定喘湯對呼吸道合胞病毒感染幼齡大鼠肺泡灌洗液中炎癥細胞的影響

崔振澤， 黃燕， 徐超

實驗論著

定喘湯對呼吸道合胞病毒感染幼齡大鼠肺泡灌洗液中炎癥細胞的影響

崔振澤， 黃燕， 徐超

目的觀察呼吸道合胞病毒(RSV)感染幼齡大鼠后肺泡灌洗液(BALF)中細胞總數及分類的變化及定喘湯對其的影響。方法將27只Wistar大鼠隨機分為正常組、RSV模型組、定喘湯組，每組9只。除正常組外，余各組用RSV(Long珠)病毒予大鼠滴鼻造模，造模后正常組和RSV模型組均以等體積的生理鹽水灌胃，定喘湯組給予定喘湯灌胃。采用蘇木精-伊紅染色觀察各組大鼠肺組織炎癥變化情況；采用細胞涂片瑞氏-吉姆薩染色方法檢測各組大鼠BALF中細胞分類計數。結果病理結果顯示，RSV模型組大鼠肺組織炎癥明顯，炎癥細胞增多，定喘湯干預后肺組織炎癥有所好轉。RSV模型組細胞總數及各分類指標均高于正常組，差異有統計學意義(P<0.05)；定喘湯組細胞總數及各分類指標均低于RSV模型組，差異有統計學意義(P<0.05)。結論定喘湯干預RSV感染大鼠的作用機制可能與抑制大鼠BALF中的炎癥細胞有關。

呼吸道合胞病毒感染； 定喘湯； 細胞計數； 大鼠

呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus，RSV)是嬰幼兒下呼吸道感染的主要病毒病原，感染率高，且首次感染多見于1歲以內的嬰兒，以發熱、喘息、氣促為主要臨床表現[1]。而更多學者關注的是，RSV感染不僅引起急性呼吸道疾病，還與遠期喘息密切相關，甚至日后發展為支氣管哮喘。RSV感染可通過引起氣道黏膜損傷、T細胞活化、大量細胞因子釋放導致氣道高反應性，但在眾多發病機制中，炎癥細胞浸潤也是不可忽視的一面。中醫藥治療病毒性感染疾病獨具優勢，療效確切，耐藥性低，不良反應少，臨床實踐中發現，定喘湯治療RSV感染療效顯著[2]，且在前期基礎研究中證實，定喘湯能有效抑制RSV復制并對其感染大鼠的免疫功能具有良好的調節作用[3-4]。本實驗在前期研究的基礎上，觀察RSV感染大鼠后其肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluids，BALF)中炎癥細胞的變化情況，并闡明定喘湯對RSV感染大鼠BALF中炎癥細胞的影響機制。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 SPF級Wistar大鼠27只，雌雄各半，鼠齡3周齡左右，體質量(30±10)g，由遼寧本溪長生生物技術有限公司提供(許可證號：SCXK(遼)2010-0001)。Wistar大鼠均置于清潔無病原體的鼠籠內飼養，飼料和飲用水均經過高溫高壓消毒處理。27只Wistar大鼠按隨機數字表法分為正常組、RSV模型組、定喘湯組，每組9只。

1.2 病毒來源 RSV Long株來源于中國預防醫學科學院病毒所毒種室，凍存于遼寧中醫藥大學附屬醫院病毒實驗室。測定大鼠病毒半數致死量LD50為1×10-2/mL。

1.3 藥物制備 定喘湯一次性購于遼寧中醫藥大學附屬醫院中藥局。定喘湯全方由麻黃、杏仁、半夏、桑白皮、白果、款冬花9 g，蘇子6 g，黃芩12 g，甘草3 g組成。將以上藥物按照傳統方法水煎2次混合后，制成含生藥2 g/mL的藥液備用。

1.4 研究方法

1.4.1 模型制備 參照文獻[5-6]的造模方法，RSV模型組和定喘湯組大鼠在乙醚麻醉下經鼻腔接種RSV Long株病毒液，每只0.1 mL，正常組在同等條件下接種等量不含病毒的生理鹽水，每日1次，連續接種3 d。

1.4.2 給藥方法 各組在滴鼻2 h后開始灌胃，定喘湯給藥劑量相當于60 kg成人臨床等效量，正常組與RSV模型組予等體積的生理鹽水灌胃，每日1次。所有大鼠均在同一條件下喂養，正常飲食，自由飲水。

1.4.3 取材方法 各組大鼠分別于第7天被處死取材，自大鼠頸部切開分離氣管，聚乙烯導管行氣管插管，結扎左肺支氣管，磷酸鹽緩沖液0.5 mL灌洗3次，回收灌洗液約0.4 mL備用；無菌條件下取鼠右肺組織，用于肺組織病理觀察。

1.5 檢測方法

1.5.1 BALF中細胞計數檢測 支氣管灌洗液離心沉淀細胞用磷酸鹽緩沖液0.5 mL重懸，取0.1 mL在血細胞計數器下計算細胞總數，其余沉渣細胞涂片瑞氏-吉姆薩染色，按細胞形態進行分類計數(計數300個細胞)。

1.5.2 肺病理組織測定 新鮮大鼠肺組織經固定、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、蘇木精-伊紅染色等處理，中性樹膠封固，觀察各組大鼠肺組織炎癥變化情況。

2 結果

2.1 定喘湯對RSV感染大鼠肺組織形態學改變 正常組大鼠支氣管、肺組織結構完整，支氣管黏膜上皮完整，未見明顯炎性細胞浸潤，肺泡壁無增厚，無充血(圖1a,見封三)。RSV模型組大鼠可見肺泡壁明顯增厚，肺間質可見大量淋巴細胞、漿細胞、嗜酸性細胞浸潤(圖1b,見封三)。定喘湯組大鼠可見肺泡壁略增厚，肺間質可見少量淋巴細胞、漿細胞、嗜酸性細胞浸潤(圖1c,見封三)。

2.2 定喘湯對RSV感染大鼠BALF中細胞總數及各分類的影響 見表1。

表1 各組大鼠BALF中細胞總數及分類測定結果

注：與正常組比較，aP<0.05；與RSV模型組比較，bP<0.05。

表1結果表明，RSV模型組細胞總數及各分類指標均高于正常組，差異有統計學意義(P<0.05)，定喘湯組中性粒細胞及淋巴細胞數高于正常組，差異有統計學意義(P<0.05)；定喘湯組細胞總數及各分類指標均低于RSV模型組，差異有統計學意義(P<0.05)。

3 討論

RSV感染主要是引起肺部間質及毛細支氣管炎癥的小兒病毒性肺炎，屬于中醫肺炎喘嗽范疇，為外邪侵肺，痰熱壅盛，肺失宣肅所致，治宜清熱宣肺，化痰定喘。方中麻黃、杏仁宣肺平喘，白果斂肺止咳，與麻黃相伍一散一收，既可加強平喘止咳之功，又能防止麻黃過于耗散肺氣；半夏燥濕化痰；蘇子、款冬花降氣平喘；桑白皮、黃芩清瀉膈熱，止咳平喘；甘草調和諸藥。本方集宣肺、降肺、清肺于一體，祛邪去因，取效甚速[7]。

本研究結果顯示，經RSV感染后的大鼠，其BALF中細胞總數及中性粒細胞、淋巴細胞、嗜酸性粒細胞與正常組比較均明顯升高，提示RSV感染可促進中性粒細胞、淋巴細胞和嗜酸性粒細胞等聚集，而這些炎癥細胞的聚集又可影響氣道上皮細胞屏障功能，并激活上皮細胞及影響炎癥因子的釋放，引起氣道炎癥反應，也進一步證實RSV感染引起的炎癥細胞增多在誘發哮喘中發揮著一定的作用。RSV感染后的BALF中細胞總數和各分類計數是普遍升高的，而不是個別類型細胞升高突出，也可說明RSV感染是一種非特異性的炎癥過程，不存在起主導作用的特異細胞類型，與國外文獻報道相一致[8]。

本實驗中，RSV感染后嗜酸性粒細胞增多，這可能一方面與RSV破壞氣道上皮引起嗜酸性粒細胞趨化因子等局部釋放有關，另一方面可能與RSV感染引起的Th2型趨化因子分泌增多有關，其中白細胞介素5與嗜酸性粒細胞的發展、激活、聚集關系都很密切[9]。而嗜酸性粒細胞又是兒童哮喘中關鍵的效應細胞，這足以證明RSV感染與哮喘的密切相關性。本研究結果還顯示，淋巴細胞也明顯升高，可能由于在感染過程中RSV感染可以引起非特異性淋巴細胞募集和早期活化，并提示這種效應能有意義的增加氣道炎癥，并由此產生呼吸道癥狀[10]，甚至有研究表明在一些小鼠哮喘模型中氣道高反應和嗜酸性粒細胞無關[11],而可能與淋巴細胞浸潤有關。更令人感興趣的是本實驗中中性粒細胞也明顯升高，其參與RSV感染介導的呼吸道癥狀的發病機制，可能是通過產生超氧化物或釋放細胞因子這種致炎功能所引起[10]；另也有研究檢測RSV感染哮喘患者BALF，發現白細胞介素9(喘息易感性的重要因子)明顯增加，并進一步證實其來源于中性粒細胞[12]；均提示中性粒細胞也可能是病毒相關性喘息發病中的重要效應細胞。在當今的許多哮喘研究中，中性粒細胞與嗜酸性粒細胞、T淋巴細胞、肥大細胞等同樣具有不可忽視的作用，尤其在哮喘急性發作和重度哮喘時，中性粒細胞的作用甚至已超過傳統意義上的嗜酸性粒細胞[13]。因此，可以說RSV感染后引起的氣道高反應可能與多種細胞成分有關，上述炎癥的形成和多種炎性介質的相關性發現，不僅有利于闡明RSV感染引發喘息甚至導致哮喘發作的機制，而且為預防和治療提供了重要的理論依據。

本研究結果表明，RSV感染后的大鼠經定喘湯干預后，BALF中的細胞總數及中性粒細胞、淋巴細胞、嗜酸性粒細胞均有明顯減少，提示定喘湯可減少RSV感染后BALF中的炎癥細胞的釋放。現代中藥藥理研究也證明，本方部分單味藥分別具有抑菌、抗病毒、抗炎及抗變態反應、平喘、鎮咳祛痰、解熱、鎮靜等作用[14]。故本方對RSV感染的抗炎作用機制可能與抑制中性粒細胞、嗜酸粒細胞等炎癥細胞的釋放有關，以減輕氣道炎癥反應。

綜上所述，RSV感染可以激發機體內中性粒細胞、淋巴細胞及嗜酸性粒細胞等炎癥細胞的分泌、聚集，而中藥定喘湯對RSV感染后BALF中的炎癥細胞的釋放具有抑制作用從而達到控制其進一步惡化的目的。近幾年，王雪峰教授也在科研實驗及臨床試驗過程中證實了中醫藥防治肺系疾病具有獨特的優勢及潛力[15-16],值得進一步深入研究和臨床推廣。但本研究定喘湯對RSV感染防治的確切機制以及是否對BALF細胞因子和全身性炎癥反應的影響還有待進一步研究。

[1] 張旭光,盧仕仰,黃從付,等.兒童急性下呼吸道感染2368例病原學分析[J].中國中西醫結合兒科學,2014,6(6):543-544.

[2] 劉小雪,王雪峰,張秀英,等.清肺通絡膏對呼吸道合胞病毒感染大鼠肺組織PI3K-AKT-NFκB信號通路的影響[J].中國中西醫結合兒科學,2016,8(2):136-138.

[3] 崔振澤.定喘湯及其宣降清分解劑抗呼吸道合胞病毒感染的體內外實驗研究[D].沈陽：遼寧中醫學院,2005.

[4] 黃燕,徐超,崔振澤.定喘湯及其分解劑對RSV感染大鼠細胞免疫調節的研究[J].時珍國醫國藥,2016,27(9):2078-2081.

[5] 張海嬰,王雪峰,謝斌,等.外敷敷胸膏對RSV肺炎大鼠肺組織TLR4及NF-κB p65的影響[J]. 時珍國醫國藥,2015,26(6):1325-1327.

[6] 熊欣. 敷胸膏對RSV感染大鼠急性肺損傷模型中IFN-γ和IL-4表達的影響[D].沈陽：遼寧中醫藥大學,2014.

[7] 崔振澤,黃燕,劉明濤,等. 定喘湯“宣降清”三法組方規律探析[J]. 遼寧中醫雜志,2016,43(7):1384-1386.

[8] Martinez FD. Respiratory syncytial virus bronchiolitis and the pathogenesis of childhood asthma[J]. Pediatr Infect Dis J，2003，22(2 Suppl):S76-82.

[9] Barnes PJ. The cytokine network in asthma and chronic obstructive pulmonary disease[J]. J Clin Invest，2008，118(11):3546-3556.

[10]鄒映雪. 嬰幼兒喘息早期診斷評價及干預性治療的可行性研究[D].長春：吉林大學,2013.

[11]Makela MJ, Tripp R, Dakhama A, et al.Prior airway exposure to allergen increases virus-induced airway hyperresponsiveness[J]. J Allergy Clin Immunol，2003，112(5):861-869.

[12]McNamara PS, Flanagan BF, Baldwin LM, et al.Interleukin 9 production in the lungs of infants with severe respiratory syncytial virus bronchiolitis[J]. Lancet,2004,363(9414):1031-1037.

[13]Wenzel SE, Szefler SJ, Leung DY, et al.Bronchoscopic evaluation of severe asthma. Persistent inflammation associated with high dose glucocorticoids[J]. Am J Respir Crit Care Med，1997，156(3 Pt 1):737-743.

[14]蔡永敏,任玉讓,王黎，等. 最新中藥藥理與臨床應用[M].北京：華夏出版社，1999:51.

[15]王雪峰,王思源,岳志軍,等. 3種治法對RSV誘導的肺炎小鼠炎性細胞因子的表達及TLR-4/NF-κB信號通路調控研究[J]. 遼寧中醫雜志,2014,41(3):385-387.

[16]王力寧,王雪峰,原曉風,等. 中醫藥治療小兒肺炎喘嗽風熱閉肺證、痰熱閉肺證臨床驗證方案的多中心隨機對照研究[J]. 中國中西醫結合兒科學,2010,2(5):386-391.

EffectofDingchuandecoctionontheinflammatorycellsinBALFofyoungratsinfectedwithRSV

CUIZhenze，HUANGYan，XUChao.

DalianChildren'sHospital，Dalian116000，China

ObjectiveTo observe the changes of the total number and classification of BALF in young rats infected with RSV as well as the effect of Dingchuan decoction on it.MethodsTwenty-seven Wistar rats were randomly divided into normal group, RSV model group and Dingchuan decoction group, 9 rats in each group. Except for the normal group, the rats in the other two groups were given RSV(Long bead) virus for nose dripping to get modeling, and after modeling the rats in normal group and model group were given gavage with equal volume of physiological saline. The Dingchuan decoction group was gavaged with Dingchuan decoction. HE staining method was used to observe the change of inflammation in lung tissues of rats; the cell smear-Ruish-Giemsa staining was used to determine the cell classification count in BALF of rats in each group.ResultsPathology displayed: compared with the normal group, the inflammation of lung tissue in RSV model group was obvious and inflammatory cells increased, and after Dingchuan decoction intervention lung tissue inflammation was improved; compared with the normal group, the total cell count and the indexes of RSV model group were higher, and the difference was statistically significant(P<0.05). Compared with the model group, the total cell count and indexes of Dingchuan decoction group were significantly decreased, and the difference was statistically significant(P<0.05).ConclusionThe mechanism of Dingchuan decoction in RSV infection in rats may be related to the inhibition of inflammatory cells in rat BALF.

RSV； Dingchuan decoction； Cell count； Rat

R725.6

A

1674-3865(2017)05-0369-03

2017-02-15)

(本文編輯：劉穎)

國家自然科學基金項目(81473726)；遼寧省自然科學基金項目(2014020173)

116000 遼寧 大連，大連市兒童醫院呼吸科

崔振澤(1964-)，男，醫學博士，教授、主任醫師，碩士研究生導師。研究方向：中西醫結合防治小兒呼吸系統疾病

黃燕，E-mail：13304280868@126.com

10.3969/j.issn.1674-3865.2017.05.001