TESTIN在鼻咽癌中的表達及對鼻咽癌細胞系增殖、上皮-間質轉化和侵襲轉移的影響

劉新彥 李建斌 李志強 王麗坤 路繼成 李曉麗 劉曉燕

·論著·

doi:10.3969/j.issn.1002-7386.2017.21.001

TESTIN在鼻咽癌中的表達及對鼻咽癌細胞系增殖、上皮-間質轉化和侵襲轉移的影響

劉新彥 李建斌 李志強 王麗坤 路繼成 李曉麗 劉曉燕

目的觀察TESTIN在鼻咽癌組織和細胞中的表達，分析TESTIN過表達對鼻咽癌細胞增殖、上皮-間質轉化(EMT)和侵襲轉移的影響。方法采用免疫組化、Real time-PCR、Western-blot檢測TESTIN在鼻咽癌組織和細胞系的表達狀況。利用脂質體LipofectamineTM2000轉染鼻咽癌5-8F細胞，Real time-PCR、Western-blot驗證轉染效率。MTT、細胞劃痕實驗、細胞侵襲實驗檢測TESTIN過表達對5-8F細胞增殖、EMT和侵襲轉移的影響。Western-blot檢測TESTIN過表達對侵襲轉移相關基因表達的影響。結果TESTIN在鼻咽癌組織的陽性表達率和表達水平明顯低于正常鼻咽部組織，差異有統計學意義(P<0.05)。與人正常永生化鼻咽上皮細胞系NP69比較，鼻咽癌細胞系CNE1、CNE2、C666-1、5-8F、6-10B中TESTIN表達水平顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05)。轉染pcDNA3.1/TESTIN的5-8F細胞中TESTIN表達顯著上調(P<0.05)。TESTIN過表達顯著抑制5-8F細胞增殖、EMT和侵襲轉移，同時上調E-cadherin表達，下調N-cadherin、Vimentin、MMP-2、MMP-9表達(P<0.05)。結論鼻咽癌組織和細胞系中TESTIN表達顯著降低，TESTIN過表達可抑制鼻咽癌5-8F細胞增殖、EMT和侵襲轉移。

TESTIN；鼻咽癌；增殖；上皮-間質轉化；侵襲轉移

鼻咽癌是我國常見的頭頸部惡性腫瘤，約占全部頭頸部腫瘤的78%，具有起病隱匿、惡性度高、易轉移和復發等特點[1-3]。目前，放化療是治療鼻咽癌的主要手段，但其對晚期已經出現復發和轉移的患者療效不佳，患者5年生存率不足60%，預后較差[4,5]。研究發現，上皮-間質轉化(epithelial mesenchymal transition，EMT)與腫瘤細胞侵襲轉移密切相關，這是導致治療失敗的重要原因[6,7]。TESTIN基因定位于人染色體7q31.2，在正常組織大量表達，而在胃癌、乳腺癌、結直腸癌等惡性腫瘤組織和細胞系中幾乎不表達或少量表達[8-10]。因此，TESTIN被認為是一個潛在的抑癌基因。然而，TESTIN在鼻咽癌細胞增殖、EMT和侵襲轉移過程中的作用目前研究尚少。本研究觀察TESTIN在鼻咽癌組織和5種細胞系的表達狀況；采用pcDNA3.1/TESTIN轉染鼻咽癌5-8F細胞，觀察TESTIN過表達對5-8F細胞增殖、ETM及侵襲轉移的影響，以期為以TESTIN為靶點探索鼻咽癌診斷和治療的新方法提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集河北北方學院附屬第二醫院耳鼻咽喉頭頸外科2013年2月至2016年5月鼻咽癌活檢組織標本48例，均經病理確診，未經任何放、化療等抗癌治療。其中男39例，女9例；年齡42～70歲，平均年齡(58.42±7.53)歲；高分化癌5例，中分化癌8例，低分化癌22例，未分化13例；出現淋巴結轉移36例，未出現淋巴結轉移12例。選取同期正常鼻咽部組織標本24例作為對照組。

1.2 試劑 人正常永生化鼻咽上皮細胞系NP69、鼻咽癌細胞系CNE1、CNE2、C666-1、5-8F、6-10B購自中科院典型培養物寶藏委員會細胞庫；鼠抗人TESTIN多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司；Trizol、LipofectamineTM2000轉染試劑盒、RPMI 1640培養基購自美國Invitrogen公司；Real time-PCR試劑盒購自美國Promega公司；免疫組化試劑盒購自上海碧云天生物技術研究所。

1.3 實驗方法

1.3.1 免疫組化:采用免疫組織化學SP法檢測鼻咽癌組織及正常鼻咽部組織中TESTIN表達，以PBS代替一抗作為陰性對照，嚴格按照免疫組化試劑盒說明書操作。

1.3.2 細胞培養及轉染:將人正常永生化鼻咽上皮細胞系NP69、鼻咽癌細胞系CNE1、CNE2、C666-1、5-8F、6-10B置于含胎牛血清和RPMI1640培養基中，于37℃、5% CO2條件下常規培養。當細胞融合達80%～90%時，胰酶消化細胞，以2×105/孔的密度接種于12孔板，利用脂質體LipofectamineTM2000轉染 5-8F細胞。細胞分3組：未處理組(正常5-8F細胞)、陰性對照組(轉染空載體pcDNA3.1)、轉染組(轉染pcDNA3.1/TESTIN)。

1.3.3 Real time-PCR:按照Trizol試劑盒說明書提取鼻咽癌組織和對數生長期細胞總RNA，在ABI 7300熒光定量PCR儀上進行擴增，引物由上海生工生物工程有限公司合成。以β-actin為內參照基因，2-△△Ct法計算TESTIN基因相對表達水平。見表1。

表1 引物序列及擴增產物長度

1.3.4 Western-blot:采用RIPA裂解液提取對數生長期細胞總蛋白，BCA法定量蛋白。取20 μg蛋白經SDS-PAGE分離后電轉移至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，加入鼠抗人TESTIN多克隆抗體，4℃孵育過夜。PBS洗膜3次，加入辣根過氧化物酶標記的兔抗鼠二抗，室溫孵育1 h。PBS洗膜3次，以β-actin為內參照基因，ECL化學發光法檢測TESTIN蛋白相對表達水平。

1.3.5 MTT實驗:取對數生長期細胞接種于96孔板，調整細胞密度為5×103/孔，分別于第1、2、3、4、5天收集細胞，加入20 μl MTT溶液，4 h后棄去培養基加入150 μl DMSO，酶標儀490 nm波長處測定吸光度值(OD490)。

1.3.6 細胞劃痕實驗:取對數生長期細胞胰酶消化后以5×103/孔的密度接種于6孔板，用10 μl槍頭做一垂直劃痕，PBS洗3次。置于含1.5%胎牛血清的培養基中培養24 h，顯微鏡下觀察并拍照。采用Image Pro Plus軟件測量細胞遷移距離，重復3次，取均值。

1.3.7 細胞侵襲實驗:將100 μl Matrigel膠鋪于Transwell小室，取對數生長期細胞用無血清培養基制成細胞懸液，調整細胞密度為1×106/ml，吸取0.2 ml細胞懸液加入Transwell小室的上室，將0.5 ml含10%胎牛血清的培養基加入Transwell小室的下室。培養24 h 后，取出小室，PBS清洗，用棉簽蘸去濾膜上層未穿過的細胞和Matrigel膠，多聚甲醛固定細胞并染色，隨機選取6個視野，200倍高倍鏡下觀察并記錄穿膜細胞數，重復3次，取均值。

2 結果

2.1 TESTIN在對照組和鼻咽癌組的表達比較 免疫組化結果顯示，TESTIN陽性表達主要表現為細胞質染成棕黃色或棕褐色。對照組、鼻咽癌組TESTIN陽性表達率分別為91.67%(22/24)、33.33%(16/48)，鼻咽癌組TESTIN陽性表達率明顯低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。Real time-PCR結果顯示，對照組、鼻咽癌組TESTIN mRNA表達分別為(1.12±0.18)、(0.35±0.06)，鼻咽癌組TESTIN mRNA表達明顯低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 TESTIN在對照組和鼻咽癌組的表達比較

注：與對照組比較,*P<0.05

2.2 TESTIN在NP69和5種鼻咽癌細胞系的表達比較 Real time-PCR和Western-blot結果顯示，5種鼻咽癌細胞系CNE1、CNE2、C666-1、5-8F、6-10B中TESTIN mRNA和蛋白表達明顯低于NP69細胞，差異有統計學意義(P<0.05)，且在5-8F細胞系中表達最低。見表3。

2.3 TESTIN過表達的鼻咽癌5-8F細胞的鑒定 Real time-PCR和Western-blot結果顯示，鼻咽癌5-8F細胞中TESTIN mRNA和蛋白表達明顯高于未處理組和陰性對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，未處理組和陰性對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表4。

表3 TESTIN在NP69和5種鼻咽癌細胞系的表達比較

類別TESTINmRNATESTIN蛋白NP698．90±0．677．97±0．58CNE12．15±0．17?2．00±0．15?CNE22．63±0．35?2．35±0．32?5?8F 1．37±0．13?1．01±0．10?C666?12．04±0．19?1．67±0．12?6?10B1．92±0．23?1．54±0．21?

注：與NP69細胞比較,*P<0.05

表4 TESTIN過表達的鼻咽癌5-8F細胞的鑒定

組別TESTINmRNATESTIN蛋白未處理組 1．37±0．131．01±0．10陰性對照組1．39±0．15?1．04±0．12?轉染組 5．41±0．89?#5．23±0．80?#

注：與未處理組比較,*P<0.05；與陰性對照組比較，#P<0.05

2.4 TESTIN過表達對鼻咽癌5-8F細胞增殖的影響 MTT實驗結果顯示，轉染組5-8F細胞生長速度明顯低于未處理組和陰性對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，未處理組和陰性對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表5。

表5 TESTIN過表達對鼻咽癌5-8F細胞增殖能力的影響

組別OD4901d2d3d4d5d未處理組 0．04±0．010．12±0．020．24±0．040．39±0．040．60±0．09陰性對照組0．03±0．010．11±0．01?0．25±0．05?0．38±0．05?0．58±0．07?轉染組 0．04±0．010．07±0．01?#0．15±0．03?#0．26±0．04?#0．40±0．06?#

注：與未處理組比較,*P<0.05；與陰性對照組比較，#P<0.05

2.5 TESTIN過表達對鼻咽癌5-8F細胞形態的影響 在相差倒置熒光顯微鏡下觀察鼻咽癌5-8F細胞形態變化，未處理組和陰性對照組的5-8F細胞大多呈長梭形的間質細胞形態，細胞間緊密連接疏松；而轉染組5-8F細胞恢復成鵝卵石狀上皮細胞形態，提示過表達能夠逆轉5-8F細胞EMT。

2.6 TESTIN過表達對鼻咽癌5-8F細胞遷移能力的影響 細胞劃痕實驗結果顯示，轉染組5-8F細胞遷移距離明顯小于未處理組和陰性對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，未處理組和陰性對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表6。

表6 TESTIN過表達對鼻咽癌5-8F細胞遷移能力的影響

組別遷移距離未處理組 17．25±2．56陰性對照組16．81±2．55?轉染組 5．12±0．35?#

注：與未處理組比較,*P<0.05；與陰性對照組比較，#P<0.05

2.7 TESTIN過表達對鼻咽癌5-8F細胞侵襲能力的影響 細胞侵襲實驗結果顯示，轉染組5-8F細胞穿過Matrigel膠的細胞數明顯少于未處理組和陰性對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，未處理組和陰性對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表7。

表7 TESTIN過表達對鼻咽癌5-8F細胞侵襲能力的影響 n=8，個

注：與未處理組比較,*P<0.05；與陰性對照組比較，#P<0.05

2.8 TESTIN過表達對鼻咽癌5-8F細胞EMT、侵襲轉移相關基因表達的影響 Western-blot結果顯示，轉染組E-cadherin蛋白表達水平明顯高于未處理組和陰性對照組，N-cadherin、Vimentin、MMP-2、MMP-9蛋白表達水平明顯低于未處理組和陰性對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，未處理組和陰性對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表8。

3 討論

據統計，我國鼻咽癌發病率位居世界首位，該病主要好發于我國南方和東南亞地區，男性發病率高于女性，患者病死率高，預后極極差[11,12]。然而，臨床診斷和治療鼻咽癌仍缺乏有效手段。鼻咽癌發生發展是涉及多個基因、多種因素的復雜過程，其中癌基因和抑癌基因表達失衡是導致惡性腫瘤發生的重要機制。目前普遍認為抑癌基因表達下調或缺失在惡性腫瘤發生發展中可能發揮了較癌基因激活更為重要的作用。

表8 TESTIN過表達對鼻咽癌5-8F細胞EMT、侵襲轉移相關基因表達的影響

組別E?cadherin蛋白N?cadherin蛋白Vimentin蛋白MMP?2蛋白MMP?9蛋白未處理組 0．37±0．051．15±0．161．23±0．201．11±0．181．20±0．16陰性對照組0．39±0．06?1．12±0．14?1．20±0．15?1．08±0．14?1．17±0．13?轉染組 1．08±0．15?#0．39±0．06?#0．35±0．04?#0．29±0．04?#0．23±0．03?#

注：與未處理組比較,*P<0.05；與陰性對照組比較，#P<0.05

人類TESTIN基因是Tatarelli等[13]于2000年首先發現和鑒定的癌癥相關基因。TESTIN被發現以來，越來越多的研究表明其在多種惡性腫瘤組織表達缺失，并且與腫瘤發生及侵襲轉移有關。Zhu等[14]通過體內外實驗發現TESTIN在乳腺癌組織表達下調，而乳腺癌T47D細胞轉染TESTIN基因后致瘤性明顯下降，提示TESTIN可能作為抑癌基因在惡性腫瘤發生發展中發揮重要作用。然而，有關TESTIN在鼻咽癌中的作用目前研究尚少。

本研究首先采用免疫組化和Real time-PCR法觀察TESTIN在鼻咽癌組織的表達狀況，結果發現鼻咽癌組織TESTIN陽性表達率和表達水平均明顯低于正常鼻咽部組織(P<0.05)，提示TESTIN可能與鼻咽癌發生及進展有關，TESTIN有可能成為治療鼻咽癌的潛在靶點。為明確TESTIN的生物學功能及與鼻咽癌發生發展的關系，我們采用Real time-PCR和Western-blot法檢測了鼻咽癌細胞系中TESTIN的表達狀況，初步發現TESTIN在5種不同轉移潛能鼻咽癌細胞中表達均顯著下調，且在高轉移性5-8F細胞系中表達水平最低。因此，我們推測TESTIN可能是調控鼻咽癌細胞轉移的重要分子靶點。后續實驗我們進一步采用基因轉染技術上調TESTIN在鼻咽癌5-8F細胞的表達水平，通過MTT、細胞劃痕實驗、細胞侵襲實驗觀察TESTIN過表達對5-8F細胞增殖、EMT及侵襲轉移的影響。本結果顯示，TESTIN過表達顯著抑制5-8F細胞增殖、EMT和侵襲轉移，同時上調E-cadherin表達，下調N-cadherin、Vimentin、MMP-2、MMP-9表達(P<0.05)，說明TESTIN參與了鼻咽癌細胞的侵襲轉移過程，這與李戍軍等[15]報道一致。

綜上所述，鼻咽癌組織和細胞系中TESTIN表達顯著下調，可能發揮抑癌基因作用，上調TESTIN表達能夠明顯抑制鼻咽癌5-8F細胞增殖、EMT及侵襲轉移過程。TESTIN有可能成為治療鼻咽癌的潛在分子靶點。

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ExpressionofTESTINinnasopharyngealcarcinomaanditseffectsontheproliferation,epithelial-mesenchymaltransition,invasionandmetastasisofnasopharyngealcarcinomacelllineinvitro

LIUXinyan*,LIJianbin,LIZhiqiang,etal.

*DepartmentofEarNoseThroatNeckSurgery,TheSecondHospitalAffiliatedtoHebeiNorthCollege,Hebei,Zhangjiakou075100,China

ObjectiveTo observe the expression of TESTIN in nasopharyngeal carcinoma (NPC),and to explore the effects of TESTIN overexpression on the proliferation,epithelial-mesenchymal transition (EMT),invasion and metastasis of nasopharyngeal carcinoma cell line in vitro.MethodsThe expressions of TESTIN in NPC tissue specimens and nasopharyngeal carcinoma cell line were detected by immunohistochemical assay,Real time-PCR,Western-Blot,respectively.After transient transfection of TESTIN into NPC cell line 5-8F by means of lipofectamine TM 2000,the expression of TESTIN was detected by Real time-PCR and Western-Blot.The effects of TESTIN overexpression on the proliferation,EMT,invasion and metastasis of nasopharyngeal carcinoma cells were detected by MTT,cell scratching assay and cell invasion assay, respectively.Moreover the effects of TESTIN overexpression on the expression of genes related with invasion and metastasis were detected by Western-Blot.ResultsThe expression levels of TESTIN in NPC tissues were significantly lower than those in normal nasopharyngeal tissues (P<0.05).The expression levels of TESTIN in NPC cell line-CNE1, CNE2,C666-1,5-8F and 6-10B were significantly decreased,as compared with those in human normal immortalized nasopharyngeal epithelial cell line NP69 (P<0.05).However,the expression levels of TESTIN in 5-8F cells transfected by pcDNA3.1/TESTIN were significantly increased (P<0.05).The overexpression of TESTIN obviously inhibited the proliferation, EMT, invasion and metastasis of 5-8F cells,at the same time, which up-regulated the expressions of E-cadherin, however, which down-regulated the expressions of N-cadherin,Vimentin,MMP-2 and MMP-9 (P<0.05).ConclusionThe expression levels of TESTIN are significantly decreased in human NPC tissue and cell lines,moreover, TESTIN overexpression can inhibit the proliferation,EMT,invasion and metastasis of 5-8F cells.

TESTIN; nasopharyngeal carcinoma; proliferation;epithelial-mesenchymal transition;invasion and metastasis

R 766.3

A

1002-7386(2017)21-3205-04

2017-04-11)

項目來源:河北省醫學科學研究重點課題計劃項目(編號：20170181)

075100 河北省張家口市，河北北方學院附屬第二醫院耳鼻咽喉頭頸外科(劉新彥、王麗坤、李曉麗、劉曉燕)，病理科(李志強)；中國石油天然氣集團公司中心醫院耳鼻咽喉科(李建斌)；河北省張家口市宣化區人民醫院檢驗科(路繼成)