9289.

[收稿日期]2017-01-18 [修回日期]2017-07-16

編輯/張惠娟endprint