Mnk2蛋白水平與食管鱗癌預后的相關性*

曾 博， 傅珉倚， 馮沿芬， 韓向前， 鄒大威， 羅紅鶴， 雷藝炎△

(中山大學附屬第一醫院 1胸外科， 2手術麻醉中心， 廣東 廣州 510080； 3中山大學腫瘤防治中心病理科， 廣東 廣州 510060)

Mnk2蛋白水平與食管鱗癌預后的相關性*

曾 博1， 傅珉倚2， 馮沿芬3， 韓向前1， 鄒大威1， 羅紅鶴1， 雷藝炎1△

(中山大學附屬第一醫院1胸外科，2手術麻醉中心， 廣東 廣州 510080；3中山大學腫瘤防治中心病理科， 廣東 廣州 510060)

目的檢測絲裂原活化蛋白激酶相互作用激酶2(mitogen-activated protein kinase-interacting kinase-2，Mnk2)在食管鱗狀細胞癌中的表達水平，并探討其與患者生存預后的相關性。方法收集臨床食管鱗癌標本86例及癌旁正常食管組織54例，應用Western blot法和免疫組化SP法檢測腫瘤組織及正常食管黏膜組織中Mnk2蛋白表達水平，并用Kaplan-Meier生存曲線和Cox比例風險回歸模型的方法探究其與食管鱗癌患者預后的關系。結果Mnk2在食管癌組織中呈高表達，并且Mnk2蛋白表達與食管鱗癌的TNM分期密切相關(P<0.05)，同時Mnk2蛋白高表達組的無疾病進展生存期和總生存期均少于Mnk2低表達組，多因素分析提示Mnk2是食管鱗癌的獨立預后因子。結論Mnk2在食管鱗癌組織中的表達與TNM分期有關，同時可作為預測食管鱗癌患者預后的指標。

食管鱗癌； 絲裂原活化蛋白激酶相互作用激酶2； 預后因子

食管癌已成為嚴重威脅人類健康的常見惡性腫瘤之一，全世界范圍內其死亡率位于第6位[1]。食管癌主要分為鱗癌和腺癌2種病理類型，中國地區人群主要以鱗癌為主，超過了食管癌總數的90%。過去10年，雖然食管癌的早期診斷和個性化治療取得很大進展，但是食管癌的5年生存率依然低于20%[2]。科學家們想通過研究例如程序性死亡分子配體1(programmed death ligand-1，PD-L1)和表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)等分子通路來分析食管鱗癌的發生發展機制，從而找到預測和治療食管癌的新方法，然而效果尚不令人滿意。

本課題組之前已報道了絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)相互作用激酶2(MAPK-interacting kinase-2，Mnk2)，作為一種MAPK通路激活的蛋白激酶，激活后可以作用于真核細胞翻譯起始因子4E(eukaryotic initiation factor 4E，eIF4E)，其上調被證明可以促進食管鱗癌的發生發展，提示Mnk2在食管鱗癌研究中的作用[3]。因此，本實驗采用Western blot法和免疫組化SP法進一步驗證Mnk2的表達，并首次分析了其對食管鱗癌患者預后的影響。

材 料 和 方 法

1研究對象

收集2010年8月～2012年6月中山大學附屬第一醫院胸外手術切除的86例食管鱗癌標本及54例距癌組織5 cm以上的手術遠端切緣的正常食管黏膜上皮組織標本。全部患者均有完整臨床資料，術前均未接受放、化療，且術后全部病理切片均由我院病理科2位以上病理醫生確診為食管鱗癌。電話隨訪患者每3個月1次直至死亡或術后滿5年，隨訪時間是從手術日期到死亡日期或者最后1次隨訪日期計算。本研究經中山大學附屬第一醫院倫理委員會批準。

2主要試劑

兔多克隆抗Mnk2抗體購自Sigma-Aldrich；BCA試劑盒和 II 抗購自Bio-Rad。

3方法

3.1Western blot法檢測Mnk2的表達 將食管組織研碎加入細胞溶解液提取蛋白。用BCA蛋白試劑盒檢測提取的組織溶液蛋白濃度。將等量的總蛋白進行電泳分離，轉移至PVDF膜，然后用脫脂奶粉封閉，洗膜后放入抗Mnk2抗體(1:1 000)溶液中，在4 ℃搖床上過夜。洗膜后放入 II 抗中孵育，再洗膜，顯影。顯影后的膠片用ImageJ 1.47i軟件掃描分析。

3.2免疫組化檢測Mnk2的表達 每例手術標本分別在癌灶及距癌組織5 cm以上正常食管組織2處取材。全部標本均經10%甲醛固定、石蠟包埋及4 μm連續切片。按照試劑盒說明書，采用SP方法進行檢測，切片最終通過DAB顯色并分析。以Mnk2已知陽性反應的組織切片作為陽性對照， 以PBS代替 I 抗作為陰性對照。

3.3免疫組化結果判定 Mnk2蛋白陽性信號定位于胞核。染色結果采用Thomas綜合計分法計算，即隨機選取5個視野計算陽性細胞占腫瘤細胞的百分數和著色程度：陽性細胞<10%計0分，11%～25%計1分，26%～50%計2分，51%～75%計3分，76%～100%計4分；淡黃色計1分，棕黃色計2分，棕褐色計3分。將陽性細胞百分數和著色強度的計分相乘，以中位數8分作為截斷值，小于或等于8為低表達，大于8為過表達。以上結果均至少由2位病理科醫生以盲法觀察確定。

4統計學處理

應用SPSS 23.0軟件對數據進行統計學處理。采用χ2檢驗、Kaplan-Meier生存曲線和Cox比例風險回歸模型對臨床病理特征、總生存期(overall survival，OS)、無疾病進展生存期(disease-free survival，DFS)及預后因子的單-多因素分析進行處理， 以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1Mnk2在食管鱗癌中的表達

隨機挑選了20對新鮮食管鱗癌組織和癌旁正常組織行Western blot法檢測，結果示Mnk2在食管鱗癌組織中的表達明顯高于癌旁正常組織，陽性率為75.0%，并且Mnk2陽性表達與腫瘤浸潤深度(T)、淋巴結轉移(N)和臨床分期(clinical stage)均有顯著的相關性(P<0.05)。將86份腫瘤組織和54份癌旁正常食管組織用免疫組化法進行分析，發現食管鱗癌組織中Mnk2染色陽性率為52.3%，在正常食管組織中則為5.6%，見圖1、2和表1、2。

Figure 1. The expression of Mnk2 in ESCC pericarcinomatous tissues and cancerous tissues detected by Western blot. Mean±SD.n=20.**P<0.01vspericarcinomatous tissue group.

圖1Westernblot法檢測Mnk2在食管鱗癌組織和癌旁正常組織中的表達

Figure 2. The expression of Mnk2 in normal esophageal tissues and ESCC tissues detected by immunohistochemistry. A: normal esophageal tissue showed nearly negative expression of Mnk2; B: low expression of Mnk2 in ESCC sample; C: high expression of Mnk2 in ESCC sample.

圖2免疫組化法檢測Mnk2在癌旁正常組織和食管鱗癌組織中的表達

表1Westernblot法檢測Mnk2在新鮮食管鱗癌組織中的表達及與腫瘤TNM分期的相關性分析

Table 1. Correlation between Mnk2 protein expression by Wes-tern blot and clinical characteristics in ESCC (n=20)

VariableLowexpression(n=5)Highexpression(n=15)PTstage0．014 T1/T24(20．0%)2(10．0%) T3/T41(5．0%)13(65．0%)Nstage0．016 N05(25．0%)5(25．0%) N1?20(0．0%)10(50．0%)Clinicalstage0．030 I/II5(25．0%)6(30．0%) III0(0．0%)9(45．0%)

2食管鱗癌Mnk2陽性表達與臨床病理特征的關系

免疫組化方法顯示，在86例食管鱗癌中，Mnk2陽性表達與腫瘤浸潤深度和臨床分期均有顯著的相關性(P<0.05)，而與年齡、性別、吸煙、腫瘤分化程度、腫瘤侵犯長度和淋巴結轉移均未顯示有統計學相關性，見表3。

3食管鱗癌Mnk2的生存預后分析

Kaplan-Meier生存曲線提示ESCC 病人Mnk2高表達與較差的OS和DFS密切相關(P<0.05)，見圖3。單因素分析提示Mnk2高表達與DFS和OS相關(P<0.05)，多因素分析提示Mnk2是ESCC 病人DFS和OS的獨立預后因子(P<0.05)，見表4、5。

表2 免疫組化法檢測Mnk2在食管鱗癌和正常食管組織中的表達

討 論

MAPK信號通路在惡性腫瘤中發揮了促有絲分裂和抗凋亡作用，在食管癌研究中也發現 MAPK 信號通路的表達失調，被認為是參與腫瘤發生發展的重要通路之一[4]。我們首次報道了Mnk2作為MAPK通路的重要信號分子，在食管鱗癌中的表達及作用，闡述了Mnk2可能作為細胞外調節蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)通路的下游因子，通過活化后上調eIF4E的表達，從而促進食管鱗癌的發生發展[5-6]。在本研究中，我們進一步完善研究方法和樣本數，收集食管鱗癌患者隨訪預后資料，對Mnk2蛋白在疾病預后中的作用進行了研究。

本次實驗中，我們增加了對新鮮食管鱗癌組織的檢測，并擴大了正常組織對照樣本量，進一步驗證了Mnk2在食管鱗癌中的高表達效應及在癌旁正常組織中的低表達效應，同時發現在2種檢測方法中Mnk2的陽性表達均與食管鱗癌的腫瘤浸潤深度、臨床分期密切相關，為Mnk2促進食管鱗癌細胞增殖和抗凋亡進而影響腫瘤浸潤深度的作用提供了證據，然而Mnk2過表達對淋巴結轉移的影響在大樣本中沒有統計相關性，其是否具有促腫瘤細胞轉移的作用還有待進一步研究。

表3食管鱗癌組織Mnk2陽性表達與臨床病理特征的關系

Table 3. Correlatim between the protein expression of Mnk2 and clinical characteristics in ESCC (n=86)

VariableLowexpression(n=41)Highexpression(n=45)PAge(year)60．3±10．660．2±9．20．974Sex0．955 Male33(38．4%)36(41．9%) Female8(9．3%)9(10．5%)Smoking0．745 Yes26(30．2%)27(31．4%) No15(17．4%)18(20．9%)Differentiation0．337 Low17(19．8%)16(18．6%) Moderate20(23．3%)23(26．7%) High4(4．7%)6(7．0%)Lengthoftumor(cm)2．92±1．253．46±1．570．091Tstage0．001 T1/T224(27．9%)11(12．8%) T3/T417(19．8%)34(39．5%)Nstage0．356 N028(32．6%)24(27．9%) N1?213(15．1%)21(24．4%)Clinicalstage0．017 I/II28(32．6%)20(23．3%) III13(15．1%)25(29．1%)

我們還發現 Mnk2表達高低對食管鱗癌患者的預后存在顯著影響，Mnk2高表達組 OS及 DFS較 Mnk2 低表達組明顯降低，提示其表達高低與預后密切相關。進一步行多因素分析， 結果發現 Mnk2 的表達是影響食管鱗癌患者 OS及 DFS的獨立預后因子。 因此，我們認為 Mnk2 的表達對預測食管鱗癌患者的預后具有一定價值，同時可能作為腫瘤治療的潛在靶點之一。已有報道研究Mnks抑制劑在腫瘤中的抗癌作用，例如急性髓系白血病[7]、卵巢癌、結腸癌和乳腺癌[8]等。由于Mnks抑制劑作用的復雜性，不同的研究甚至出現了相互矛盾的結果。一方面Mnks抑制劑表現出了在細胞周期中抗腫瘤細胞生殖和調節細胞凋亡的作用，另一方面證明了Mnks抑制劑的敏感性可能與eIF4E的磷酸化水平相關[9]。更多研究報道了大部分實體瘤對特異性Mnk2抑制劑的敏感性超過了非特異性的Mnks抑制劑[7]，提示了Mnk2在實體腫瘤生長的過程中的特殊作用。然而Mnks抑制劑對食管癌作用的資料尚少，將是我們今后研究工作的方向。

綜上所述， 本研究從Mnk2與食管鱗癌的臨床相關性進行了研究，證明了Mnk2的表達與食管鱗癌患者的預后密切相關，且其表達情況與食管鱗癌的臨床特性存在統計學顯著性， 提示可能在食管鱗癌中的發生發展起重要作用，同時為研究Mnk2信號通路在食管癌中的作用及其作為靶向治療的潛在靶點提供了前期實驗基礎。

Figure 3. Kaplan-Meier survival analysis of Mnk2 expression in ESCC patients (n=86). A: overall survival (OS) curves for ESCC patients according to the expression of Mnk2; B: disease-free survival (DFS) curves for ESCC patients according to the expression of Mnk2.

圖3Kaplan-Meier生存曲線分析Mnk2表達與食管鱗癌患者OS及DFS的關系

表4 食管鱗癌患者DFS的單-多因素分析

表5 食管鱗癌患者OS的單-多因素分析

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(責任編輯： 林白霜， 余小慧)

CorrelationbetweenMnk2proteinexpressionandprognosisofpatientswithesophagealsquamouscellcarcinoma

ZENG Bo1, FU Min-yi2, FENG Yan-fen3, HAN Xiang-qian1, ZOU Da-wei1, LUO Hong-he1, LEI Yi-yan1

(1DepartmentofThoracicSurgery，2DepartmentofSurgeryandAnesthesiaCenter,TheFirstAffiliatedHospital,SunYat-senUniversity,Guangzhou510080,China;3DepartmentofPathology,SunYat-senUniversityCancerCenter,Guangzhou510060,China.E-mail:leiyyzsu@126.com)

AIM: To investigate the protein expression of mitogen-activated protein kinase-interacting kinase-2 (Mnk2) and its prognostic effect in the patients with resected esophageal squamous cell carcinoma (ESCC).METHODSA total of 86 informative patients with surgically resected ESCC and 54 normal esophageal tissues were enrolled. Western blot and immunohistochemistry (IHC) were utilized to assess the protein expression of Mnk2, and its correlation with prognosis was statistically analyzed by the methods of Kaplan-Meier curve and Cox proportional hazard mode.RESULTSThe protein expression of Mnk2 was elevated in most of tumor tissues compared with the adjacent tissues. Clinicopathologic analysis showed that Mnk2 expression was significantly correlated with the TNM stage (P<0.05). Both disease-free survival (DFS) and overall survival (OS) of Mnk2 over-expression patients were shorter than those in Mnk2 negative expression group. Multivariate analysis confirmed that Mnk2 expression, as an independent and significant factor for both DFS and OS, predicted a poor prognosis of the patients with resected ESCC (P<0.05).CONCLUSIONThe expression of Mnk2 was significantly related to the TNM stages, and might be a novel predictor for prognosis in ESCC.

Esophageal squamous cell carcinoma; Mitogen-activated protein kinase-interacting kinase-2; Prognosis factor

R730.23； R735.1

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.10.021

1000- 4718(2017)10- 1864- 05

2017- 07- 04

2017- 09- 11

廣東省醫學科研基金資助項目(No. A2014217； No. A2014246； No. A2016297)

△通訊作者 Tel: 020-87755766-8782; E-mail: leiyyzsu@126.com

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