RAS突變和微衛星不穩定與Ⅲ期結直腸癌患者臨床病理特征及預后的相關性分析*

劉建化， 黃成智， 曾衛強， 黎 瑩， 楊冬陽， 馬 冬△

(廣東省人民醫院, 廣東省醫學科學院 1胃腸腫瘤內科， 2胃腸外科， 3藥學部， 廣東 廣州 510180)

RAS突變和微衛星不穩定與Ⅲ期結直腸癌患者臨床病理特征及預后的相關性分析*

劉建化1， 黃成智2， 曾衛強3， 黎 瑩1， 楊冬陽1， 馬 冬1△

(廣東省人民醫院, 廣東省醫學科學院1胃腸腫瘤內科，2胃腸外科，3藥學部， 廣東 廣州 510180)

目的檢測Ⅲ期結直腸癌患者中RAS和BRAF基因突變以及微衛星不穩定(microsatellite instability，MSI)狀態，并分析其臨床病理關系及預后。方法收集2010～2015年廣東省人民醫院共281例經病理學證實的Ⅲ期結直腸癌組織標本，采用PCR-Sanger測序法和免疫組織化學法對石蠟切片進行分析，檢測RAS/BRAF基因突變和MSI狀態，并探討其與結直腸癌臨床病理特征和預后的關系。結果281例患者中，RAS/BRAF突變率為48.4%(136/281)，其中KRAS突變率最高(116/281，41.3%)。RAS/BRAF基因突變與癌胚抗原水平密切相關(P<0.05)。免疫組織化學法檢測到高度MSI(MSI-H)患者18例(6.4%)，MSI-H狀態在淋巴結轉移N2b期患者中更為常見(P<0.05)。BRAF基因在MSI-H腫瘤中的突變率較高(P<0.01)。RAS/BRAF野生型或者MSI-H患者的總生存期和無進展生存期均明顯高于突變型或低度MSI/微衛星穩定患者。結論RAS/BRAF突變和MSI檢測有助于結直腸癌生物學行為分析和患者預后判斷。

結直腸癌；RAS基因；BRAF基因； 微衛星不穩定

結直腸癌(colorectal cancer，CRC)是全世界范圍內最常見的惡性腫瘤之一，其發病率和死亡率分別位居第3位和第5位[1]，嚴重威脅人類健康。在我國，CRC發病例數逐年上升。除了手術切除，化療是最常用的治療手段，但由于個體基因表型差異，CRC對化療藥物耐藥的發生率較高。近年來隨著對腫瘤發病機制和生物學行為深入研究，特異性高且不良反應輕的分子靶向藥物日益成為研究焦點，為CRC進入精準醫學指導下的個體化治療提供了新思路。

研究證實，CRC發生、發展涉及多基因、多步驟、多途徑，其中微衛星不穩定(microsatellite instability，MSI)途徑和染色體不穩定途徑最為重要[2]。MSI是由錯配修復基因突變或啟動子甲基化造成的細胞DNA復制錯誤，在腫瘤基因調控中發揮重要作用[3]，參與多種人類腫瘤發生過程。CRC是MSI發生率較高的惡性腫瘤，90%的遺傳性非息肉病性CRC和約10%散發性CRC存在高度MSI(MSI-H)現象[4]。特別值得注意的是，染色體不穩定途徑涉及表皮生長因子受體(epithelial growth factor receptor，EGFR)介導的信號傳導通路，其與配體結合后可活化下游RAS/RAF/MAPK和PI3K/AKT/mTOR通路從而啟動信號轉導，誘導腫瘤細胞增殖、分化和侵襲[5]。目前針對EGFR的靶向藥物(如西妥昔單抗、帕尼單抗等)已經被廣泛用于晚期CRC治療，其較高的有效率更是開創了靶向治療里程碑。然而突變型RAS(包括KRAS、NRAS和HRAS)基因可導致 EGFR 信號通路異常激活，不受上游蛋白調控[6-7]，患者不能從抗EGFR治療中獲益。有研究顯示，BRAF突變的CRC患者腫瘤進展更快，對抗EGFR藥物敏感性更低，生存期更短[8]。故RAS/BRAF基因狀態檢測對指導臨床治療具有重大意義。

迄今為止，已有針對EGFR信號通路上的RAS/BRAF基因突變和MSI狀態與CRC發展轉移相關性研究探索[3, 8-9]，但對其臨床意義的認識尚不充分，且多為小樣本，缺乏系統性報道。本研究基于Sanger測序和免疫組化方法，以確診為Ⅲ期CRC患者的石蠟包埋組織為研究對象，檢測腫瘤中RAS/BRAF基因突變狀況和MSI狀態，并評價其臨床病理特征及預后價值，為CRC風險評估和治療提供理論依據。

材 料 和 方 法

1病例和材料

回顧性分析2010年1月～2015年10月廣東省人民醫院共281例經病理學證實的Ⅲ期CRC病例，所有病理標本均經10%甲醛固定，石蠟包埋。每個病例均有明確的起始時間(手術時期)、終點時間及終點狀態(生存/死亡)，死亡患者有明確的死亡時間和死因記錄。其中男性153例(54.4%)，女性128例(45.6%)，年齡22～84歲，平均59.0歲。存活組121例(43.0%)，中位生存期45.6月；死亡組146例(52.0%)，中位生存期24.2月；14例(5.0%)患者失訪。研究對象納入標準包括：(1)入組前患者均接受手術治療，病理學診斷為Ⅲ期CRC；(2)病理學標本充足，臨床資料齊備；(3)每個患者已簽知情同意書。合并炎癥性腸病或者機體其它部位原發性腫瘤的患者被排除。總生存期(overall survival，OS)和無進展生存期(progression-free survival，PFS)分別定義為隨機化開始至死亡/隨訪結束以及至局部復發/遠處轉移/隨訪結束。腫瘤的臨床分期和病理分級依據2010年國際抗癌聯盟(The Union for International Cancer Control，UICC)所定的結直腸癌分期法。

2實驗方法

2.1標本處理和基因突變檢測 采用DNA FFPE Tissue Kit (Qiagen)提取石蠟包埋腫瘤組織的DNA，用NanoDrop 2000分光光度儀檢測提取DNA濃度和A260/A280比值。采用PCR方法進行基因擴增，利用Ion AmpliSeqTMDesigner 1.2.6 軟件包(Life Technologies)設計基因引物序列，見表1。擴增條件為：95 ℃預變性5 min； 95 ℃變性30 s， 56 ℃退火45 s， 72 ℃延伸20 s，共45個循環；最后72 ℃延伸5 min。PCR產物純化后，用ABI 3730XL測序儀(Invitrogen Life Technologies)對KRAS(外顯子2、3、4)、NRAS(外顯子2、3、4)、HRAS(外顯子2)和BRAF(外顯子15)基因進行Sanger測序，測序結果采用 Chromas和DNAMAN軟件讀取，并與NCBI基因庫序列對比分析。

2.2免疫組化實驗 每個蠟塊取4 μm厚連續切片，免疫組化方法檢測CRC中錯配修復蛋白MLH1、MSH2、MSH6和PMS2的表達。SP免疫組化試劑盒購自北京中杉公司，鼠抗人單克隆抗體購自Cell Signaling Technology。檢測時切片常規脫蠟，抗原修復，分別滴加鼠抗人MLH1(1∶150)、MSH2(1∶100)、MSH6(1∶150)及PMS2(1∶150)，4 ℃孵育過夜，次日加入 II 抗，DAB顯色，蘇木素復染，中性樹膠封片。實驗中以正常細胞染色作為對照，腫瘤細胞核內出現棕黃色顆粒為陽性表達。MSI結果判定：4個蛋白均呈陽性表達即為微衛星穩定(mircosatellite stability，MSS)；出現1個陰性表達為低度MSI(MSI-L)；出現2個或2個以上陰性表達為MSI-H。

表1 RAS和BRAF基因擴增的引物序列和片段長度

3統計學處理

結 果

1RAS/BRAF基因突變頻率及類型

在281例Ⅲ期CRC組織標本中，RAS/BRAF突變率為48.4%(136/281)，其中KRAS突變率最高(116/281，41.3%)。在KRAS突變的患者中，第2、3、4外顯子突變例數分別為99例(85.3%)、4例(3.5%)和13例(11.2%)，其中第2外顯子第12密碼子的p.G12D突變最常見(41/116，35.3%)。圖1為檢測到的代表性突變型KRAS測序圖譜。與KRAS基因相比，NRAS(包括第2、3、4外顯子)和BRAF(包括第15外顯子)突變率較低：NRAS基因突變患者6例(2.1%)，以p.G12D突變最常見(3/6，50%)，未檢測到第4外顯子突變；BRAF基因突變患者19例，均為p.V600E突變，見表2。本研究未檢測到HRAS突變。

Figure 1. The representative sequencing chromatograph demonstratingKRASmutations in exon 2 (A) and exon 4 (B).

圖1結直腸癌患者突變型KRAS基因測序圖譜

在突變患者中，2例患者同時攜帶KRAS(p.G12D)和BRAF(p.V600E)突變，3例患者同時攜帶KRAS(p.G12D/p.A146T)和NRAS(p.G12D/p.A18T/ p.Q61L)突變，而本研究未檢測到BRAF和NRAS基因突變共存。

2免疫組織化學法檢測Ⅲ期CRC患者中MSI狀態

免疫組織化學染色證實：MSI-H患者18例(6.4%)，MSI-L患者38例(13.5%)，MSS患者225例(80.1%)，其中MSI-H/KRAS(p.G12D/p.G13D)7例，MSI-H/BRAF患者4例，而在MSI-H和MSI-L患者中，MLH1表達缺失最為常見(31/56，55.4%)。圖2為1例代表性的MSS病例。

表2KRAS、NRAS和BRAF基因各個外顯子不同突變亞型的發生率

Table 2. Mutation subtype frequency distribution ofKRAS,NRASandBRAFgenes

Genemutationsn(%)KRAS p．G12D41(35．3) p．G12V25(21．6) p．G12C10(8．6) p．G12A6(5．2) p．G12R3(2．6) p．G12S1(0．9) p．G13D13(11．2) p．A59T3(2．6) p．Q61H1(0．9) p．A146T7(6．0) p．A146V2(1．7) Others4(3．4)NRAS p．G12D3(50．0) p．A18T1(16．7) p．Q61L1(16．7) p．Q61R1(16．7)BRAF p．V600E19(100)

3RAS/BRAF基因突變和MSI狀態與Ⅲ期CRC臨床病理特征的相關性

本研究探討了RAS/BRAF基因突變和MSI狀態與Ⅲ期CRC患者的臨床病理聯系，卡方檢驗分析可見KRAS基因在癌胚抗原(carcino-embryonic antigen，CEA)≥20 μg/L患者中突變率高于CEA<20 μg/L患者(P<0.05)；NRAS基因在c-MET陰性/弱陽性表達患者中突變率為12.5%，明顯高于c-MET中/強陽性患者(P<0.01)；而BRAF基因突變與腫瘤部位密切相關，右半結腸癌明顯高于左半結腸癌及直腸癌患者(P<0.01)。但是RAS/BRAF基因突變與腫瘤分化程度、浸潤深度及區域淋巴結轉移無關，見表3。

MSI狀態與Ⅲ期CRC區域淋巴結轉移顯著相關，在N1、N2a和N2b患者中MSI-H所占比例分別為7.3%、0.0%和13.3%，即≥7個區域淋巴結轉移的患者更多呈MSI-H狀態(P<0.05)，而與患者的腫瘤部位、分化程度、浸潤深度、c-MET表達和CEA水平無關，見表4。

Figure 2. Immunohistochemical staining pattern of a microsatellite stability (MSS) in colorectal carcinoma (original magnification, ×100; magnification at the top right corner, ×400). A: negative control; B: MLH1 positive expression; C: MSH2 positive expression; D: MSH6 positive expression; E: PMS2 positive expression.

圖2免疫組化檢測的MSS結直腸癌患者

此外，本研究檢測發現BRAF基因在MSI-H腫瘤中的突變率(22.2%，4/18)高于MSI-L/MSS腫瘤(5.7%，15/263)(P<0.01)，而KRAS和NRAS基因突變與MSI狀態無關，見表5。

表3 RAS/BRAF基因突變與281例Ⅲ期結直腸癌患者的臨床病理關系

CEA: carcino-embryonic antigen.

4生存分析

截止到2016年12月1日隨訪結束，56.9%(160/281)的Ⅲ期CRC患者死亡，均死于腫瘤復發或轉移，中位隨訪時間36.0月(0.2～73月)，21例(7.5%)患者失訪。本研究進一步評估了RAS/BRAF基因突變和MSI狀態對Ⅲ期CRC患者預后生存的影響。結果顯示RAS/BRAF野生型患者OS和PFS均明顯高于突變患者(2=17.787，P<0.01和2=15.662，P<0.01)；同樣，MSI-H患者的預后優于MSI-L/MSS患者(OS：2=5.963，P<0.05； PFS：2=3.971，P<0.05)，見圖3。

討 論

CRC是臨床病理異質性較高的惡性腫瘤，其起病隱匿，侵襲性高。近年來EGFR作為CRC治療的一個重要靶點已經引起廣泛關注[5]，特別是EGFR信號通路中起關鍵作用的RAS/BRAF基因異常更與人類腫瘤惡性轉化密切相關。同時，作為CRC另一發病機制，MSI檢測成為CRC高危人群篩選和治療選擇的一種新手段，美國食品藥品監督管理局(Food and Drug Administration，FDA)已批準程序性細胞死亡蛋白1(programmed cell death protein 1，PD-1)抑制劑用于治療具有MSI-H的晚期實體瘤患者，這是FDA首次批準不按腫瘤來源，而直接按照生物標志物使用的抗癌藥物，是腫瘤治療史上一個重大突破[4]。目前，靶向藥物聯合免疫治療已成為CRC研究熱點。我們希望在此基礎上，進一步探討RAS/BRAF突變和MSI的相關性及其與CRC發生發展關系，從而找出新的分子診斷、治療和預后判定方法，在基因水平實現CRC個體化治療，使病人生存獲益。

本研究對281例Ⅲ期CRC組織標本進行檢測，結果顯示RAS/BRAF突變率為48.4%(136/281)，6.4%(18/281)患者為MSI-H；其中KRAS基因第2外顯子突變率最高，而RAS家族其它成員比如NRAS和HRAS的突變則較為罕見。值得一提的是，不同于RAS基因突變的異質性，BRAF突變具有同質性，均為V600E突變。上述結果與國外的研究類似[9-10]。有研究顯示[11]，BRAF基因突變率在CRC患者里為4%～10%，同樣的結論在我們的研究中也得到證實(6.8%，19/281)。此外，本研究也觀察到突變的KRAS、NRAS和BRAF基因之間以及突變基因和MSI-H狀態之間并不具有排他性，1.8%(5/281)患者同時存在2種基因突變，KRAS與BRAF突變、KRAS與NRAS突變相互重疊，而NRAS與BRAF突變卻是相互獨立的；遺憾的是我們未檢測到同一基因不同外顯子的突變共存，這些結果與近年來報道[12]部分不符，可能原因是所選樣本來源不同(中國人對比歐美人)以及樣本量存在差異。最近，一項回顧性研究也提出，MSI-H與RAS/BRAF突變之間并不排斥[13]，同樣我們的實驗檢測到11例MSI-H患者同時具有KRAS或BRAF突變。RAS/BRAF基因突變在CRC腫瘤發生早期即出現，腫瘤進程中癌細胞的MSI狀態始終不變。令人鼓舞的是，隨著基因譜數據不斷積累，基因之間的相關性將被進一步闡明。

表4MSI狀態與281例Ⅲ期結直腸癌患者的臨床病理關系

Table 4. The correlation between the microsatellite instability (MSI) status and clinicopathological features in 281 patients with stage Ⅲ colorectal cancer

ClinicopathologicalfeaturenMSI?H(%)MSI?L/MSS(%)PTumorlocation Leftcolon1226(4．9)116(95．1)0．646 Rightcolon353(8．6)32(91．4) Rectum1249(7．3)115(92．7)Differentiation Well/moderate16912(7．1)157(92．9)0．559 Poor1126(5．4)106(94．6)Depthofinvasion T110(0．0) 1(100．0)0．622 T2220(0．0)22(100．0) T321015(7．1)195(92．9) T4483(6．2)45(93．8)Nodalstage N119214(7．3)178(92．7)0．035 N2a590(0．0)59(100．0) N2b304(13．3)26(86．7)c?METexpression Negative/weak243(12．5)21(87．5)0．358 Moderate514(7．8)47(92．2) Strong20611(5．3)195(94．7)InitialCEA(μg/L) <20424(9．5)38(90．5)0．371 ≥2023914(5．9)225(94．1)

MSI-H: MSI-high； MSI-L: MSI-low； MSS: microsatellite stability.

表5 MSI狀態與基因突變的相關性

我們進一步探討了RAS/BRAF基因突變與Ⅲ期CRC臨床病理參數之間的關系，研究表明突變型RAS/BRAF基因在促進CRC發展、侵襲中具有重要臨床意義。具體說，KRAS基因在CEA≥20 μg/L的患者中突變率較高，而與其它臨床病理學特征無關。國內外有文獻報道，KRAS突變多預示患者老齡、腫瘤分化程度低、臨床分期晚[11-12]。不同研究結果的差異，可能源于研究人群遺傳背景不同。迄今為止，NRAS突變由于檢測率低，其臨床意義具有一定爭議性。在惡性黑色素瘤和白血病里，NRAS突變更多出現在老年患者，一項最近研究表明，右半結腸癌易發生NRAS突變[13]。在本研究中，NRAS突變與c-MET低表達密切相關，提示NRAS突變較其它RAS突變腫瘤惡性度較低。此外，CRC中HRAS突變更為罕見，突變率<0.5%，目前國內尚無有關HRAS突變臨床價值的報道。本實驗亦未檢測到HRAS突變腫瘤。我們的研究同時表明BRAF在女性、右半結腸癌突變率高，這與Martinetti等[11]研究結果基本一致。總之，RAS/BRAF突變的CRC具有更強的侵襲性，最終導致器官浸潤、腫瘤擴散。

Figure 3. Kaplan-Meier survival curves of stage Ⅲ colorectal carcinoma samples.

圖3Ⅲ期結直腸癌患者的OS和PFS生存曲線

近年來，多個數據顯示MSI-H的CRC患者具有明顯且獨立的臨床特征：MSI-H較之MSI-L/MSS患者，多表現為低分化、組織異質性明顯、克羅恩樣病表現以及淋巴細胞浸潤[6, 13]。孟文建等[14]對128例Ⅱ～Ⅲ期直腸癌患者進行分析，得出與上述相同結果，更進一步提出MSI-H好發于右半結腸、女性多見。我們的數據也證實MSI-H患者淋巴結轉移更明顯。在MSI與RAS/BRAF基因突變相關性研究中，統計顯示MSI-H與BRAF突變密切相關，而MSI狀態與其它基因突變無關。一項最近的研究也注意到BRAF突變的CRC中MSI-H占40%，結果有統計學意義[6]。然而Ogura等[13]分析表明MSI-L腫瘤更易出現NRAS突變，與其它基因突變無關。這種差異可能原因是入組患者種族不同以及研究方法有異。由此可見，MSI參與CRC發生發展，其狀態檢測有助于預測CRC生物學行為。

早在上個世紀90年代，KRAS突變作為實體瘤預后不良的因素已被報道，但是直到近些年，RAS/BRAF突變對CRC預后的預測價值才引起廣泛關注。同既往研究一樣，本實驗發現在Ⅲ期CRC中，RAS/BRAF基因突變組，特別是BRAF突變組，其OS和PFS明顯低于野生型組；而NRAS突變組的預后較其它突變組好。總之，RAS/BRAF基因突變是CRC預后不良的預測因子。此外，盡管多項國內外研究對MSI狀態與各臨床分期CRC的預后關系進行了探索，但結論尚未統一。就目前而言，比較一致的是在Ⅱ、Ⅲ期CRC患者中，MSI-H對生存有積極意義[15]，我們的研究結果也支持上述觀點。但是MSI狀態作為CRC患者生存的預測指標仍需大樣本前瞻性臨床試驗進一步證實。

綜上所述，由于本研究的回顧性本質，結果不可避免存在選擇性偏倚。研究過程中部分患者臨床資料失訪，特別是術后未再入院治療的病人。因此我們需要更多的體內外實驗證實上述觀點。總之，RAS/BRAF基因突變和MSI-L/MSS狀態不僅是Ⅲ期CRC致病機制，也是CRC侵襲力和預后不良的一個新的預測因子，其檢測對于判斷新發病例預后及制定個體化治療策略具有重要意義。

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(責任編輯： 盧 萍， 羅 森)

CorrelationofRASmutationsandmicrosatelliteinstabilitywithclinicopathologicalfeaturesandprognosisofpatientswithstageⅢcolorectalcancer

LIU Jian-hua1, HUANG Cheng-zhi2, ZENG Wei-qiang3, LI Ying1, YANG Dong-yang1, MA Dong1

(1DepartmentofGastrointestinalOncology,CancerCenter，2DepartmentofGastrointestinalSurgery，3DepartmentofPharmacy,GuangdongGeneralHospital,GuangdongAcademyofMedicalSciences,Guangzhou510180,China.E-mail:madong8005@126.com)

AIM: To investigate the status ofRAS/BRAFmutations and microsatellite instability (MSI) and their associations with clinicopathological features and prognosis of the patients with stage Ⅲ colorectal cancer (CRC).METHODSThe surgical patients with stage Ⅲ CRC (n=281) were followed up. The mutations ofRAS/BRAFwere examined by PCR amplification-Sanger sequencing, and MSI status was detected using immunohistochemistry (IHC) in their archival paraffin-embedded tissue specimens. The relationships of the status with the clinicopathological features and prognosis of the patients were statistically analyzed.RESULTSAmong 281 patients, the mutations ofRAS/BRAFwere observed in 136 cases (48.4%), including 116 cases (41.3%) ofKRASmutations.RAS/BRAFmutations were highly correlated with the level of carcino-embryonic antigen (P<0.05). Moreover, 18 cases (6.4%) of MSI-high (MSI-H) patients were determined by IHC, and MSI-H status was more common in N2b patients (P<0.05). Correlation study found that the mutation rate ofBRAFwas higher in MSI-H tumors than that in MSI-low (MSI-L)/microsatellite stability (MSS) counterparts (P<0.01), although no association betweenKRAS/NRASmutations and the MSI status was observed. The prognosis in the patients with wild-typeRAS/BRAFor MSI-H was better than the patients with any mutation or MSI-L/MSS (P<0.01).CONCLUSIONMutantRAS/BRAFand MSI may serve as fairly good indicators for prognosis of the patients with stage Ⅲ CRC.

Colorectal cancer;RASgene;BRAFgene; Microsatellite instability

R363； R735.3

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.10.017

1000- 4718(2017)10- 1837- 08

2017- 07- 04

2017- 07- 25

廣東省醫學科研基金資助項目(No. A2017418)

△通訊作者 Tel： 020-81884713-80521； E-mall: madong8005@126.com

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