DC-CTL細胞對卵巢癌小鼠不同輸注途徑的治療效果比較

●BHATTI SADAF,周飛凌,AHMAD MEESAQ, GHULAM QADIR,SAQUIB BINISH,李劼

DC-CTL細胞對卵巢癌小鼠不同輸注途徑的治療效果比較

●BHATTI SADAF,周飛凌,AHMAD MEESAQ, GHULAM QADIR,SAQUIB BINISH,李劼

目的：探討DC-CTL細胞采用兩種不同的輸注方式對卵巢癌小鼠的治療效果的比較。方法：取健康人的外周血制備DC-CTL細胞，分為抗原負載DC既A1組，未進行抗原負載為A2組，采用酶標法檢測A1和A2對卵巢癌細胞的殺傷作用。同時6周齡的雌性SPF小鼠60只，在超凈工作臺內(nèi)將SKOV3細胞液接種于裸鼠頸背部皮下建立移植瘤模型，第15天模型建立，選擇移植瘤模型建立成功的小鼠48只，隨機分為四組，分別為皮下注射組及其對照組，尾靜脈注射組及其對照組。兩組實驗組第21天分別采用皮下注射和尾靜脈注射法注入5*103的DC-CTL細胞，對照組注射相同劑量的生理鹽水作為安慰劑。第35天處死小鼠，分離瘤組織稱重并統(tǒng)計數(shù)據(jù)。結(jié)果：抗原負載的DC-CTL細胞對卵巢癌細胞有更好的殺傷效果。小鼠經(jīng)頸背部皮膚下注射SKOV3細胞在15天左右成瘤，兩組實驗組瘤重都明顯低于相應的對照組（P＜0.05），而兩組實驗組之間，尾靜脈皮下注射組小鼠的瘤重量明顯低于皮下注射組（P＜0.05）。結(jié)論：DC-CTL細胞能有效的抑制小鼠卵巢癌的發(fā)展，DC-CTL細胞經(jīng)尾靜脈注入卵巢癌小鼠體內(nèi)比皮下注射對小鼠有更好的治療效果， 本實驗結(jié)果為臨床使用DC-CTL細胞治療卵巢癌輸注方式的選擇提供了一定的依據(jù)。

DC-CTL細胞；移植瘤模型；輸注方式

卵巢癌為女性生殖系統(tǒng)三大惡性腫瘤之一，如今仍然殺死80%的患者死亡率居婦科惡性腫瘤之首[1]。卵巢癌的主要問題是它可以在腹部內(nèi)擴散引起癥狀。由于卵巢癌的發(fā)生發(fā)展具有非常隱匿的特點，超過70%的患者在卵巢癌發(fā)現(xiàn)時已經(jīng)屬于晚期，其五年生存率不足40%[2]。作為一個沉默的殺手,卵巢癌預后不良。很明顯，新的治療是卵巢癌所必需的.因此，新的治療方法必須不同.現(xiàn)在臨床治療晚期卵巢癌的治療主要采用手術(shù)聯(lián)合化療的方案，但是這種方案對身體的副作用較大，而且復發(fā)率較高。腫瘤免疫治療作為腫瘤治療的新型輔助療法，具有副作用較小，有效祛除體內(nèi)微小病灶，降低復發(fā)率等優(yōu)點，明顯改善了卵巢癌患者的生活質(zhì)量和降低了復發(fā)率[3]。CTL細胞對卵巢癌細胞的殺傷作用已經(jīng)被很多的研究證實[4]，但是并沒有研究探討過注射途徑對其治療效果的影響。本文采用DC-CTL細胞對卵巢癌模型的小鼠行皮下及尾靜脈注射，旨在驗證DC-CTL細胞對卵巢癌小鼠的治療作用的基礎上，來分析不同的輸注途徑對其治療效果的影響，為卵巢癌的免疫細胞治療采用更有效的輸注途徑提供了一定的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及實驗動物

雌性SPF小鼠購自湖南實驗動物有限公司；SKOV3細胞珠購自上海素爾生物技術(shù)有限公司；rhGM-CSF 由上海江萊有限公司提供；CD3、rhIL-2、TNF-α 、IL-4由上海普欣生物技術(shù)有限公司提供；RPMI1640培養(yǎng)液由美國Hyclone公司提供；胎牛血清由美國Gibco公司提供；Ficoll細胞分離液由美國GE公司提供。

1.2 實驗方法

1.2.1 裸鼠卵巢癌模型構(gòu)建

人卵巢癌SKOV3細胞株接種于RPMI1640培養(yǎng)基中常規(guī)培養(yǎng)傳代，與37℃，5%CO2溫度和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，卵巢癌SKOV3細胞為貼壁生長的細胞，每隔一天換液，取對數(shù)生長期細胞制備單細胞懸液，調(diào)整密度至2×106/ml備用。取60只6周齡左右的裸鼠在超凈工作臺內(nèi)將SKOV3細胞液接種于裸鼠頸背部皮下而建立移植瘤模型，15天左右成瘤，共51只產(chǎn)生移植瘤，直至體積約100-250mm3成荷瘤鼠。

1.2.2 卵巢癌細胞腫瘤抗原的制備

取對數(shù)生長期的人卵巢癌SKOV3細胞株制備單細胞懸液，洗滌后調(diào)整細胞密度至2?106/ml，通過反復三次的凍融，凍融操作為液氮5min，100℃水浴復蘇。600g離心25min，收集上清液，13000g離心45min，4攝氏度保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 抗原負載的DC-CTL細胞對人卵巢癌SKOV3細胞的殺傷作用

采健康志愿者的外周血50ml，采用Ficoll分離液分離外周血單個核細胞，加入含有胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2h，吸出未貼壁的細胞懸液備用，重新加入含有rhGM-CSF和IL-4的RPMI1640培養(yǎng)液，隔天換液，第6天加入TNF-α誘導DC成熟，成熟的DC細胞分成兩組培養(yǎng)，第一組第8天加入卵巢瘤抗原進行負載，設為A1組；第二組第8天不加入腫瘤抗原進行負載，設為A2組，共培養(yǎng)2天；未貼壁的細胞懸液通過免疫磁珠分選法，分選CD3+的細胞，凍存3d后加入含有胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液懸浮培養(yǎng)。第10天等量分別與A1組和A2組的DC共同加入到包被有CD3單抗的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)4d，離心分離凍存?zhèn)溆茫瑑山MDC-CTL細胞制備完畢。取對數(shù)生長期的卵巢癌SKOV3細胞，消化后調(diào)節(jié)密度為5×104個/ml。按96孔板每孔100ul的量接種于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h使其貼壁，作為靶細胞。12h后去掉上清，分別加入A1和A2組效應細胞按效應細胞和靶細胞的比值為 5∶1、10∶1、20∶1、40∶1，不加效應細胞的作為對照組。培養(yǎng)箱中共培養(yǎng)48h后，每孔加入MTT30ul，培養(yǎng)箱中再培養(yǎng)2h。終止培養(yǎng)，倒掉上清，每孔加入200ul DMSO，充分混勻后用酶標儀檢測吸收值，波長492nm，計算殺傷率。殺傷率=[（對照組A492-效應細胞組A492）/對照組A492]×100%。

1.2.4 動物分組及治療

選擇移植瘤模型建立成功的小鼠48只，隨機分為四組，分別為皮下注射組及其對照組，尾靜脈注射組及其對照組，皮下注射組和尾靜脈注射組兩組實驗組第21天起每隔兩天分別采用皮下注射和尾靜脈注射法注入5×103的抗原負載DC-CTL細胞，對照組在相同時間注射0.2ml的生理鹽水作為安慰劑。第35天處死小鼠，分離瘤組織稱重并統(tǒng)計數(shù)據(jù)。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS21.0統(tǒng)計軟件行統(tǒng)計分析。各組數(shù)據(jù)均以計量資料以均數(shù)±標準差(x±s)表示：2組間均數(shù)比較采用成組t檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

（1）將腫瘤負載DC-CTL（A1）組，未腫瘤負載DC-CTL（A2組）細胞分別與靶細胞按照不同比例混合后，共培養(yǎng)48h后觀察 DC-CTL 對人卵巢癌細胞 SKOV-3 的殺傷作用。實驗結(jié)果顯示，在相同的效靶比中：與對照組相比，A1組A2組效應細胞對卵巢癌大鼠SKOV-3細胞都有明顯 的殺傷作用（P＜0.05），A1組對比A2組對卵巢癌大鼠SKOV-3細胞的殺傷性也有顯著性（P＜0.05）。在不同的效價比中發(fā)現(xiàn)40∶1、20∶1、10∶1效靶比細胞對比5∶1效靶比的細胞有明顯的殺傷作用（P＜0.05）；40∶1、20∶1效靶比 DC-CTL 細胞比 10∶1 殺傷作用有顯著性（P＜0.05），而40∶1效靶比DC-CTL細胞對比20∶1效靶比DC-CTL細胞沒有明顯的殺傷作用（P＞0.05）。結(jié)果說明DC-CTL細胞對卵巢癌細胞有明顯的殺傷作用，并且有抗原負載的DC-CTL細胞有更好的殺傷作用，效靶比在20∶1之前越高殺傷效果越好。結(jié)果見表1。

表1 不同效靶比對SKOV-3細胞的殺傷作用

（2）經(jīng)過稱重統(tǒng)計，皮下注射組瘤重為1.64±0.26g，皮下注射對照組瘤重2.36±0.37g；尾靜脈注射組瘤重1.32±0.31g，尾靜脈注射組瘤重2.41±0.53g（見表1）。皮下注射組、尾靜脈注射組瘤重均明顯低于其對照組（P＜0.05）；尾靜脈注射組瘤重明顯低于皮下注射組（P＜0.05）；而兩組對照組之間并無顯著差異（P＞0.05）。結(jié)果見表2。

表2 各組小鼠腫瘤質(zhì)量

3 討論

卵巢癌在女性生殖系統(tǒng)腫瘤中死亡率最高，很多患者發(fā)現(xiàn)即為晚期。目前，卵巢癌的治療是外科手術(shù)結(jié)合化療的治療策略，雖然患者的生存率得到了提高，但化療嚴重的毒副作用、卵巢癌細胞的耐藥性產(chǎn)生以及不能清除微小病灶，很多患者2年以內(nèi)發(fā)生了復發(fā)以及耐藥性[5]。因此迫切需要尋找其他的治療策略

人體正常情況下，免疫系統(tǒng)是處在一個穩(wěn)態(tài)的狀態(tài)，腫瘤發(fā)生發(fā)展及疾病的產(chǎn)生都與免疫力降低有密切的關系。腫瘤免疫細胞治療作為一種新興的腫瘤輔助治療方法，具有重建免疫耐受，提高機體免疫細胞對腫瘤殺傷作用，殺瘤靶向性強，無明顯毒副作用，殺傷手術(shù)無法清除的微小病灶，提高病人生活質(zhì)量，延長帶瘤生存期等優(yōu)點，成為腫瘤治療研究的熱點[6][7][8]。其中DC細胞和CTL細胞是目前研究較多的腫瘤免疫細胞治療的重要部分。DC細胞又稱樹突狀細胞，是體內(nèi)已知的抗原呈遞能力最強的細胞，也是唯一能激活原始型T細胞的抗原城底細胞，很多研究證實[9][10]，抗原致敏的DC細胞能刺激T細胞產(chǎn)生特異性的腫瘤殺傷作用，在腫瘤應答中起到至關重要的作用。CTL 是最早識別腫瘤抗原的細胞，也能最有效的殺傷腫瘤細胞，它能夠消滅微小殘留病灶，甚至能使晚期腫瘤獲得完全緩解，在免疫細胞抗腫瘤中起重要作用，所以在腫瘤免疫治療中有著重要的地位[11]。研究發(fā)現(xiàn)，卵巢癌患者體內(nèi)免疫功能處于嚴重的抑制狀態(tài)，體內(nèi)DC與CTL細胞數(shù)量出現(xiàn)顯著的減少，導致腫瘤的識別及呈遞出現(xiàn)障礙，卵巢癌患者的惡化程度與體內(nèi)DC細胞的數(shù)量密切相關[12]。實驗證明[13]，免疫細胞治療能有效地殺傷卵巢癌細胞，減少卵巢癌的復發(fā)，降低患者的毒副反應。最新研究發(fā)現(xiàn)，不成熟的DC細胞可以導致卵巢癌細胞的凋亡，且DC與卵巢癌細胞共同培養(yǎng)后可促進CTLs細胞的增值[14]。本研究一是通過體外殺傷實驗的方法，采用MTT法[15]檢測抗原致敏的DC-CTL對卵巢癌SKOV-3細胞的殺傷作用，來驗證抗原致敏的DC-CTL對卵巢癌細胞的殺傷作用及無抗原致敏的DC-CTL細胞對卵巢癌細胞殺傷效果的比較，實驗結(jié)果顯示DC-CTL細胞相對對照組對卵巢癌細胞有明顯的殺傷作用，而抗原負載的DC-CTL細胞對卵巢癌細胞相對沒有抗原負載的DC-CTL細胞的殺傷作用更顯著；二是通過實驗一驗證殺傷作用后，通過皮下注射組、尾靜脈注射組與其各自對照組注射DC-CTL細胞的對比發(fā)現(xiàn)，使用抗原負載DC-CTL細胞治療卵巢癌小鼠能有效降低卵巢癌的瘤重，說明抗原負載的DC-CTL細胞能有效的殺傷卵巢癌腫瘤細胞，而兩個對照組之間瘤重的差異沒有顯著性，也排除了注射途徑對腫瘤形成的影響，為DC-CTL對卵巢癌治療的臨床應用提供了一定的依據(jù)。

免疫細胞治療主要有靜脈注射，皮下灌注，動脈注射等途徑。目前臨床來講以靜脈注射為主，動脈注射，皮下注射及其它注射方式為輔。有報道證明[16]，CIK細胞采用不同的輸注方式輸入裸鼠體內(nèi)后，細胞到達各器官的時間及其在各個器官中的分布量都有一定的不同，然而并沒有研究探討在卵巢癌的治療中何種輸注方式為更有效輸注途徑。關于過繼性免疫細胞治療的免疫細胞輸注到體內(nèi)后存活時間，有研究發(fā)現(xiàn)在免疫細胞輸注到模型小鼠中，第90d通過檢測標記物檢測免疫細胞的存活率，其存活率僅為輸注量的（2.3±1.0）%[17]，同時有研究報道異體免疫細胞輸入到患者外周血中可存活7.0±0.93周[18]。因而為腫瘤患者選擇一種合適的輸注途徑，將有效地提高治療藥物或者免疫細胞對腫瘤的殺傷作用，及時的讓藥物發(fā)揮其作用，減少藥物或者殺傷細胞在輸注到體內(nèi)的過程中的損耗。本文采用DC-CTL皮下注射和尾靜脈注射兩種途徑，來探討對于卵巢癌患者何種輸注方式更有效，這也是本文一個大的創(chuàng)新點。本文采用反復凍融人卵巢癌SKOV3細胞株來制作致敏抗原，而不是采用人體卵巢癌組織標本進行致敏抗原的制作，考慮手術(shù)后腫瘤組織的采集很難，尤其是腫瘤晚期轉(zhuǎn)移的患者，更難取得患者本人的腫瘤組織，本實驗通過選擇反復凍融SKOV3細胞株來制作致敏抗原，而SKOV3細胞株與卵巢癌細胞具有相同抗原也是我們選擇這種方法的一個原因。通過本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抗原負載的DC-CTL細胞對卵巢癌細胞有明顯的殺傷作用, 也說明人卵巢癌SKOV3細胞株來制作致敏抗原起到了明顯的作用，用尾靜脈輸注DC-CTL比皮下注射DC-CTL能更好的減少卵巢癌模型小鼠的瘤重，說明對卵巢癌模型小鼠采用尾靜脈注射法能得到更有效的改善，能夠更有效地到達腫瘤病灶部位。因此通過本實驗結(jié)果一是再次驗證了在體外，腫瘤抗原致敏的DC-CTL細胞對卵巢癌細胞有很好的殺傷作用，二是發(fā)現(xiàn)尾靜脈注射DC-CTL細胞比靜脈注射能更好的降低卵巢癌小鼠的瘤重，為臨床卵巢癌患者采取免疫細胞治療時，采用更有效的輸注方式達到更好的卵巢癌治療效果提供了一定的依據(jù)。

（作者單位：湖南人民醫(yī)院婦科系）

[1] Siegel R,Ward E,Brawley O,et al.Cancer statistics,2011∶the impact of eliminating socioeconomic and racial disparities on premature cancer deaths[J].CA Cancer J Clin,2011,61(4)∶212-236.

[2] Burges A, Schmalfeldt B.Ovarian cancer diagnosis and treatment[J].Deutsches ?rzteblatt International | Dtsch Arztebl Int,2011; 108(38)∶635-641.

[3] Jiang J, Wu C, Lu B.Cytokine-induced killer cells promote antitumor immunity[J].J Transl Med, 2013, 11∶83.

[4]Peethambaram PP,Melisko ME,Rinn KJ,et al.A phase I trial of immunotherapy with lapuleucel-T(APC8024) in patients with refractory metastatic tumors that ecpress HER-2/neu[J].Clin Cancer Res,2009,15(8)∶5937-5944.

[5]Armstrong DK, White AJ, Weil SC, et al.Farletuzumab (a monoclonalantibody against folate receptor alpha) in relapsed platinum-sensitiveovarian cancer.Gynecol Oncol, 2013, 129(3)∶452-458.

[6]Marcus A, Gowen BG, Thompson TW, et al.Recognition of tumors by the innate immune system and natural killer cells[J].Adv Immunol, 2014,122,91-128.

[7] Coulie PG, Vandeneynde BG, Vanderbruggen P, et al.Tumour antigens recognized by T lymphocytes∶ at the core of cancer immunotherapy[J].Nat Rev Cancer, 2014,14(2),135-146.

[8] Glienke W, Esser R, Ftiesener C, et al.Advantages and applications of CAR-expressing natural killer cells[J].Front Phamacol,2015,6∶21.

[9] Janikashvili N, Larmonier N, Katsanis E, et al.Pesonalized dendritic cell-based tumor immunotherapy[J].Immunotherapy,2010,2∶57-68.

[10] Palucka K, Banchereau J.Cancer immunotherapy via dendritic cells[J].Nat Rev Cancer ,2012,12∶265-277.

[11] Santin AD， BeLLone S， Ravaggi A， PecoreLLi S， Cannon MJ， Parham GP.Induction of ovarian tumor-specific CD8+ cytotoxic T Lymphocytes by acid-eLuted peptide-puLsed autoLogous dendritic ceLLs.Obstet GynecoL 2000;96∶422–430.

[12] Iwamoto M , Shinohara H, Miyamoto A , et al .Prognostic value of tumor-infi lt rating dendritic cells expressing CD83 in human breast carcinomas .Int J Cancer, 2003, 104 ∶92-97.

[13]陳蕓，劉曉健，胡素英.卵巢癌腹水自體抗原致敏DC-CIK過繼轉(zhuǎn)移治療的應用研究［J].實用臨床醫(yī)藥雜志，2011，15（7）：51-54.

[14] Krempski J, Karyampudi L, Behrens MD, et al.Tumor infiltrating programmed death receptor-1+dendritic cells mediate immune suppression inovarian cancer [J].J Immunol,2011,186(12)∶6905.

[15]Emesto M，Dihadenys L， MjgueL E et aL.Comparative evaLuation of the nitrate reduction assay，the MTI-test，and the resazurin Microtitre assay for drug susceptibiLity testing of cLinicaL isoLates of MycobaCt6riumtubereuLosjs[J] Antimjerob.Chemother，2005,55∶500-505.

[16]李慧，岳欣，安秀梅等。不同輸注途徑對CIK細胞體內(nèi)分布和抑瘤作用的影響。2007,23（4）：416-420.

[17]Rosenberg SA, Restifo NP, Yang JC,et al.Adoptive cell transfer∶ a clinical path to effective cancer immunotherapy.Nat Rev Cancer,2008,8∶299-308.

[18]李壯，王愛民。自體及健康人CIK細胞對比治療惡性腫瘤的初步評估研究[C].2014,4∶36-47.

Comparison of the therapeutic effects of DC-CTL cells by different routes of delivery in ovarian cancer mice

BHATTI SADAF , ZHOU LING FEI , AHMAD MEESAQ , GHULAM QADIR , SAQUIB BINISH ,LI JIE
(Department of Gynecology, Hunan People’s Hospital, Hunan Changsha 410005, China)

OBJECTIVE To investigate the different effect of two infusion ways of DC-CTL treatment on mice with ovarian cancer.METHODS ∶To prepare DC-CTL cells from normal human peripheral blood，antigen-loaded DC group (group A1) and no antigen-loaded group (group A2).The cell killing effect of A1 and A2 on ovarian cancer cells was detected by enzyme-linked immunosorbent assay.To get 60 6-week-old female SPF mice in a clean bench,SKOV3 cells were inoculated subcutaneously into nude mice to establish cervical xenograft model.The model were established about 15 days.48 xenograft model mice were randomly divided into four groups, named subcutaneous injection group and the control group,tail- intravenous injection group and the control group.Two experimental groups mice were respectively injected by tail-subcutaneous injection and tail vein injection of 5 ? 103 DC-CTL cell on day 21 and in the control group injected with the same volume of saline as a placebo.Mice were executed on day 35.The tumor tissue was weighed and separated statistically.RESULTS ∶Antigen-loaded DC-CTL cells had better killing effect on ovarian cancer cells .SKOV3 cells can make tumors about 15 days through injecting under the mice dorsal and neck skin.The tumor weight with the experimental group were significantly lower than those of the control group (P ＜0.05) and the tumor weigh of tailintravenous injection group was significantly lower than in mice by subcutaneous injection group (P ＜0.05).CONCLUSION ∶DC-CTL cells can effectively inhibit the development of mouse ovaries tumor.DC-CTL cells were injected into the tail vein of mice with ovarian cancer can have a significantly better therapeutic effect than subcutaneous injection in mice.The present results provide a certain basis for the clinical use of DC-CTL cells in ovarian cancer treatment options infusion.

DC-CTL Cell, Xenograft Model, Infusion