Box-Behnken Design-響應面法優化綠原酸轉化為新綠原酸的工藝研究＊

溫建輝，倪付勇，王雪晶，李 明，宋亞玲，王振中，蕭 偉

（江蘇康緣藥業股份有限公司 連云港 222000）

Box-Behnken Design-響應面法優化綠原酸轉化為新綠原酸的工藝研究＊

溫建輝，倪付勇，王雪晶，李 明，宋亞玲，王振中，蕭 偉＊＊

（江蘇康緣藥業股份有限公司 連云港 222000）

利用Box-Behnken-響應面法優化綠原酸轉化為新綠原酸的工藝條件。在單因素實驗基礎上，采用Box-Behnken Design實驗設計，考察反應溫度、反應時間及pH值對新綠原酸產率的影響,優化綠原酸轉化為新綠原酸的工藝參數,得到模型預測公式。優化條件為：反應溫度107℃，反應時間60 min，pH值為4.72時新綠原酸產率為64.20%，與模型預測值接近，方程擬合良好。采用優選工藝制備新綠原酸并精制純化，分別運用HPLC、1H-NMR、13C-NMR、ESI-MS等方法對其進行含量測定和結構表征，結果表明純化后純度達98.78%，收率為87.37%。

綠原酸 新綠原酸 Box-Behnken Design響應面法 結構鑒定

圖2 綠原酸轉化為新綠原酸反應式

1 儀器與材料

1.1 儀器

分析液相：Agilent 1260高效液相色譜儀（美國Agilent公司，250 mm×4.6 mm，5 μm），配自動進樣器、四元泵、MWD檢測器，制備液相：Agilent 1260高效液相色譜儀（美國Agilent公司），四元泵、MWD檢測器,制備柱（美國Agilent公司，21.2 mm×250 mm）；Bruker-AV-400型核磁共振光譜儀；AE240電子分析天平（瑞士Mettler公司），實驗室PH計FE20 Plus（梅特勒-托利多儀器上海有限公司），石英三口燒瓶（廣州市精科儀器有限公司）。

1.2 實驗材料

綠原酸（自制，批號：130809，純度為99.14%），新綠原酸（批號MUST-10091501，純度＞98%，成都曼斯特生物科技有限公司提供），甲醇（色譜純，Oceanpak，瑞典），甲酸、濃鹽酸（分析純，南京化學試劑有限公司），雙蒸水（自制）。

2 新綠原酸的測定方法

2.1 對照品溶液的制備

稱取新綠原酸對照品適量，精密稱定，置棕色容量瓶中，加50%甲醇定容制成新綠原酸濃度為0.2 mg·mL-1的對照品溶液。

2.2 供試品溶液的制備

分別精密稱取以下各工序制備的新綠原酸粗品5.0 mg，置于25 mL容量瓶中，用50%甲醇溶解，定容至刻度即得。

2.3 色譜條件

2.3.1 基本條件

色譜柱為Acuity C18（250mm×4.6mm，5μm），流動相甲醇（A）-0.5%甲酸溶液（B），流速1.0 mL·min-1。梯度洗脫條件：0-40 min，15%-50%A；40-52 min，50%-100%A。進樣體積10 μL，柱溫30℃，檢測波長326 nm[18-20]。

2.3.2 線性關系考察

取新綠原酸對照品適量，精密稱定，加50%甲醇制成所需濃度的對照品溶液，作為儲備液（2.6 mg·mL-1）。取儲備液0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 mL，置10 mL量瓶中，分別用50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，分別進樣，測定，以峰面積為縱坐標（Y），對照品濃度（mg·mL-1）為橫坐標（X），繪制標準曲線得回歸方程為：Y=26.306X+0.395 4（r=1.000 0），新綠原酸在0.065-2.08 mg·mL-1范圍內具有良好的線性關系。

2.3.3 精密度試驗

精密吸取對照品溶液10 μL，按“2.3.1”項下色譜條件，進樣，測定，連續6次。以新綠原酸的峰面積計算，RSD為1.2%，結果表明，儀器精密度良好。

2.3.4 穩定性試驗

精密吸取“2.2”項供試品溶液，分別于制備后0、2、4、6、8、10、12、24 h分別進樣，按“2.3.1”項色譜條件測定，以新綠原酸峰面積計算，結果RSD為0.84%，結果表明供試品溶液放置24 h穩定。

3 單因素試驗

新綠原酸轉化的影響因素主要有反應時間、反應溫度、pH值、溶劑濃度(甲醇)、綠原酸濃度等，通過預實驗，從轉化的角度出發，將綠原酸濃度定為0.25 mg·mL-1，溶劑為50%甲醇溶液，結果顯示反應時間、反應溫度、pH值對新綠原酸含量影響較大。因此，對反應時間、反應溫度、pH值進行設計單因素考察，每個單因素實驗平行考察三次，取含量均值作為測定結果。

3.1 溫度對新綠原酸含量的影響

取20 mg綠原酸用4倍量50%甲醇溶解，考察反應時間為60 min，pH值為5.0條件下，不同的反應溫度（90℃，100℃，110℃,120℃，130℃）對新綠原酸含量的影響。以“2.3.1”項下的條件測定當中新綠原酸的含量，含量變化情況見圖3。結果表明，隨著溫度的升高，新綠原酸含量隨之增加，當溫度超過110℃時，新綠原酸含量反而下降。因此，確定反應溫度為110℃。

圖3 反應溫度單因素考察

圖4 反應時間單因素考察

圖5 pH值單因素考察

3.2 時間對新綠原酸含量的影響

取20 mg綠原酸用4倍量50%甲醇溶解，考察反應溫度為100℃，pH值為5.0條件下，不同反應時間（30、60、90、120、150 min）對新綠原酸含量的影響。以“2.3.1”項下條件測定當中新綠原酸的含量，含量變化情況見圖4。結果表明，隨著時間的增加，新綠原酸含量隨之增加，當反應時間超過60 min時，新綠原酸含量下降。因此，確定反應時間為60 min。

表1 響應面實驗設計

表2 Box-Behnken試驗設計與結果

3.3 PH值對新綠原酸含量的影響

取20 mg綠原酸用4倍量50%甲醇溶解，考察反應時間為60 min，反應溫度110℃，不同的pH（3.0，4.0，5.0，6.0，7.0）對新綠原酸含量影響，以“2.3.1”項下條件測定當中新綠原酸的含量，含量變化情況見圖5。結果表明，隨著pH值的增大，新綠原酸含量隨之增加，當pH大值于5.0時，新綠原酸含量下降。因此，確定pH值為5.0。

3.4 新綠原酸轉化工藝優選

在單因素實驗的基礎上應用響應面法對新綠原酸的轉化工藝進行優化，以反應溫度（A）、反應時間（B）、pH值（C）為考察因素，根據Box-Behnken設計原理，每因素設3個水平，用代碼值-1，0，1表示，因素水平見表1，實驗設計及結果見表2。以粗品中新綠原酸的含量為評價指標，采用Design-Exoect V8.0.5軟件對綜合評分結果進行多元線性回歸和二項式方程擬合，得回歸方程：含量=62.17-4.54A-1.44B-2.51C+0.27AB+3.80AC-1.82BC-11.26A2-3.57B2-5.76C2，相關系數R2=0.969 6，說明建立的二次項模型與實驗擬合較好。由表3響應面二次回歸方程方差分析結果所示，模型P＜0.01，效應面模型達到極顯著水平，影響新綠原酸轉化因素的主次順序為A＞C＞B，其中因素A反應溫度影響極顯著（P＜0.001），因素C（pH）影響顯著（P＜0.05），失擬項不顯著（P＞0.05），因素A和C的交互作用對新綠原酸的轉化是顯著的，表明二次方程預測值與實際值吻合度較高。方程對應的等高線、三維效應圖見圖6。

表3 Box-Behnken實驗方差分析

3.5 新綠原酸轉化工藝驗證試驗

通過求解回歸方程得到最佳轉化工藝參數為：反應溫度107.49℃，反應時間58.60 min，pH值為4.72，新綠原酸含量預測值為63.19%。結合實際試實際操作，確定反應溫度為107℃，反應時間60 min，pH值為4.72，以該參數進行3次驗證試驗，結果顯示，采用該工藝參數進行轉化，新綠原酸的含量均值為64.20%，RSD值＜2%，與預測值的相對偏差為1.56%，基本與模型預測值一致，適合新綠原酸粗品的制備。新綠原酸粗品A（峰1為新綠原酸）和新綠原酸對照品B色譜圖（圖7）。

4 新綠原酸的制備

取綠原酸10.0g，以“3.5”項下的優選條件進行反應，最終得到新綠原酸粗品9.12 g，用50%的甲醇溶解，離心取上清液進樣，以10%乙腈為流動相，流速20 mL·min-1，進樣量 800 μL，柱溫為室溫，檢測波長326 nm，多次進樣制備，收集液濃縮、干燥后得到新綠原酸的量為5.12 g，收率為87.37%。

5 新綠原酸質量分數測定

取“4”項下制備的新綠原酸樣品，按“2.3.1”項下色譜方法測定，用面積歸一化法計算，確定新綠原酸的質量分數為98.78%，新綠原酸樣品經ESI-MS分析，m/z:353.090 4[M-H]-，計算相對分子量為354。

6 結構鑒定

新綠原酸，白色粉末，ESI-MSm/z:353[M-H]-。1H-NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ:1.86-2.01(4H,m,H-2,H-6),3.78(1H,m,H-4),4.12(1H,m,H-3),5.21(1H,m,H-5),6.26(1H,d,J=16.0 Hz,H-8′),6.77(1H,d,J=8.0 Hz,H-5′),6.95(1H,dd,J=2.0,8.0 Hz,H-6′),7.05(1H,d,J=2.0 Hz,H-2′),7.50(1H,d,J=16.0 Hz,H-7′)；13C-NMR(100 MHz,DMSO-d6)δ:35.1(C-2),38.6(C-6),70.3(C-3),70.6(C-4),67.3(C-5),72.6(C-1),114.5(C-2′),114.9(C-8′),115.8(C-5′),121.1(C-6′),125.7(C-1′),144.3(C-3′),144.7(C-7′),145.7(C-4′),166.3(C-9′),175.4(COOH)。以上數據與文獻[8]報道的新綠原酸一致。

7 總結與討論

新綠原酸為熱毒寧注射液中有效活性成分之一，是一種咖啡酰奎寧酸類化合物，現代研究表明咖啡酰奎寧酸類化合物在藥物、食品、飼料添加劑以及化妝品中具有較高的潛在價值[14]。藥理實驗也表明它具有抗氧化活性、治療炎癥、抑制微生物和病毒活性、酶抑制作用等多種生物活性[21]。鑒于新綠原酸較好的藥理活性，對該化合物研究具有較大的實用價值，因此，本實驗采用Box-Behnken Design-響應面法建立一種快速大量制備高純度的新綠原酸的方法，且通過實驗方法驗證該工藝穩定可行，為新綠原酸的制備及其下一步藥理藥效的深入研究提供保障。

圖6 自變量A，B，C之間交互作用與應變量R1含量等高線、響應面圖

圖7 新綠原酸粗品（A）和新綠原酸對照品（B）的HPLC圖

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Optimization on Transformation from ChlorogenicAcid to NeochlorogenicAcid by Box-Behnken Design-response Surface Methodology

Wen Jianhui,Ni Fuyong,Wang Xuejing,Li Ming,Song Yaling,Wang Zhenzhong,Xiao Wei
(Jiangsu Kanion Pharmaceutical Co.Ltd.,Lianyungang 222000,China)

Box-Behnken design-response surface methodology was used to optimize the transformation from chlorogenic acid to neochlorogenic acid.Based on single factor experiments,the experiment design were developed by box-benhnhen central composite design with causal factors of the reaction temperature,time and PH to neochlorogenic acid.The optimum transformation conditions were as follow:reaction temperature at 107°C,reaction time of 60 min,the PH of 4.72.Under the optimum extraction technology conditions,the productivity of neochlorogenic acid was 64.20%.Neochlorogenic acid was isolated and purified.The determination and characterization of neochlorogenic acid was detected by HPLC,1H-NMR,13C-NMR and ESI-MS.The results showed that the content of neochlorogenic acid reached to 98.78%and the yield of 87.37%.

Chlorogenic acid,neochlorogenic acid,Box-Behnken design-response surface methodology,structural identification

10.11842/wst.2017.07.026

R284.1

A

新綠原酸為單咖啡酰奎寧酸類化合物，是由咖啡酸的1位和奎寧酸的5位通過酯化反應而形成的天然化合物（結構式見圖1），在植物界中分布廣泛，為最常見的單咖啡酰奎寧酸類化合物之一。具有抗菌解熱[1-2]、抗血栓[3]、體外抗結核活性[4]，抗炎、抗氧化、對心血管疾病的作用、抑制血小板聚集[5]等藥理作用。現代研究發現，新綠原酸在活性虛擬篩選中與靶蛋白HEV71的結合能為-9.2kcal/mol，具有一定的抑制手足口HEV71病毒活性[6]；在抗炎作用方面，新綠原酸對LPS刺激的RAW264.7細胞炎癥因子具有一定的抑制作用[7]；在抗補體經典途徑試驗中，新綠原酸的活性要優于陽性藥肝素[8]；另外，新綠原酸作為熱毒寧注射液有機酸的活性成分之一，對H1N1、H3N2、B流感病毒神經氨酸酶表現出良好的抑制作用[9]。

目前，新綠原酸尚無化學合成方法，均從植物中分離純化得到，但是由于其含量在植物中較低，若要獲得大量的高純度的新綠原酸單體，需要提取大量的藥材后利用不同的分離材料對該化合物富集、分離和純化，工序繁瑣，且藥材和試劑消耗量大。綠原酸為新綠原酸的同分異構體，在植物中含量高且制備工藝非常成熟[10-13]，有研究發現綠原酸在一定條件下可以轉化為新綠原酸及其它綠原酸類衍生物[14-17]，影響其轉化的主要因素有：反應時間、pH值、反應溫度。鑒于此，本文擬通過Box-Behnken-響應面法優化綠原酸轉化為新綠原酸的最佳條件，為新綠原酸的規模制備提供參考（圖2）。

圖1 新綠原酸結構式

2015-11-05

修回日期：2016-03-22

＊ 科學技術部國家“重大新藥創制”科技重大專項（2013ZX09402203）：現代中藥創新集群與數字制藥技術平臺，負責人：王振中。

＊＊ 通訊作者：蕭偉，本刊編委，博士，研究員級高級工程師，主要研究方向：中藥新藥的研究與開發。

（責任編輯：馬雅靜，責任譯審：王 晶）