SRSF9/SRp30c通過調控GRβ對膠質瘤細胞增殖和遷移的影響*

劉 艷， 邵阿末， 殷 瑩， 李 正， 張 銳， 宗 達， 鄒 健， 胡亞玲△

(1無錫衛生高等職業技術學校， 江蘇 無錫 214028； 2無錫人民醫院中心實驗室， 江蘇 無錫 214023)

SRSF9/SRp30c通過調控GRβ對膠質瘤細胞增殖和遷移的影響*

劉 艷1， 邵阿末1， 殷 瑩2， 李 正2， 張 銳2， 宗 達2， 鄒 健2， 胡亞玲2△

(1無錫衛生高等職業技術學校， 江蘇 無錫 214028；2無錫人民醫院中心實驗室， 江蘇 無錫 214023)

目的探討富含絲氨酸-精氨酸剪切因子9/富含絲氨酸-精氨酸蛋白30c(SRSF9/SRp30c)和糖皮質激素受體β(GRβ)在膠質瘤細胞中的表達及兩者之間的關系。方法用小干擾RNA(siRNA)靶向干擾膠質瘤U87細胞中SRSF9的表達，同時用慢病毒將短發卡RNA(shRNA)轉染細胞，構建SRSF9敲減的U87穩轉細胞株，通過熒光顯微鏡觀察并檢測轉染情況。通過RT-qPCR和Western blot法檢測SRSF9/SRp30c和GRβ的表達水平，CCK-8和細胞集落形成實驗檢測細胞的增殖能力，劃痕實驗檢測細胞的遷移能力。結果用2種方法敲減SRSF9后，SRSF9/SRp30c表達均降低，GRβ的表達水平也隨之下降，差異有統計學意義(P<0.05)。熒光顯微鏡觀察結果表明，成功構建了穩轉細胞株，轉染效率超過80%。CCK-8實驗和細胞集落形成實驗的結果表明U87細胞在敲減SRSF9后，細胞活力和集落形成能力降低，差異有統計學意義(P<0.05)；劃痕實驗結果表明U87細胞在敲減SRSF9后，遷移能力明顯減弱,差異有統計學意義(P<0.05)。結論SRSF9/SRp30c可通過調控GRβ促進膠質瘤細胞的增殖和遷移。

膠質瘤； 糖皮質激素受體β； 富含絲氨酸-精氨酸剪切因子9/富含絲氨酸-精氨酸蛋白30c； 細胞增殖； 細胞遷移

膠質瘤是中樞神經系統最常見的惡性腫瘤，具有高發病率、低生存率、浸潤生長、治療困難等特點，因而嚴重影響人類的健康，成為神經外科領域的難點[1]。糖皮質激素受體(glucocorticoid receptor，GR)屬于保守的核受體超家族中的成員，人GR基因由9個外顯子組成。富含絲氨酸-精氨酸剪切因子9(serine-arginine-rich splicing factor 9，SRSF9)/富含絲氨酸-精氨酸蛋白30c(serine-arginine-rich protein 30c，SRp30c)是真核生物中重要的剪接因子，可對GR第9個外顯子不同剪切產生2個主要亞型，即GRα和GRβ[2]。近年的研究表明GRβ是膠質瘤的重要致病基因，在腫瘤相關基因調控網絡中發揮重要作用[3-4]。同時也有文獻報道SRSF9/SRp30在人多種腫瘤細胞中表達增加，與腫瘤的發生關系密切[5]。我們前期的數據分析顯示SRSF9/SRp30在膠質瘤中高表達，但SRSF9/SRp30c在膠質瘤中的功能及是否調控GRβ表達目前尚無文獻報道，因此本研究將對此進行探討。

材 料 和 方 法

1材料

DMEM培養液和青霉素-鏈霉素混合液購自HyClone；LipofectamineTM2000和TRIzol購自Invitrogen；MMLV逆轉錄酶、DNA聚合酶及緩沖體系購自Promaga；dNTP和相關引物均由上海生工生物工程有限公司合成；PMSF、RIPA、SDS-PAGE凝膠配制相關產品和CCK-8細胞毒性檢測試劑盒購自碧云天生物技術研究所；胎牛血清為Biological Industries生產；各種抗體購自Cell Signaling；PDTC為Sigma產品；PVDF膜、ECL化學發光底物來自Millipore。人腦膠質瘤U87細胞株由中國科學院上海細胞所提供，以含10%胎牛血清的DEME培養液，5% CO2、37 ℃、飽和濕度的培養箱進行細胞培養，0.25%胰酶消化傳代，傳代時間為每次2～3 d。實驗采用對數生長期細胞。

2儀器

HF160W型水套式二氧化碳培養箱(上海力申科學儀器有限公司)；冷凍離心機(Eppendorf)； BioPhotometer Plus核酸蛋白測定儀(Eppendorf)；GeneAmp 9600型PCR擴增儀(Perkin-Elmer)； LightCycler 2.0實時熒光定量PCR擴增儀(Roche)；全波長Multiskan Spectrum酶標儀(Thermo)；電泳設備(Bio-Rad)； IX71熒光倒置相差顯微鏡(Olympus)；FR-200A全自動紫外與可見光凝膠分析系統(上海普諾森生物科技有限公司)。

3主要方法

3.1小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)瞬時轉染 轉染前將對數生長期的膠質瘤細胞按3×105/孔接種到含無血清DMEM培養基的6孔板中，使轉染時細胞密度達到60%，根據操作說明轉染，分組為陰性對照(negative control)組和siRNA組，陰性對照組僅加轉染試劑，siRNA組加轉染試劑和siRNA的混合物。6 h后將各組培養基改為含10%胎牛血清的DMEM培養基繼續孵育，48 h和72 h后做后續實驗。

3.2短發夾RNA(short hairpin RNA，shRNA)穩定轉染 將對數生長期的U87細胞分為陰性對照(negative control)組和shRNA組，按1×105/孔接種于含無血清DMEM培養基的6孔板，待細胞貼壁后，以感染復數(multiplicity of infection，MOI)等于100作為腺病毒轉染U87細胞的條件。陰性對照組轉染GV248空載體，shRNA組轉染GV248-SRSF9-shRNA，8 h后將各組培養基改為含10%胎牛血清的DMEM培養基繼續孵育，根據需要進行后續檢測。

3.3轉染效率觀察和檢測 培養穩定轉染的細胞，24 h后通過熒光顯微鏡觀察轉染情況并采集照片，檢測轉染效率。

3.4RT-qPCR檢測 收集細胞，用TRIzol提取細胞總RNA。BioPhotometer Plus 核酸蛋白儀測定RNA濃度。取1 μg RNA進行逆轉錄。1 μL cDNA模板于25 μL反應體系中進行RT-qPCR，其中GAPDH為內參照， GAPDH的上游引物序列為5’-CCCATGTTCGTCATGGGTGT-3’，下游引物序列為5’-TGGTCATGAGTCCTTCCACGATA-3’；SRSF9的上游引物序列為5’-CCTGCGTAAACTGGATGACACC-3’，下游引物序列為5’-CCTGCTTTGGTATGGAGAGTCAC-3’；GRβ的上游引物序列為5’-GAAGGAAACTCCAGCCAGAA-CTG-3’，下游引物序列為5’-TGAGCGCCAAGATTGTTGG-3’。擴增條件為95 ℃ 10 min; 94 ℃ 30 s， 55 ℃ 30 s， 72 ℃ 30 s，共40個循環。以2-ΔΔCt相對定量法計算基因抑制效率。

3.5Western blot法檢測蛋白水平 收集各組細胞，用含1% PMSF的RIPA裂解細胞提取蛋白，BCA 法檢測蛋白濃度。取等量蛋白進行SDS-PAGE分離后轉至PVDF膜。以5%脫脂奶粉封閉1 h，加入I抗4 ℃孵育過夜，TBST洗3遍，加入HRP標記的 II 抗室溫孵育1 h，TBST洗4遍，采用ECL化學發光法顯色。以β-actin為內參照。

3.6CCK-8 法檢測細胞活力 按5×103/孔的密度將細胞接種于96孔板，加入不同濃度ADM孵育72 h。每孔加入10 μL CCK-8試劑，37 ℃繼續孵育2 h，多功能酶標儀檢測各孔450 nm波長下的吸光度(A450)。

3.7集落形成實驗 取細胞懸液計數，每組細胞分別以1×103/孔的密度接種于6孔板中，置細胞培養箱中培養2～3周。當培養皿中出現肉眼可見的集落時，終止培養。棄去上清液，用PBS小心浸洗2次。加4%多聚甲醛固定細胞15 min。然后去除固定液，加適量結晶紫染色15 min，然后洗去染色液，空氣干燥，最后計算集落形成率。

3.8劃痕實驗 收集2組細胞，按第2天可長滿的量接種于6孔板中，待細胞長滿培養板后劃痕，PBS洗去劃下的細胞，更換無血清培養基，于0和24 h分別采用顯微鏡觀察細胞的遷移情況，分別取4個視野拍照，進行數據統計。細胞遷移能力以遷移率表示，細胞遷移率(%)=(原劃痕寬度-現劃痕寬度)/原劃痕寬度×100%。

4統計學處理

應用SPSS 18.0軟件對數據進行分析。數據采用均數±標準差(mean±SD)表示，兩組間均數比較采用獨立樣本t檢驗， 以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1瞬時轉染SRSF9siRNA能抑制GRβ在膠質瘤細胞中的表達

RT-qPCR實驗結果顯示，膠質瘤細胞U87轉染SRSF9 siRNA 48 h后，SRSF9 mRNA的表達水平較陰性對照組明顯下降(P<0.05)，同時siRNA組GRβ mRNA的表達水平較陰性對照組明顯下降(P<0.05)，見圖1。Western blot檢測結果顯示，siRNA組與陰性對照組比較，SRp30c和GRβ的蛋白表達量都顯著降低(P<0.05)，見圖2。這說明在膠質瘤細胞中敲減SRSF9可抑制GRβ的表達。

Figure 1. The mRNA expression of SRSF9 and GRβ in the U87 cells after transfected withSRSF9 siRNA. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsnegative control group.

圖1轉染SRSF9siRNA后U87細胞中SRSF9和GRβmRNA的表達情況

Figure 2. The protein expression of SRp30c and GRβ in the U87 cells after transfected withSRSF9 siRNA. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsnegative control group.

圖2轉染SRSF9siRNA后U87細胞中SRp30c和GRβ蛋白的表達情況

2敲減SRSF9后GRβ在膠質瘤細胞中的表達降低

熒光顯微鏡結果表明成功構建SRSF9敲減和陰性對照的U87穩轉株，轉染效率超過80%，見圖3。RT-qPCR實驗結果顯示，在SRSF9敲減的U87細胞中，SRSF9 mRNA的表達水平較陰性對照組明顯下降(P<0.05)，同時GRβ mRNA的表達水平較陰性對照組明顯降低(P<0.05)，見圖4。Western blot檢測結果顯示，SRSF9 shRNA組與陰性對照組比較，SRp30c和GRβ的蛋白表達量都顯著降低(P<0.05)，見圖5。

3穩定轉染SRSF9shRNA對膠質瘤細胞增殖能力的影響

CCK-8實驗檢測結果表明，與對照組相比，穩定轉染SRSF9 shRNA的實驗組細胞的活力明顯減弱(P<0.05)，見圖6。細胞集落形成實驗結果表明，與對照組相比，穩定轉染SRSF9 shRNA的實驗組細胞集落形成能力明顯減弱(P<0.05),見圖7。

Figure 3. The transfection efficiency of the U87 cells 48 h after transfection (×100). Mean±SD.n=3.

圖3SRSF9敲減的U87細胞熒光轉染情況

Figure 4. The mRNA expression of SRSF9 and GRβ in the U87 cells after transfected withSRSF9 shRNA. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsnegative control group.

圖4SRSF9敲減后U87細胞中SRSF9和GRβ的mRNA表達

4穩定轉染SRSF9shRNA對膠質瘤細胞遷移能力的影響

劃痕實驗結果結果表明與對照組相比，穩定轉染SRSF9shRNA的實驗組細胞的遷移能力明顯降低,見圖8。

討 論

腦膠質瘤是人顱內最常見的原發惡性腫瘤，其主要特征是腫瘤細胞彌漫性浸潤生長、無明確邊界、無限增殖并具有高度侵襲性。膠質瘤的手術、放化療等治療技術已取得長足的發展，但膠質母細胞瘤患者的5年生存率仍不足3%[6]。隨著研究的深入，發現膠質瘤在本質上屬多基因病變，其發生發展受多種基因調節。因而，在基因調控水平上研究相關因子之間的關系是膠質瘤的研究方向之一,尋求新的分子基因靶點成為治療膠質瘤新的突破點。

Figure 5. The protein expression of SRp30c and GRβ in the U87 cells after transfected withSRSF9 shRNA. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsnegative control group.

圖5SRSF9敲減后U87細胞中SRp30c和GRβ蛋白水平的表達情況

Figure 6. The viability of U87 cells after transfected withSRSF9 shRNA detected by CCK-8 assay. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsnegative control group.

圖6SRSF9敲減后U87細胞活力的檢測結果

GR屬于核轉錄因子，廣泛分布于機體各組織細胞中。人GR基因由9個外顯子組成，第9個外顯子不同剪切結果產生GR兩個主要亞型，即GRα和GRβ。GRα在幾乎所有組織和細胞中表達，其含量遠超GRβ。對GRβ的研究最近幾年才引起關注，發現GRβ對糖皮質激素的生理及藥理作用起負性調控作用，尤其激素耐藥的腎病綜合征、類風濕關節炎及血液腫瘤等疾病均認為與GRβ的高表達有關[7-8]。我們前期研究也發現GRβ在膠質瘤細胞中表達增加，是引起膠質瘤發生、發展的一種致病因子[4]。

SRSF家族為富含絲氨酸精氨酸的剪接因子，是一類進化十分保守的剪接因子家族，在mRNA生物合成的所有進程中都發揮著重要作用[9]。SRSF家族的每個成員都可能有著其獨特的生物學功能。SRSF廣泛參與mRNA生物加工進程，更參與調控細胞轉化、基因組穩定性等多種重要生物學進程[10]。有報道稱SRSF家族成員與腫瘤的發生關系密切，SRSF1是一個原癌基因，它在許多腫瘤中表達上調，比如非小細胞肺癌和乳腺癌中有高表達[11-13]。另一個家族成員SRSF3也在多種腫瘤中高表達，SRSF3也可以調控細胞周期和增殖相關蛋白的選擇型剪接，下調SRSF3會抑制細胞生長、阻滯G2/M和促進細胞凋亡的發生；過表達SRSF3同樣可促進細胞轉化和腫瘤發生[14]。除此之外，SRSF9也是研究較多的一個成員，有報道稱其在膀胱癌中參與細胞增殖調控，上游是通過microRNA-1結合調控，但是SRSF9具體的下游作用機制仍不清楚[15]。另有研究表明SRSF9也是一個原癌基因，SRSF9不僅在許多腫瘤樣品中高表達，而且SRSF9過表達可以導致細胞轉化和腫瘤發生，同時在結腸癌細胞系中下調SRSF9可以抑制軟瓊脂集落形成能力[5]。GRβ是SRSF9/SRp30c對GR外顯子進行剪切之后形成的一種亞型結構，在人網狀細胞中，用蛙皮素減少SRp30c的表達量，GRβ也降低，反之過表達SRp30c，GRβ隨之上升，故SRp30c可調節GRβ的表達量[16]。但SRSF9/SRp30c在膠質瘤中的功能及是否調控GRβ表達目前尚無文獻報道。

Figure 7. Colony formation ability of the U87 cells after transfected withSRSF9 shRNA. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsnegative control group.

圖7SRSF9敲減后U87細胞集落形成的變化

Figure 8. The migration ability of the U87 cells after transfected withSRSF9 shRNA detected by wound healing experiment (×100). Mean±SD.n=3.*P<0.05vsnegative control group.

圖8細胞劃痕實驗檢測SRSF9敲減后U87細胞遷移能力的變化

本研究表明，靶向敲減SRSF9后，膠質瘤U87細胞的增殖和遷移能力都有減弱，此結果表明SRSF9/SRp30c也是促進膠質瘤增殖和遷移的因子；同時SRSF9被抑制后SRSF9/SRp30c的表達下降，GRβ在基因及蛋白水平表達也隨之下降，該結果提示SRSF9/SRp30c可通過調控GRβ促進膠質瘤增殖和遷移。故SRSF9/SRp30c可能通過調控GRβ影響膠質瘤細胞的一些生物學功能，但SRSF9/SRp30c促進GRβ表達是否與其選擇性剪切功能有關尚未明確，同時SRSF9/SRp30c有可能在膠質瘤中還參與其它與腫瘤相關的基因的選擇性剪切，也需進一步的探討。

[1] 蔣麗麗， 楊昌山， 趙燦國． Bmi-1 促人膠質瘤SNB19細胞生長惡化的作用機制[J]. 中國病理生理雜志, 2013, 29(3):418-424．

[2] Miranda TB, Morris SA, Hager GL. Complex genomic interactions in the dynamic regulation of transcription by the glucocorticoid receptor[J]. Mol Cell Endocrinol, 2013, 380(1-2):16-24.

[3] Stechschulte LA, Wuescher L, Marino JS, et al. Glucocorticoid receptor β stimulates Akt1 growth pathway by atte-nuation of PTEN[J]. J Biol Chem, 2014, 289(25):17885-17894.

[4] Yin Y, Zhang X, Li Z, et al. Glucocorticoid receptor β regulates injury-mediated astrocyte activation and contributes to glioma pathogenesis via modulation of β-catenin/TCF transcriptional activity[J]. Neurobiol Dis, 2013, 59: 165-176.

[5] Fu Y, Huang B, Shi Z, et al. SRSF1 and SRSF9 RNA binding proteins promote Wnt signalling-mediated tumorigenesis by enhancing β-catenin biosynthesis[J]. EMBO Mol Med, 2013, 5(5):737-750.

[6] Johnson DR, Galanis E. Incorporation of prognostic and predictive factors into glioma clinical trials[J]. Curr Oncol Rep, 2013, 15(1):56-63.

[7] Taniguchi Y, Iwasaki Y, Tsugita M, et a1. Glucocorticoid receptor-β and receptor-γ exert dominant negative effect on gene repression but not on gene induction[J]. Endocrino-logy, 2010, 151(7): 3204-3213.

[8] Kino T, Su YA, Chrousos GP. Human glucocorticoid receptor isoform β: recent understanding of its potential implications in physiology and pathophysiology[J]. Cell Mol Life Sci, 2009, 66(21):3435-3448.

[9] Twyffels L, Gueydan C, Kruys V. Shuttling SR proteins: more than splicing factors[J]. FEBS J, 2011, 278(18):3246-3255.

[10] 邵 偉， 樊玉杰， 徐永鎮. SR 蛋白家族在 RNA 剪接中的調控作用[J]. 生命科學, 2010, 22(7):710-716.

[11] Karni R, de Stanchina E, Lowe SW, et al. The gene encoding the splicing factor SF2/ASF is a proto-oncogene[J]. Nat Struct Mol Biol, 2007, 14(3):185-193.

[12] Ezponda T, Pajares MJ, Agorreta J, et al. The oncoprotein SF2/ASF promotes non-small cell lung cancer survival by enhancing survivin expression[J]. Clin Cancer Res, 2010, 16(16):4113-4125.

[13] Anczuków O, Rosenberg AZ, Akerman M, et al. The splicing factor SRSF1 regulates apoptosis and proliferation to promote mammary epithelial cell transformation[J]. Nat Struct Mol Biol, 2012, 19(2):220-228.

[14] Jia R, Li C, McCoy JP, et al. SRp20 is a proto-oncogene critical for cell proliferation and tumor induction and maintenance[J]. Int J Biol Sci, 2010, 6(7):806-826.

[15] Yoshino H, Enokida H, Chiyomaru T, et al. Tumor suppressive microRNA-1 mediated novel apoptosis pathways through direct inhibition of splicing factor serine/arginine-rich 9 (SRSF9/SRp30c) in bladder cancer[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2012, 417(1):588-593.

[16] Jain A, Wordinger RJ, Yorio T, et al. Spliceosome protein (SRp) regulation of glucocorticoid receptor isoforms and glucocorticoid response in human trabecular meshwork cells[J]. Invest Ophthalmol Vis Sci, 2012, 53(2):857-866.

(責任編輯： 林白霜， 羅 森)

EffectsofSRSF9/SRp30conproliferationandmigrationabilitiesofgliomacellsbyregulatingGRβ

LIU Yan1, SHAO A-mo1, YIN Ying2, LI Zheng2, ZHANG Rui2, ZONG Da2, ZOU Jian2, HU Ya-ling2

(1WuxiHigherHealthVocationalTechnologySchool,Wuxi214028,China;2CentralLaboratoryofWuxiPeople’sHospital,Wuxi214023,China.E-mail: 18014924193@163.com)

AIM: To investigate the expression of serine-arginine-rich splicing factor 9/serine-arginine-rich protein 30c (SRSF9/SRp30c) and glucocorticoid receptor β (GRβ) in the glioma cells and the relationship of them.METHODSSmall interfering RNA (siRNA) was used to knock down the expression ofSRSF9 in the U87 cells. Short hairpin RNA (shRNA) derived from lentivirus was used to establish U87 stable knockdown cell line. Fluorescence microscopy was used to observe and detect transfection efficiency. The expression of GRβ and SRSF9/SRp30c at mRNA and protein levels was determined by RT-qPCR and Western blot. The cell viability, colony formation ability and migration ability were measured by CCK-8 assay, colony formation assay and wound healing experiment.RESULTSThe mRNA and protein levels of SRSF9/SRp30c and GRβ in the U87 cells were both down-regulated after knockdown ofSRSF9 (P<0.05). Fluorescence microscopic observation showed that a stable cell line was constructed successfully, and the transfection efficiency exceeded 80%. After knockdown ofSRSF9 expression in the U87 cells, the cell viability and colony formation ability were reduced (P<0.05). The migration ability was weakened significantly afterSRSF9 was knocked down (P<0.05).CONCLUSIONSRSF9/SRp30c may promote the proliferation and migration of the glioma cells by regulating GRβ.

Glioma; Glucocorticoid receptor β; Serine-arginine-rich splicing factor 9/serine-arginine-rich protein 30c; Cell proliferation; Cell migration

R363; R739.4

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.10.015

1000- 4718(2017)10- 1825- 06

2017- 04- 05

2017- 06- 13

國家自然科學基金資助項目(No.81372710)

△通訊作者 Tel:0510-85350363; E-mail: 18014924193@163.com

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