抗腫瘤藥物紫杉醇對腺樣囊性癌細胞侵襲力以及明膠酶水平的影響

●徐磊 舒曉宏

抗腫瘤藥物紫杉醇對腺樣囊性癌細胞侵襲力以及明膠酶水平的影響

●徐磊1舒曉宏2

目的：通過對不同濃度的紫杉醇使用分析，對進行含有紫杉醇抗腫瘤藥物對腺樣囊性癌細胞侵襲力以及明膠酶水平的影響。方法：使用Bristol-Myers Squibb公司生產(chǎn)的紫杉醇，使用0.01mg/L、0.06mg/L以及0.1mg/L的不同濃度紫杉醇，對人ACC-M細胞進行培養(yǎng)。研究紫杉醇對腺樣囊性癌細胞侵襲力以及明膠酶水平的影響。結(jié)果：未受紫杉醇處理的對照組細胞，粘附率達99.5%，而在不同程度下的紫杉醇實驗組細胞粘附率都有所下降，其結(jié)果分別為86.2%、72.8%和59.5%，所產(chǎn)生結(jié)果與紫杉醇的濃度比例成正比關(guān)系。結(jié)論：通過實驗數(shù)據(jù)表明，紫杉醇的濃度對ACC-M黏附性以及明膠酶活性等都有明顯的抑制作用。

腺樣囊性癌；紫杉醇；明膠酶

調(diào)查顯示腺樣囊性癌是一種侵襲力強，易發(fā)生轉(zhuǎn)移的口腔和面部惡性腫瘤，經(jīng)過多方查找與研究試驗表明，紫杉醇對癌細胞有控制治療作用，是當下一種高效抗癌藥物[1]。

1 資料與方法

1.1 一般資料

由Bristol-Myers Squibb公司生產(chǎn)的紫杉醇；大連醫(yī)科大學(xué)中心實驗室提供的人高轉(zhuǎn)移腺樣囊性癌細胞株（ACC-M）；廣州鼎國生物有限公司提供的侵襲小室（boyden 小室）；廣州基因公司提供的細胞外基質(zhì)凝膠(ECM)，MILLIPORE公司的聚碳酸酯膜Isopore，日本SANYO的BB5060/BB16 二氧化碳培養(yǎng)箱，瀘南科學(xué)儀器聯(lián)營廠的BFX5-320 型低速離心機，上述實驗用藥都符合醫(yī)學(xué)規(guī)定。

1.2 方法

1.2.1 紫杉醇處理后ACC-M黏附性的檢測

利用96孔培養(yǎng)板分別注入ECM,干燥封閉，輕洗3次。加入不同濃度的紫杉醇的ACC-M細胞懸浮液100ul,培養(yǎng)2h后進行3次輕洗，洗去未黏附成功的細胞，然后100ul0.4g/L的MTT孵育4h，加入200ul的DMSO再對每個孔A450mmOD檢測，通過細胞黏附率結(jié)果，可以對不同濃度下的紫杉醇和無紫杉醇的黏附率形成對比組。

1.2.2 紫杉醇處理下ACC-M侵襲力

在改良的boyden上下小室間涂上含有5ug/10ulfibronectin的聚碳酸酯膜，并ECM用4℃的RPMI1640稀釋，分兩次涂在膜的表面，每10min給5ug/10ul,下室加入含有10%FCS的RPMI1640，上室加入300ul 5?105ml的ACC-M細胞懸液，進行培養(yǎng)2h，當細胞貼壁后換含有不同濃度紫杉醇培育10h，再用棉簽擦拭上室的ECM細胞，取出微孔膜、固定、染色，隨機選取五個視野，采集數(shù)據(jù)，取平均值，重復(fù)三次，最后對不同濃度下紫杉醇侵襲數(shù)量、遷移數(shù)量和不含紫杉醇的細胞組進行對照。

1.2.3 明膠酶活性測定

在6孔每個細胞培養(yǎng)板中，加入ECM30.0ug/60ul,進行干燥與紫外線消毒，進行24h培養(yǎng)前再加入5.0?105/mlACC-M細胞的懸浮液1.5ml。然后在不同濃度的紫杉醇培養(yǎng)液培養(yǎng)24h，再將1.5ml無血清RPPMI1640培養(yǎng)72h，取其細胞上清液。利用“空斑法”對上清培養(yǎng)液的明膠酶活性進行測定，將通過Gelatin Type溶解濃度為4mg/ml的Tris-Cl緩沖液，瓊脂糖與Tris-Cl溶解配成2%的溶液，兩種溶液各取3ml鋪在培養(yǎng)皿中，凝固，打孔，分別注入不同濃度的紫杉醇的培養(yǎng)液上清液，置于培養(yǎng)箱內(nèi)72h，之后用1%的鹽水沖洗，0.1%的考馬斯量藍R250溶液染色20min，脫色，測量空周圍空斑的直徑，以代表明膠酶活性，此實驗重復(fù)五次，對數(shù)據(jù)記錄。

1.3 療效判定

顯效：臨床實驗表明，紫杉醇對乳腺癌和卵巢癌已起到明顯控制作用；有效：針對腺樣囊性癌癥，紫杉醇對其侵襲力起到轉(zhuǎn)移效果，但未起到根治作用；總有效率=顯效+有效/總比例?100%。實驗顯示，不同濃度的紫杉醇對腺樣囊性癌細胞，產(chǎn)生的結(jié)果也各有不同，其產(chǎn)生的結(jié)果與含紫杉醇劑量成正比。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

所得數(shù)據(jù)用SPSS11.0統(tǒng)計軟件得出各組的平均值，行4組間兩兩對比t檢驗，P＜0.05為有顯著差異。

2 結(jié)果

對照組的細胞未受紫杉醇的處理，其黏附率達99.5%，含有不同濃度紫杉醇處理下的ACC-M黏附率明顯下降，分別為86.2%、72.8%、59.5%詳情見表1。

表1 不同濃度紫杉醇處理下ACC-M黏附性比較

通過實驗結(jié)果顯示，紫杉醇在對抑制ACC-M的侵襲力等方面都有具有明顯的效果，其結(jié)果也與紫杉醇呈明顯的劑量關(guān)系，詳情可以參考相關(guān)文獻。

3 討論

腺樣囊性癌細胞利用自身特點貫穿于整個轉(zhuǎn)移的過程中，想要抑制腫瘤控制侵襲力是關(guān)鍵，每個癌細胞在侵襲運動中，細胞骨架參與整個信息的傳遞，通過對構(gòu)架改造來影響行為的運變能力。微觀蛋白與微觀系統(tǒng)是紫杉醇的核心，能夠誘導(dǎo)和促進微管蛋白聚合，防止解散，穩(wěn)定微管等作用。在實驗中顯示紫杉醇對ACC-M有明顯下調(diào)能力，對其分析這與微管系統(tǒng)的破壞存有密切聯(lián)系[2]。

本研究采用空斑法、ELISA對ACC-M明膠酶的表達及活性進行評價，結(jié)果顯示，紫杉醇對明膠酶的酶原合成存在有效的影響，通過微管系統(tǒng)的破壞對細胞骨架失調(diào)起阻斷影響，可以導(dǎo)致細胞黏附能力減弱，整合素分子聚集成局部黏附斑受阻?？瞻叻ㄑ芯勘砻?，細胞培養(yǎng)上清液中的明膠酶活性雖紫杉醇的濃度升高而降低，但低濃度紫杉醇作用下的數(shù)據(jù)顯示，目前對明膠酶活性受抑制的機制還需要進一步研究。

綜上所述，在0.1至0.01mg/L濃度范圍內(nèi)，紫杉醇能夠?qū)CC-M的粘附力、運動以及侵襲力，有著明顯下降的表達及活性,實驗表明紫杉醇對ACC-M的侵襲起到有效的控制能力。

（作者單位：1煙臺毓璜頂醫(yī)院藥學(xué)部；2大連醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院）

[1]林耿冰.紫杉醇抑制腺樣囊性癌體外侵襲力及其機制的初步研究[D].福建醫(yī)科大學(xué),2003.

[2]劉浩,俞光巖.紫杉醇抗涎腺腺樣囊性癌遠處轉(zhuǎn)移的實驗研究[J].現(xiàn)代口腔醫(yī)學(xué)雜志,2002,14(03)∶193-194+289.

舒曉宏，博士，教授，博士生導(dǎo)師。