缺血后適應對大鼠局灶性腦缺血再灌注所致自噬的抑制作用*

陶紅苗， 單小云， 李旭升， 陳浩浩， 毛宇飛， 何忠平

(1金華職業技術學院， 2金華市中心醫院， 3金華市食品藥品檢驗所，浙江 金華 321000)

·短篇論著·

缺血后適應對大鼠局灶性腦缺血再灌注所致自噬的抑制作用*

陶紅苗1△， 單小云2， 李旭升1， 陳浩浩1， 毛宇飛1， 何忠平3

(1金華職業技術學院，2金華市中心醫院，3金華市食品藥品檢驗所，浙江 金華 321000)

目的探討缺血后適應對大鼠局灶性腦缺血再灌注所致自噬的影響。方法取健康雄性SD大鼠30只，隨機分為假手術(sham)組、缺血再灌注(I/R)組、缺血后適應(IPC)組，每組各10只。Sham組僅單純暴露右側頸總、頸內和頸外動脈；I/R組采用 Longa改良線栓法制備大鼠右側大腦中動脈缺血2 h、再灌注24 h模型；IPC組大鼠缺血2 h后，同側頸總動脈再通10 s/閉塞10 s，循環5次，然后全面恢復血流再灌注24 h。采用透射電鏡觀察腦細胞自噬情況；Western blot法測定各組大鼠腦組織中哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、磷酸化mTOR(p-mTOR)和微管相關蛋白輕鏈3(LC3)-Ⅱ的蛋白表達水平；TTC法檢測腦梗死面積；干濕稱重法測定腦組織含水量；HE染色觀察腦組織病理學變化。結果IPC組mTOR、p-mTOR均顯著高于I/R組(P<0.05)，LC3-Ⅱ顯著低于I/R組(P<0.01)。IPC組腦梗死面積、腦組織含水量均顯著低于I/R組(P<0.01)。HE染色顯示，IPC組神經元變性、壞死較I/R組明顯減輕。透射電鏡顯示IPC組神經元損傷程度明顯減輕，自噬泡明顯減少。結論IPC通過減少細胞內自噬而減輕腦缺血再灌注損傷，可能與增強mTOR作用有關。

腦； 缺血再灌注損傷； 缺血后適應； 自噬； 哺乳動物雷帕霉素靶蛋白

缺血性腦卒中是全球主要的致死及致殘疾病之一[1]，在有效時間窗內恢復缺血腦組織的血液灌注是目前缺血性腦卒中的唯一有效治療策略。然而，血流再灌注卻造成腦缺血再灌注(ischemia- reperfusion，I/R)損傷，極大地影響缺血性腦卒中的臨床治療。

腦缺血損傷的病理機制尚未完全闡明，有證據表明細胞自噬可能發揮了重要的作用[2-4]。細胞自噬是一種細胞通過自噬泡-溶酶體途徑降解細胞內容物的過程。正常情況下，細胞內維持著低水平的自噬；當受到營養缺乏、低氧和炎癥等刺激后細胞內自噬可被激活[5]。自噬在腦缺血損傷過程中發揮了復雜的作用，腦缺血可以誘導自噬產生從而通過降解損傷的線粒體、清除炎癥物質等機制發揮神經保護作用[6-7]；而過度激活的自噬則加重了缺血損傷[8]。缺血后適應(ischemic postconditioning，IPC)是指在腦缺血復灌后通過對復灌血流進行反復限制，從而發揮抗缺血性腦損傷的作用，但具體機制不清[7, 9-10]。諸多證據顯示細胞自噬可能參與了上述過程，但IPC對自噬的調控作用仍然存在爭議[8,11-13]。

本實驗制備大鼠局灶性腦缺血再灌注模型，并進行缺血后適應，通過透射電鏡檢測腦細胞自噬及Western blot法測定各組大鼠腦組織中哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)，p-mTOR和微管相關蛋白輕鏈3(microtubule associated protein light chain 3，LC3)-Ⅱ的表達水平等來探討IPC對腦缺血再灌注所誘導自噬的調控作用。

材 料 和 方 法

1動物

普通級雄性健康SD大鼠30只，體重250～280 g，由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供。生產許可證號為SCXK(滬)2012-0002，動物合格證號為0267760。

2主要試劑及材料

栓線(2634-A4型，北京沙東生物有限公司)；抗mTOR抗體、抗LC3抗體 (Abcam)；抗p-mTOR(Ser2448)抗體(CST)；GAPDH(聯科生物)； 山羊抗兔 II 抗(聯科生物)。

3主要方法

3.1動物分組及模型制備 30只大鼠按隨機數字表法分為假手術(sham)組、I/R組、IPC組，每組各10只。取大鼠稱重，以10%水合氯醛(350 mg/kg)腹腔麻醉成功后，sham組僅單純暴露右側頸總、頸內、頸外動脈，不做其它任何處理； I/R組采用 Longa改良線栓法制備右側大腦中動脈栓塞(right middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型[14]：頸部正中切口，分離右側頸總、頸外及頸內動脈，結扎頸外動脈遠心端，用血管夾暫時夾閉頸總動脈近心端和頸內動脈，在頸外動脈靠近頸總動脈分叉處剪一小口，插入一端經硅膠包被的特制線栓，松開頸內動脈上的血管夾，將線栓輕輕由頸外動脈插入頸內動脈，直至線栓堵塞大腦中動脈的起始部，線栓插入深度一般為18～20 mm，扎緊線栓，缺血2 h后，拔出線栓再灌注24 h；IPC組大鼠實施MCAO 2 h后，同側頸總動脈再通10 s，血管夾夾閉10 s，循環5次[15]，后拔出線栓恢復血流再灌注24 h。待大鼠蘇醒后依據Zea Longa 5分制標準評分：無神經功能缺損癥狀，活動正常者為0分；不能伸展對側前爪者為1分；爬行時出現向左轉圈者為2分；行走時身體向偏癱側傾倒者為3分；不能自發行走，意識喪失者為4分。

3.2標本的采集和保存 每組取4只造模成功大鼠以10%水合氯醛麻醉處死，迅速斷頭取腦組織，去除嗅球、小腦和低位腦干，取右側大腦半球組織標本，用于腦梗死面積測定。其余 6只動物處死后迅速采用預冷的生理鹽水及4%甲醛溶液(溶于生理鹽水)恒壓貫序體循環灌流固定，以梗死區腦組織為中心，分別取材并用于以下指標檢測：沿海馬位置冠狀位切一塊腦組織浸入4%甲醛固定，用于病理學檢查；取約2 mm厚的腦組織稱濕重后用于含水量檢測；取小塊腦組織迅速放入液氮，再轉入-80 ℃冰箱保存，用于Western blot檢測；另切取1 mm×1 mm×1 mm皮層浸入2.5%戊二醛固定，用于透射電鏡檢查。

3.3Western blot法檢測mTOR、p-mTOR和LC3-II的蛋白水平 腦組織稱重后剪碎勻漿，加入細胞裂解液，離心，取上清采用BCA 法測定蛋白濃度，于-80 ℃冰箱中保存備用。取適量蛋白樣本按常規方法進行SDS-PAGE，凝膠電泳結束后，將凝膠上分離到的蛋白條帶轉印至PVDF膜上，然后分別用mTOR、p-mTOR、LC3、GAPDH I 抗及山羊抗兔 II 抗對其進行孵育、檢測。用ImageJ圖像分析軟件分析灰度值，以mTOR、p-mTOR分別與GAPDH的比值和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值為蛋白相對表達水平。

3.4TTC法檢測腦梗死面積 沿冠狀切面切片，片厚約2 mm，迅速置于2% TTC-PBS溶液中，37 ℃避光孵育30 min，不時翻動腦切片，使之與染液均勻接觸。正常腦組織染成深紅色，梗死區為白色(不著色)。染色后棄去染液，將腦片放入4%甲醛中固定24 h，數碼相機拍照，圖像輸入計算機，用圖像分析軟件Image-Pro Plus 6.0計算腦梗死面積百分比。腦梗死面積百分比(%)= 梗死面積/總面積×100%。

3.5干濕法測定腦組織的含水量 取病變側約2 mm厚的腦組織稱濕重，放入95 ℃烤箱內烘干24 h后取出恢復到室溫，稱干重。腦組織含水量(%)=(腦組織濕重-腦組織干重)/腦組織濕重×100%。

3.6腦組織的病理學觀察 沿海馬位置冠狀位切取腦組織，浸入4%甲醛固定，常規進行石蠟包埋HE染色制片，觀察腦組織病理變化。

3.7透射電鏡觀察腦組織的自噬情況 取1 mm×1 mm×1 mm皮層腦組織，置于2.5%戊二醛溶液固定過夜，磷酸緩沖液沖洗后用1%鋨酸固定1 h；梯度乙醇、丙酮脫水，包埋。超薄(120 nm)切片經鈾、鉛雙染后上單孔銅網，透射電鏡下觀察自噬體形成情況并拍照。

4統計學處理

用GraphPad Prism 6.0軟件進行統計學處理。所有計量指標以均數±標準差(mean±SD)表示。多組資料比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，采用Tukey 法進行組間均數的兩兩比較，以P<0.05 表示差異有統計學意義。

結 果

1各組大鼠腦組織中mTOR、p-mTOR和LC3的蛋白水平變化

Western blot檢測顯示I/R組的mTOR/GAPDH及p-mTOR/GAPDH的比值與sham組相比差異均無統計學顯著性；而IPC組mTOR/GAPDH顯著高于I/R組(P<0.01)， p-mTOR/GAPDH亦顯著高于I/R組(P<0.05)。 I/R組LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值顯著高于sham組(P<0.01)，而IPC組LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ顯著低于I/R組(P<0.01)，見圖1。

Figure 1. The protein levels of mTOR, p-mTOR and LC3 in the cortex of rats determined by Western blot. Mean±SD.n=6.**P<0.01vssham group;#P<0.05,##P<0.01vsI/R group.

圖1Westernblot檢測大鼠大腦皮層mTOR、p-mTOR和LC3的蛋白表達

2腦梗死面積的檢測結果

I/R組的腦梗死面積為26.90%±4.78%，IPC組為14.70%±1.44%，差異具有統計學意義(P<0.01)，見圖2A。

3腦組織含水量的檢測結果

I/R組腦組織的含水量明顯高于sham組(P<0.05)，IPC組腦組織含水量則比I/R組明顯減少(P<0.05)，見圖2B。

Figure 2. The effects of IPC on infarct size (A) and water content (B). The representative images of the infarcts stained with TTC in each group were showed. Mean±SD.n=4.*P<0.05vssham group;#P<0.05,##P<0.01vsI/R group.

圖2IPC對腦梗死面積和腦組織含水量的影響

4腦組織的病理學觀察

本實驗采用HE染色觀察了缺血周邊區，即半暗帶的細胞損傷情況。結果顯示sham組大鼠腦組織皮層區和海馬區結構正常，細胞排列致密規則，無明顯水腫、細胞變性、壞死等病變；I/R組大鼠腦皮層組織水腫、疏松，部分細胞變性、壞死，海馬區見大量神經細胞胞核皺縮、深染呈變性壞死狀態；IPC組上述改變較I/R組明顯減輕，見圖3。

5透視電鏡的觀察結果

透射電鏡觀察可見sham組的神經元細胞核結構正常，染色質分布較均勻，線粒體脊線清晰，神經髓鞘豐富，有1～2個自噬泡；I/R組神經元呈明顯損傷形態并可見較多的自噬泡形成；與I/R組比較，IPC組神經元損傷程度明顯減輕，自噬泡明顯減少，見圖4。

Figure 3. HE staining of neurons in cortex and hippocampus of rats (×200).

圖3大鼠腦皮層和海馬的HE染色觀察

Figure 4. Observation of autophagy in the brain of rats by transmission electron microscopy.

圖4透射電鏡觀察大鼠腦組織自噬

討 論

研究表明，在缺血再灌注損傷中施加IPC、藥物等調控因素可以有效減輕其損傷程度[7, 9-10, 16-17]，提示IPC是一種潛在的腦缺血損傷治療策略。雖然IPC，尤其是遠端肢體缺血后適應已初步應用于臨床，但是IPC仍存在一定的風險，且其機制也不完全清楚。因此通過明確IPC的神經保護機制，可能為缺血性腦損傷的治療提供重要的線索。自噬是腦缺血過程中的重要細胞生物學事件，相關研究提示細胞自噬可能與腦缺血過程密切相關，但IPC過程中自噬發揮了什么作用仍不清楚。

近年來的證據表明腦缺血過程中伴有細胞自噬發生，且缺血前適應和后適應過程中也都伴有自噬激活。自噬在腦缺血過程中的作用仍存在爭議，如：在腦缺血復灌過程中自噬通過清除損傷線粒體降低了神經元凋亡；但也有證據表明，缺血后的自噬激活反而加重了神經損傷[2-4, 6]。但IPC是否調控了腦缺血后再灌過程中的自噬仍不十分清楚。LC3是自噬標志物，自噬泡成熟時，LC3-I會轉變為(自噬體)膜型(即LC3-II)，LC3-II/LC3-I比值的大小被廣泛用于評估自噬水平的高低。本實驗結果顯示，I/R組大鼠大腦皮層LC3-II表達顯著高于sham組，表明腦I/R組織自噬被激活，IPC組LC3-Ⅱ表達顯著低于I/R組，提示IPC干預后再灌注組織中自噬減少。我們進一步利用透射電鏡對缺血腦組織進行了觀察，結果發現IPC組胞內自噬泡數量亦少于I/R組。此外mTOR作為PI3K/Akt信號通路的關鍵下游分子，IPC可能通過激活PI3K/Akt/mTOR信號通路從而減輕自噬。雖然IPC的自噬抑制作用在PC12細胞氧糖剝奪/再灌注模型中已被發現[13]，但本研究從整體動物模型方面提供了更有力的證據。

IPC具有重要的抗腦缺血神經保護作用。本實驗結果顯示，IPC組腦梗死面積和腦水腫、腦組織含水量均顯著低于I/R組，該結果與前人的發現一致，同時也證明了本實驗模型的可靠性，但自噬在其中是否發揮了作用，目前尚不完全清楚。本研究發現IPC伴有自噬抑制，強烈提示在該過程中IPC可能通過抑制自噬發揮保護作用。Gao等[8]發現自噬誘導劑雷帕霉素可以部分降低IPC的神經保護作用，與上述假設一致。與此相反的是，Sheng等[17]研究發現自噬誘導劑雷帕霉素可以增強IPC的神經保護作用[17]，不僅如此，Qi 等[11]發現肢體遠端預處理可以通過激活自噬減輕線粒體損傷從而發揮減輕腦損傷作用。這些研究提示在IPC過程中自噬發揮了較為復雜的作用，其對疾病的貢獻很可能與缺血程度、復灌水平、個體年齡等多種因素有關[6,18]。例如，有研究發現IPC調節自噬活性具有明顯的時間依賴性，再灌注的第1個小時內自噬即活性，再灌注2～6 h自噬水平持續增高，但自再灌注12～24 h開始自噬水平則逐漸下降[19]。因此，自噬在IPC中的作用仍需進一步實驗探索。

綜上所述，本研究通過大鼠在體腦缺血再灌注模型，發現IPC可通過抑制自噬而減輕腦缺血再灌注損傷，其具體機制可能與激活mTOR有關。

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(責任編輯： 陳妙玲， 余小慧)

Inhibitoryeffectofischemicpostconditioningonautophagyinducedbyfocalcerebralischemiareperfusioninrats

TAO Hong-miao1, SHAN Xiao-yun2, LI Xu-sheng1, CHEN Hao-hao1, MAO Yu-fei1, HE Zhong-ping3

(1JinhuaPolytechnic,2JinhuaCentralHospital,3JinhuaFoodandDrugInspectionInstitute,Jinhua321000,China.E-mail:thm761023@163.com)

AIM: To investigate the effect of ischemic postconditioning (IPC) on autophagy induced by focal cerebral ischemia reperfusion (I/R) in rats.METHODSHealthy male SD rats were assigned randomly into sham-operation (sham) group, I/R group and IPC group with 10 rats in each group. The rats in sham group were only exposed the right common， internal and external carotid artery surgically. The rats in I/R group were subjected to right middle cerebral artery occlusion (MCAO) by the modified Longa suture method for 2 h followed by 24 h of reperfusion. The rats in IPC group were subjected to MCAO for 2 h followed by reperfusion of the ipsilateral common carotid artery occlusion for 10 s for 5 episodes， and then reperfusion for 24 h. Autophagy was obeserved by transmission electron microscopy (TEM). The protein levels of mammalian target of rapamycin (mTOR), p-mTOR and microtubule associated protein light chain 3 (LC3)- II in brain tissue of the rats were determined by Western blot. Pathological changes of brain tissue were observed by HE staining.RESULTSThe protein levels of mTOR and p-mTOR in IPC group were significantly higher than those in I/R group (P<0.05). The expression of LC3-II in IPC group was significantly lower than that in I/R group (P<0.01). The cerebral infarction area and brain water content in IPC group were significantly lower than those in I/R group (P<0.01). HE staining showed that neurons degeneration and necrosis in IPC group were significantly alleviated compared with I/R group. TEM observation showed that IPC revealed fewer autophagosomes, with much less severe cell damage than that in I/R group.CONCLUSIONIPC reduces brain ischemia reperfusion damage by decreasing autophagy of brain cells, which might be related to the activation of mTOR.

Brain; Ischemic reperfusion injury; Ischemic postconditioning; Autophagy; Mammalian target of rapamycin

R736； R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.10.027

1000- 4718(2017)10- 1896- 06

2017- 04- 05

2017- 07- 11

浙江省科技廳公益技術應用研究計劃項目(No. 2015C37118)；金華市科技局社會發展類項目(No. 2015-3-057)

△通訊作者 Tel: 0579-82232590; E-mail: thm761023@163.com

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