GDC-0032抑制U251膠質瘤細胞活力并誘導DNA損傷*

崔海娟， 張亞云， 焦 鵬， 孫 錚

(1泰山醫學院護理學院， 山東 泰安 271016； 2鄭州大學第一附屬醫院， 河南 鄭州 450052；泰山醫學院 3生命科學研究中心， 4第二臨床醫學院， 山東 泰安 271000)

GDC-0032抑制U251膠質瘤細胞活力并誘導DNA損傷*

崔海娟1， 張亞云2， 焦 鵬3， 孫 錚4△

(1泰山醫學院護理學院， 山東 泰安 271016；2鄭州大學第一附屬醫院， 河南 鄭州 450052；泰山醫學院3生命科學研究中心，4第二臨床醫學院， 山東 泰安 271000)

目的探討磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)抑制劑GDC-0032對人膠質瘤U251細胞活力、細胞周期和DNA損傷的影響。方法GDC-0032處理U251細胞，MTT實驗檢測細胞活力；流式細胞術分析GDC-0032對細胞周期的影響；Western blot檢測細胞內蛋白表達的變化；免疫熒光檢測組蛋白γ-H2AX在細胞內的表達與分布。結果GDC-0032 劑量依賴性地抑制U251細胞活力；U251細胞經GDC-0032作用后，處于G1期的細胞數量明顯增多，同時p27的表達水平增加，而細胞分裂周期蛋白2(Cdc2)的表達則受到抑制；在GDC-0032作用的細胞中，γ-H2AX焦點的生成和表達水平明顯升高；另外，GDC-0032上調膠質瘤細胞中絲裂原活化蛋白激酶家族成員細胞外信號調節激酶(ERK)和c-Jun氨基末端激酶(JNK)的磷酸化水平，而survivin的表達則受到抑制。結論GDC-0032能夠通過抑制細胞活力和阻滯細胞于G1期而抑制U251細胞的增殖，并且誘導膠質瘤細胞發生DNA損傷；GDC-0032的抑癌活性與其調控ERK和JNK的活性及下調survivin的表達相關。

GDC-0032； 膠質瘤； 細胞活力； DNA損傷； 絲裂原活化蛋白激酶

磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)是一種胞內磷脂酰肌醇激酶，具有絲氨酸/蘇氨酸(Ser/Thr)激酶活性[1]。PI3K位于眾多重要信號通路的關鍵性信號位置，是PI3K/AKT/mTOR 信號通路的上游分子，由一個催化亞基(p110)結合一個調節亞基(p85、p55或p50)組成異源二聚體[2]。通常情況下，活化的PI3K能夠激活下游因子AKT從細胞膜轉移到細胞質或核內，通過磷酸化作用進一步激活或抑制其下游分子，從而調節細胞增殖、存活、代謝和分化等生理和病理過程[3]。由于PI3K的異常激活與腫瘤的發生、發展密切相關，使得開發新型小分子PI3K抑制劑已成為當前抗癌新藥研究的熱點[4]。

GDC-0032是一種新型的PI3K抑制劑，對PIK3CA突變和HER2/neu基因擴增的子宮漿液性癌呈現良好的抑制活性，同時增加頭頸部鱗狀細胞癌的放療敏感性[5-6]。本研究以人膠質瘤細胞系U251為實驗材料，檢測GDC-0032對膠質瘤細胞活力和DNA損傷的影響，并初步探討其內在的分子機制，以期為膠質瘤的臨床治療提供理論依據。

材 料 和 方 法

1實驗材料

GDC-0032購自Selleck Chemicals；MTT、碘化丙啶(propidium iodide，PI)和抗β-actin抗體購自Sigma；抗細胞外信號調節激酶(extracelluar signal-regulated kinase，ERK)、p-ERK、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)、p38、p-p38、細胞分裂周期蛋白2(cell division cycle protein 2，Cdc2)、p21和p53抗體購自Santa Cruz；抗p-JNK和p27抗體購自BD Biosciences；抗γ-H2AX抗體購自Abcam；HRP標記的 II 抗均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

2實驗方法

2.1細胞培養 人膠質瘤細胞株U251購于中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心，培養液為含10%胎牛血清(Gibco)的DMEM高糖培養基，細胞置于37 ℃、5% C02的飽和濕度培養箱中培養。

2.2MTT實驗檢測細胞活力 胰酶消化U251細胞并接種于96孔板中，過夜培養。次日加入不同劑量的GDC-0032 處理24 h，對照組加入DMSO。終止培養前4 h加20 μL MTT (5 g/L)于各個孔中。吸去培養基，接著每孔加入150 μL DMSO，置室溫振蕩10 min，酶標儀于490 nm波長下測定各孔吸光度(A)。

2.3流式細胞術檢測細胞周期 不同濃度的GDC-0032作用細胞24 h后，胰酶消化并制備單細胞懸液，然后加入預冷的75%無水乙醇于-20 ℃固定過夜。接著用PBS洗滌細胞2次，加入終濃度為50 mg/L RNase A于37 ℃ 孵育30 min；然后加入終濃度為50 mg/L的PI閉光染色20 min，然后上機分析各組細胞的周期分布。

2.4Western blot實驗 細胞經不同劑量GDC-0032處理24 h后，進行免疫印跡分析。各組細胞經PBS洗滌2次后，用預冷的的RIPA蛋白裂解液(含蛋白酶抑制劑)冰上裂解30 min，然后4 ℃、12 000 r/min離心 20 min，收集上清并用BCA法定量。 經SDS-PAGE分離蛋白，將凝膠上的蛋白質電轉至硝酸纖維素膜上；再用5%脫脂奶粉封閉，加入 I 抗，4 ℃ 孵育過夜。第2 d用PBS洗膜3次，每次5 min，加入 II 抗；最后使用ECL顯影成像。

2.5免疫熒光檢測γ-H2AX焦點 接種細胞于蓋玻片上，然后用不同濃度的GDC-0032 處理細胞24 h。PBS洗滌玻片2 次，4% 多聚甲醛固定20 min，Triton X-100室溫打孔5 min。山羊血清室溫封閉1 h，接著用γ-H2AX抗體孵育2 h，加入熒光II 抗(Thermo Fisher)37 ℃孵育1 h；然后用DAPI染細胞核10 min，50%甘油封片，在激光共聚焦顯微鏡下觀察并采集圖像。

3統計學處理

采用SPSS 16.0軟件進行分析。實驗所得數據以均數±標準差(mean±SD)表示，多組間比較應用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1GDC-0032對U251細胞活力的抑制作用

U251細胞經不同劑量的GDC-0032處理24 h后，采用MTT法檢測細胞活力。結果所示，GDC-0032能夠顯著抑制U251細胞的活力，且抑制作用呈劑量依賴性，見圖1。

Figure 1. The effects of GDC-0032 treatment at different concentrations for 24 h on the viability of the U251 cells determined by MTT assay. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖1GDC-0032抑制U251細胞活力

2GDC-0032阻滯U251細胞于G1期

接著，采用流式細胞術分析了GDC-0032對膠質瘤細胞周期的影響，發現GDC-0032作用U251細胞24h后，處于G1期的細胞數量明顯增多，而處于S期的細胞數量則相應減少，表明GDC-0032能夠誘導細胞發生G1期阻滯，見圖2、表1。

Figure 2. Upon exposure to GDC-0032 for 24 h, U251 cells exhibited G1phase arrest.

圖2GDC-0032誘導U251細胞阻滯于G1期

表1GDC-0032誘導U251細胞阻滯于G1期

Table 1. Upon exposure to GDC-0032 for 24h, U251 cells exhibited G1phase arrest (%. Mean±SD.n=3)

GDC?0032(μmol/L)G0/G1SG2/M069．75±2．6312．87±1．6316．56±1．620．574．23±2．82?8．24±1．17?18．15±1．84176．53±3．51?6．38±2．03?18．55±3．14579．86±1．38?4．76±1．54?15．21±3．76

*P<0.05vs0 μmol/L group.

Western blot結果表明，在GDC-0032處理的膠質瘤細胞中，Cdc2的表達水平受到抑制，而p27的蛋白水平則上調，p53和 p21的蛋白表達未見明顯變化，見圖3。

3GDC-0032誘導U251細胞發生DNA損傷

誘導腫瘤細胞發生DNA損傷也是化療藥物的重要抑癌分子機制之一。本研究采用免疫熒光檢測了GDC-0032對細胞內γ-H2AX焦點數量的影響。與對照組相比，U251細胞經GDC-0032 作用后，γ-H2AX的焦點數目明顯增多(圖4)；同時γ-H2AX的表達水平也顯著升高(圖5)，表明GDC-0032可誘導U251細胞發生DNA損傷。

4GDC-0032對絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinase，MAPK)信號通路和survivin表達的影響

Western blot檢測了細胞內MAPK相關蛋白的表達，發現GDC-0032處理U251細胞后，ERK和JNK的磷酸化水平明顯升高，p38的磷酸化水平未見明顯變化，見圖6。

用Western blot檢測了GDC-0032對膠質瘤細胞中survivin蛋白表達的影響，發現GDC-0032能夠顯著抑制survivin的蛋白表達，見圖7。

討 論

神經膠質瘤是成人中最常見的原發性中樞神經系統腫瘤，發病率高、侵襲性強和預后差[7]。目前臨床治療以手術、放療和化療相結合為主，但由于膠質瘤增殖速度較快和浸潤性極強，治療效果尚不理想。因此，在探討膠質瘤發病分子機制的同時，尋求有效的治療藥物已成為膠質瘤臨床治療的重要研究領域。本研究發現PI3K新型小分子抑制劑GDC-0032對膠質瘤細胞U251表現出良好的抑制活性。GDC-0032能夠通過阻滯細胞周期進程而抑制U251細胞增殖，并且誘導膠質瘤細胞發生DNA損傷。促進MAPK家族成員ERK和JNK的激活及其抑制survivin的表達可能與GDC-0032的抗腫瘤活性相關。

細胞周期調控紊亂是導致腫瘤細胞增殖失調的根本原因。在真核生物中，細胞周期蛋白(cyclin)、細胞周期蛋白依賴性激酶(cyclin-dependent kinase，CDK)和負向調控的CDK抑制因子(CDK inhibitor，CKI)構成復雜而精確的細胞周期調控系統[8-9]。p27和p21蛋白是CKI 家族中的重要成員，對細胞周期起負調控作用，能夠通過抑制CDK或cyclin/CDK復合物的活性而調控細胞G1/S期轉換[10]。本實驗結果顯示，GDC-0032能夠顯著誘導U251細胞G1期阻滯，這可能與上調p27的表達并抑制Cdc2的蛋白水平相關。

Figure 3. The effects of GDC-0032 treatment at different concentrations for 24 h on the expression of cell cycle-associated proteins in the U251 cells detected by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖3GDC-0032對細胞周期相關蛋白表達水平的影響

Figure 4. The formation of γ-H2AX foci in the U251 cells treated with different concentrations of GDC-0032 (×400). Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖4GDC-0032對U251細胞中γ-H2AX焦點生成的影響

Figure 5. GDC-0032 increased the expression of γ-H2AX. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖5Westernblot檢測GDC-0032對U251細胞DNA損傷的影響

Figure 6. The effect of GDC-0032 on the expression of MAPK signaling transduction pathway-related proteins in the U251 cells detected by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖6GDC-0032對MAPK信號轉導通路相關蛋白表達水平的影響

Figure 7. The protein levels of survivin in the U251 cells treated with GDC-0032 for 24 h determined by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖7GDC-0032抑制U251細胞內survivin蛋白的表達

誘導DNA雙鏈斷裂也是抗腫瘤化合物的作用機制之一[11]。DNA 修復能力的增強是引起腫瘤對DNA損傷誘導劑耐藥的重要分子基礎，抑制DNA損傷修復促進腫瘤的放化療敏感性。DNA 損傷可以誘導H2AX的磷酸化(γ-H2AX)，因而γ-H2AX 的表達與核內焦點數目已成為檢測DNA雙鏈斷裂的生物標志物[12]。本研究的免疫熒光及Western blot實驗結果顯示，U251細胞經GDC-0032作用后，γ-H2AX 表達量和細胞核內的焦點數目明顯增加，證實GDC-0032能夠誘導DNA 雙鏈斷裂，并且隨著GDC-0032濃度的增加損傷程度逐漸加強。

為了進一步探討GDC-0032抑癌活性的分子機制，本研究檢測了GDC-0032對MAPK信號通路關鍵成員ERK和JNK活性的影響。MAPK信號途徑在細胞外信號傳遞到細胞核內的過程中扮演著重要的角色，參與調節細胞生長發育、分化及凋亡等多種生理病理過程[13-14]。目前研究認為MAPK 主要由ERK1/2、JNK和p38 三條信號轉導途徑組成[15]。本研究發現，GDC-0032能夠促進U251細胞中ERK和JNK的磷酸化激活，表明 GDC-0032的抗腫瘤活性可能與其調節MAPK信號通路相關。

綜上所述，PI3K新型抑制劑GDC-0032能夠通過抑制細胞增殖和誘導DNA損傷應答而在膠質瘤細胞中表現出較好的抑制活性。調控MAPK家族成員ERK和JNK激酶活性可能是GDC-0032的抗腫瘤活性機制之一。本研究為GDC-0032的臨床應用及膠質瘤的治療提供了新思路。

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(責任編輯： 林白霜， 羅 森)

GDC-0032inhibitscellviabilityandinducesDNAdamageinU251humangliomacells

CUI Hai-juan1, ZHANG Ya-yun2, JIAO Peng3, SUN Zheng4

(1SchoolofNursing,TaishanMedicalUniversity,Tai’an271016,China;2TheFirstAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052,China;3LifeSciencesResearchCentre,4TheSecondSchoolofClinicalMedicine,TaishanMedicalUniversity,Tai’an271000,China.E-mail: 13405489981@163.com)

AIM: To investigate the effect of phosphatidylinostiol 3-kinase (PI3K) inhibitor GDC-0032 on cell viability, cell cycle and DNA damage in human glioma U251 cells.METHODSThe cell viability was analyzed by MTT assay. The cell cycle distribution of U251 cells was examined by flow cytometry. The protein expression was examined by Western blot. The expression and localization of γ-H2AX were determined by laser-scanning confocal microscopy.RESULTSGDC-0032 inhibited the cell viability in a dose-dependent manner. U251 cells showed G1phase arrest accompanied with upregulation of p27 protein after exposure to GDC-0032, while the expression of cell division cycle protein 2 (Cdc2) was inhibited. GDC-0032 treatment increased the formation of γ-H2AX foci and histone H2AX phosphorylation in the U251 cells. In addition, GDC-0032 upregulated the phosphorylation levels of mitogen-activated protein kinases， including extracellular signal-regulated kinase (ERK) and c-Jun N-terminal kinase (JNK)， in the glioma cells, while the expression of survivin was inhibited.CONCLUSIONGDC-0032 inhibits U251 cell growth by inhibition of cell viability and cell cycle progression. GDC-0032 also induces DNA damage of U251 cells. The anticancer activity of GDC-0032 is associated with increasing the activity of ERK and JNK and downregulating the expression of survivin.

GDC-0032; Glioma; Cell viability; DNA damage; Mitogen-activated protein kinases

R739.4； R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.10.020

1000- 4718(2017)10- 1858- 06

2017- 03- 27

2017- 05- 17

山東省自然科學基金資助項目(No. ZR2014HL107)

△通訊作者 Tel： 0538-6238072； E-mail： 13405489981@163.com

雜志網址： http://www.cjpp.net