左歸降糖解郁方對模擬糖尿病并發抑郁癥環境下模型大鼠海馬神經元凋亡相關蛋白的影響

凌佳++楊琴++劉檢++王宇紅++徐雅嵐++韓遠山++楊蕙++孟盼

摘要：目的 探討左歸降糖解郁方對模擬糖尿病并發抑郁癥（DD）環境下海馬神經元凋亡相關蛋白Bcl-2、Bax及Caspase-8的調控作用。方法 采用受孕18 d SD大鼠胎鼠進行海馬神經元原代培養，葡萄糖聯合皮質酮干預構建DD模擬環境。將培養的海馬神經元隨機分為正常組、空白血清組、模型組、陽性藥（二甲雙胍+氟西汀）藥物血清組和待測藥（左歸降糖解郁方）藥物血清組，正常組和模型組給予等量培養液，其余組給予相應體積分數10%藥物血清或空白血清，造模干預18 h后，Hoechst熒光染色檢測海馬神經元凋亡；高內涵分析技術檢測凋亡相關蛋白Bcl-2、Bax和Caspase-8的表達。結果 與正常組比較，模型組大鼠海馬神經元樹突斷裂或減少，神經網絡連接降低，細胞存在明顯的濃染、破碎、光點分布不均現象，Bcl-2蛋白表達顯著下降（P<0.05），Bax和Caspase-8蛋白表達明顯升高（P<0.05，P<0.01）；與模型組比較，陽性藥藥物血清組和待測藥藥物血清組大鼠海馬神經元網絡連接顯著恢復，Hoechst熒光染色可見細胞核明顯均勻化，局部亮點明顯減少，Bcl-2蛋白表達水平顯著上調（P<0.05，P<0.01），Bax和Caspase-8蛋白表達水平顯著下調（P<0.05，P<0.01）。結論 左歸降糖解郁方對模型大鼠海馬神經元凋亡的保護作用可能與調控海馬神經元Bcl-2，Bax和Caspase-8的表達有關。

關鍵詞：左歸降糖解郁方；糖尿病并發抑郁癥；海馬神經元；Bcl-2；Bax；Caspase-8；大鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.10.009

中圖分類號：R285.5 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2017）10-0035-05

Effects of Zuogui Jiangtang Jieyu Formula on Hippocampus Neuron Apoptosis Related Proteins under Diabetes Mellitus with Depression States LING Jia1， YANG Qin2， LIU Jian2， WANG Yu-hong1，2， XU Ya-lan3， HAN Yuan-shan2， YANG Hui2， MENG Pan1 （1. Training Bases， Hunan Key Laboratory of Chinese Materia Medica Powder and Innovative Drugs Established by Provincial and Ministry， Changsha 410208， China； 2. First Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha 410007， China； 3. Changde Vocational Technical College， Changde 415003， China）

Abstract： Objective To investigate the regulating effects of Zuogui Jiangtang Jieyu Formula （ZJJF） on Bcl-2， Bax and Caspase-8 in hippocampus neuron damage in diabetes mellitus with depression （DD）. Methods Hippocampal neurons from 18 d pregnant rats were primitively cultivated， and then combination of glucose and corticosterone was used to construct DD simulation environment. Cultivated hippocampal neurons were randomly divided into normal group， blank serum group， model group， positive medicine （metformin+fluoxetine） serum group and to-be-tested medicine （ZJJF） serum group. Normal group and model group were given same amount culture medium， while other group were given relevant amont of 10% medicine serum or blank serum. After modeling intervention for 18 h，

基金項目：國家自然科學基金（81373578、81573965、81403379、81403387）

通訊作者：王宇紅，E-mail：573643177@qq.com

Hoechst staining was used to detect the apoptosis of hippocampal neurons. The expression of Bcl-2， Bax and Caspase-8 was detected by high content analysis. Results Compared with the control group， hippocampal neuron dendrites ruptured or decreased， neural network connection decreased， cells showed significant staining， broken， uneven distribution of light spots， the expression of Bcl-2 protein decreased significantly （P<0.05）， but Bax and Caspase-8 were increased （P<0.05， P<0.01）. Compared with the model group， hippocampal neurons in both positive medicine serum group and ZJJF serum group gradually recovered. Hoechst staining showed that the nuclei were significantly homogenized， local highlights were significantly reduced， Bcl-2 protein expression levels were significantly increased （P<0.05， P<0.01）， while Bax and Caspase-8 were obviously down-regulated （P<0.05， P<0.01）. Conclusion ZJJF has protective effects on hippocampal neurons in DD of model rats， and its mechanism is related to regulating the expression of Bcl-2， Bax and Caspase-8 in hippocampus neuron.endprint

Key words： Zuogui Jiangtang Jieyu Formula； diabetes mellitus with depression； hippocampal neurons； Bcl-2； Bax； Caspase-8； rats

糖尿病并發抑郁癥（diabetes mellitus with depression，DD）主要表現特征即為認知功能障礙。據相關研究表明，40%～50%糖尿病患者存在不同程度的抑郁癥狀[1-2]，DD是糖尿病最嚴重的并發癥之一，其死亡率明顯高于單純糖尿病患者[3]。本課題組前期研究表明，DD大鼠海馬組織體積顯著減少，椎體細胞中存在不同程度的胞體深染和空泡變性，其中海馬神經元凋亡則是海馬發生損傷的主要原因[4-5]。因此，本研究擬從體外角度輔以高內涵分析技術（HCA），檢測大鼠模擬DD環境下海馬神經元內Bcl-2、Bax和Caspase-8等凋亡相關蛋白的表達，并初步探討左歸降糖解郁方對海馬神經元的保護作用。

1 實驗材料

1.1 動物

SPF級SD雌性大鼠（受孕18 d）3只，體質量350～450 g，SPF級SD雄性大鼠9只，體質量200～220 g，湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，動物許可證號SCXK（湘）2013-0004。其中雌性大鼠直接用于海馬神經元原代取材，雄性大鼠飼養于湖南中醫藥大學第一附屬醫院SPF級實驗動物中心。

1.2 藥物

左歸降糖解郁方（黃芪、熟地黃、枸杞子、山萸肉、丹參、姜黃、菟絲子、杜仲、牛膝、牡丹皮、貫葉連翹），飲片均購自湖南中醫藥大學第一附屬醫院，并由該院制劑科按一定比例水煎濃縮后制成口服液；鹽酸二甲雙胍片，湖南湘雅制藥有限公司，批號1402115；鹽酸氟西汀膠囊，法國Patheon，批號2087A。

1.3 主要試劑與儀器

皮質酮、L-多聚賴氨酸、DMSO（美國Sigma），胰蛋白酶、Ⅰ型膠原酶（美國Amresco），D-葡萄糖、DMEM/F12、胎牛血清（美國Hyclone），Neurobassal神經元基礎培養基、B27添加劑、Glutamax（美國Gibco），多聚甲醛（中國科密歐），兔抗烯醇化酶多克隆抗體（（NSE，中國Bioworld），Hoechst 33258（中國Beyotime），兔抗Bcl-2單克隆抗體、兔抗Bax單克隆抗體、兔抗Caspase-8單克隆抗體、小鼠抗β-tublin多克隆抗體（美國Proyeintech），DAPI、FITC標記羊抗兔IgG、R-PE標記羊抗小鼠IgG（英國Abcam）。CO48R-230型三氣細胞培養箱（NEW BRUNSWICK GALAXY），OPERETTA型高內涵成像分析系統（PerkinElmer），S8PAO型體視顯微鏡（LEICA）。

2 實驗方法

2.1 海馬神經元原代培養及鑒定

將受孕18 d SD大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉，取胎鼠全腦，解剖鏡下夾取海馬，并剝凈殘余腦膜及血管，剪碎后加1∶1的胰蛋白酶和Ⅰ型膠原酶消化、離心、重懸、計數，接種于預先包被L-多聚賴氨酸的96孔細胞培養板中（6×104/孔），置于培養箱中4 h后全量換成維持液（Neurobassal神經元基礎培養基∶B27添加劑∶Glutamax∶雙抗=96∶2∶1∶1），第3日半量更換維持液。待神經元生長至第5日，用預冷PBS洗3次×5 min，4%多聚甲醛室溫固定30 min，清洗后加0.25%Triton X-100溶液作用15 min，再加5%BSA封閉30 min，清洗，滴加兔NSE和小鼠抗大鼠β-tublin相關抗原抗體（1∶100），4 ℃濕盒過夜，清洗，加FITC標記的二抗，37 ℃孵育1 h，清洗，加細胞核染色劑DAPI室溫孵育20 min，清洗，最后每孔加入50 μL PBS，用HCA系統觀察分析。

2.2 藥物血清制備

將SPF級雄性SD大鼠隨機分為待測藥藥物血清組、陽性藥藥物血清組和空白血清組，每組3只。根據前期動物實驗[6]，分別對應給予臨床有效3倍量的左歸降糖解郁方（32.8 g/kg）、氟西汀+二甲雙胍（1.8 mg/kg，0.18 g/kg）、蒸餾水，2次/d，連續3 d。末次給藥后，無菌條件下腹主動脈取血并暫存于促凝管中，靜置2 h后，3000 r/min離心15 min，吸取上清液，56 ℃水浴30 min滅活，0.22 μm濾膜過濾，分裝后于-80 ℃超低溫冰箱存放備用。

2.3 造模、分組和給藥

待神經元生長至5～7 d，參照文獻方法[7-8]加入高糖（150 mmol/L）和皮質酮（200 μmol/L），干預18 h，構建模擬DD損傷環境的海馬神經元體外模型。將培養的海馬神經元隨機分為正常組、空白血清組、模型組、陽性藥藥物血清組和待測藥藥物血清組，并分別加入相應體積分數10%的藥物血清及空白血清，正常組和模型組則給予等量培養液。

2.4 Hoechst熒光染色檢測海馬神經元凋亡

上述各組神經元經造模和干預18 h后，棄原有上清液，用預冷PBS清洗2 min×3次，再經4%多聚甲醛固定30 min，0.25%TritonX-100作用15 min，每孔加100 μL Hoechst 33258室溫避光環境孵育20 min。以上各操作之間均用預冷PBS清洗5 min×3次，最終向每孔內加50 μL PBS以維持觀察環境，采用HCA法進行檢測。

2.5 高內涵分析技術檢測海馬神經元凋亡相關蛋白Bcl-2、Bax和Caspase-8的表達

神經元經造模和干預18 h后，固定、打孔，每孔加5%BSA封閉30 min，加一抗稀釋液孵育1 h，加FITC或RP-E標記的二抗稀釋液孵育30 min，加核染劑DAPI稀釋液孵育20 min，孵育過程均室溫避光進行。最終向每孔補加PBS維持觀察環境，上機檢測。endprint

3 統計學方法

采用SPSS17.0統計軟件進行分析。實驗數據以—x±s表示，當數據滿足正態性且組間方差齊時，采用方差分析；如不滿足上述條件，則采用非參數檢驗法。P<0.05表示差異有統計學意義。

4 結果

4.1 海馬原代神經元的一般形態學觀察及鑒定

培養5～7 d后，倒置顯微鏡下直接觀察發現，海馬神經元胞體圓潤透亮，光澤度及折光性好，突起縱橫交錯，細小分支眾多，相互連接形成均勻的神經元網絡。NSE是神經元胞漿內的一種可溶性酸性蛋白，為神經元的特異性標志物。HCA檢測發現，經神經元特異性標志物NSE染色后，可見綠色熒光在胞漿中呈陽性表達，隨機選取10個視野，計算其呈陽性細胞數量占總細胞數的比例，結果表明陽性細胞率達95%以上，見圖1。

4.2 左歸降糖解郁方對模型大鼠海馬神經元凋亡的影響

從HCA結果可知，隨機選取10個視野，正常組、空白血清組、模型組、陽性藥藥物血清組和待測藥藥物血清組中呈凋亡狀態細胞比例分別為12.6%、15.1%、54.9%、35.1%和41.7%，其中正常組細胞發出的藍色熒光分布均勻，光團完整均一，無明顯凋亡特征；相比之下，模型組細胞光團分散，熒光分布不均，呈顆粒狀分布，局部出現濃染，提示模型組神經元出現大量凋亡；經陽性藥或待測藥藥物血清作用后，熒光分布均勻化，顆粒狀光點明顯減少。結果見圖2。

4.3 左歸降糖解郁方對模型大鼠海馬神經元凋亡相關蛋白表達的影響

HCA檢測結果顯示，與正常組及空白血清組比較，模型組大鼠海馬神經元之間樹突斷裂或減少，網絡連接明顯減少，神經元內Bcl-2蛋白平均熒光強度顯著降低（P<0.05），而蛋白Bax和Caspase-8的對應熒光強度明顯升高（P<0.05，P<0.01）；與模型組比較，待測藥藥物血清組和陽性藥藥物血清組樹突連接及神經網絡斷裂情況得到明顯修復，大鼠神經元Bcl-2蛋白平均熒光強度明顯升高（P<0.05，P<0.01），Bax平均熒光強度降低，Caspase-8蛋白平均熒光強度明顯降低（P<0.01），熒光強度與對應蛋白表達水平呈正相關。結果見圖3～圖5。

5 討論

HCA是一種新型篩選技術，可在保證細胞完整的前提下，借助高分辨率熒光數碼成像系統對待測樣品的形態變化和生物分子表達進行檢測，其主要特點是可通過單次檢測獲取大量靶點數據以實現高通量篩選，目前主要應用于藥物初篩、作用靶點研究及安全性評價等方面[9]。HCA以熒光標記的待測細胞為主要模型，通過觀察受試細胞中綠色熒光蛋白-靶點（標志性信號分子）融合蛋白的表達和轉位變化，從而分析受試分子對特定靶點或通路的影響[10]。本研究采用DAPI標記細胞核以實現細胞定位，采用RP-E標記細胞骨架β-actin蛋白（橙黃色熒光）以觀察神經元的網絡變化，采用FITC標記其他目標靶蛋白（綠色熒光）以檢測各靶蛋白在各干預條件下的表達趨勢。

海馬組織是DD發生的關鍵靶器官，其神經元受損是其主要表現之一。研究發現，慢性應激可引起2型糖尿病大鼠下丘腦-垂體-腎上腺軸紊亂，海馬、下丘腦、垂體和腎上腺等器官的形態結構出現不同程度的器質性病變，表現為海馬椎體細胞中存在不同程度的胞體深染和空泡變性，表明DD狀態下海馬神經元存在凋亡現象[11-12]，然而其內在的分子機制并未得到深入探究。本實驗通過采用高糖聯合皮質酮復制DD體外模型，Hoechst 33258染色結果表明，DD的發生可引起大鼠海馬神經元凋亡。細胞凋亡的發生需要啟動細胞內多種基因調控和蛋白表達，其中Bcl-2家族與Caspase家族相關蛋白及基因是主要參與因子。Bcl-2家族中成員眾多，主要包括抗凋亡基因Bcl-2和促凋亡基因Bax，在細胞凋亡的調控中發揮重要調節作用。Bcl-2蛋白是Bcl-2基因的編碼產物，屬于一種抗凋亡蛋白，主要存在于線粒體和內質網上，通過穩定線粒體膜防止線粒體內促凋亡相關蛋白泄漏，同時可阻斷Ca2+從內質網中釋放，使依賴Ca2+的核酸內切酶活性降低等途徑阻斷細胞凋亡；而Bax蛋白是Bcl-2的同源水溶性相關蛋白，主要分布在胞質中，其功能與Bcl-2相反，可通過與Bcl-2形成異源二聚體而拮抗Bcl-2的保護效應，屬于一種促凋亡蛋白。因此，Bcl-2/Bax是衡量細胞是否會發生凋亡的重要指標。Caspase是凋亡過程中的公認主要相關基因，其中Caspase-8是Caspase級聯反應的核心啟動因子，其激活后可激活所有凋亡級聯反應下游的Caspase，從而誘導細胞凋亡反應的發生，其編碼產物屬于凋亡相關蛋白。

本項研究顯示，陽性藥和待測藥藥物血清組均可明顯抑制海馬神經元凋亡，促進神經網絡連接恢復；經高糖聯合皮質酮處理后，抗凋亡相關蛋白Bcl-2的平均熒光強度明顯減弱，促凋亡相關蛋白Bax與Caspase-8的平均熒光強度明顯增強，即Bcl-2呈低表達，Bax與Caspase-8呈高表達，經左歸降糖解郁方藥物血清干預后，Bcl-2表達明顯升高，Bax與Caspase-8的表達均呈下降趨勢。提示左歸降糖解郁方可能通過調控Bcl-2、Bax與Caspase-8的表達，對抗高糖與皮質酮的聯合損傷作用，使海馬神經元的凋亡現象被顯著改善。課題組前期體內實驗研究也發現，DD模型大鼠的空間學習記憶功能受到嚴重損傷，JNK、Bax蛋白及基因表達明顯上升，Bcl-2表達下降，最終導致海馬損傷、學習記憶功能障礙和抑郁發生，而左歸降糖解郁方可通過抑制JNK表達，調節Bcl與Bax之間的平衡關系而抑制海馬神經元凋亡[6]，這提示體內與體外實驗結果相對一致，同時亦佐證了左歸降糖解郁方對學習記憶、神經元凋亡的調控作用。

綜上所述，左歸降糖解郁方可改善DD的海馬功能，其可通過線粒體Bax/Bcl-2/Caspase-8途徑減少海馬神經元的凋亡而發揮作用，通過有效調控神經元凋亡相關蛋白可能是左歸降糖解郁方治療DD的重要機制之一，但其抗細胞凋亡的具體機制仍有待進一步研究。endprint

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（收稿日期：2017-01-13）

（修回日期：2017-02-05；編輯：華強）endprint