胰腺癌LyP-1靶向性磁共振—熒光雙模態分子探針實驗

史 張，宋長恩，施睿峰，陸建平，鄧勇輝，蔣 濤*

(1.第二軍醫大學附屬長海醫院放射科，上海 200433；2.復旦大學化學系，上海 200433)

胰腺癌LyP-1靶向性磁共振—熒光雙模態分子探針實驗

史 張1，宋長恩1，施睿峰1，陸建平1，鄧勇輝2*，蔣 濤1*

(1.第二軍醫大學附屬長海醫院放射科，上海 200433；2.復旦大學化學系，上海 200433)

目的構建胰腺癌LyP-1靶向性磁共振—熒光雙模態分子探針，觀察其表征并進行MR顯像。方法構建50 nm核殼結構的磁共振—熒光雙模態介孔探針，表面經環形多肽LyP-1(Cys-Gly-Asn-Lys-Arg-Thr-Arg-Gly-Cys)修飾，通過熒光及MR T2WI聯合成像，驗證該分子探針能否特異性識別并結合胰腺癌細胞。結果新型LyP-1靶向性磁共振—熒光雙模態分子探針可用于小鼠原位胰腺癌的熒光顯像和磁共振成像，可有效結合胰腺癌細胞并在體外使T2WI信號明顯降低。體內實驗表明，該分子探針可與熒光標記的胰腺癌組織靶向結合，并作為MRI對比劑顯示C57BL/6小鼠原位胰腺癌。結論LyP-1靶向性磁共振—熒光雙模態分子探針可靶向性地高效結合原位移植的小鼠胰腺癌細胞，用于早期胰腺癌診斷的轉化研究。

胰腺腫瘤；分子探針；雙模態；磁共振成像；熒光成像

由于多數胰腺癌在發現時已屬晚期或已經存在遠處轉移，超過80%的胰腺癌患者無法進行治愈性切除，因此提高胰腺癌的早期診斷率尤為重要[1-2]。MRI廣泛應用于對腫瘤的診斷，通過MRI對比劑可改變組織周圍外部磁場以獲得高質量的圖像[3]。目前臨床應用的主要MRI對比劑弛豫效率較低且缺乏組織特異性，新型MRI對比劑的研發已成為目前的研究熱點。本研究通過在C57BL/6小鼠胰腺癌細胞株Pan02及其相應的裸鼠原位移植胰腺癌中p32的異常膜表達，設計一種新型環形多肽LyP-1(Cys-Gly-Asn-Lys-Arg-Thr-Arg-Gly-Cys)靶向性磁共振—熒光雙模態分子探針，評價小鼠原位胰腺癌的免疫熒光顯像和MR成像效果。

1 材料與方法

1.1 p32在胰腺癌組織和細胞系中的表達

1.1.1 胰腺癌細胞系和細胞培養 小鼠胰腺癌細胞系Pan02購自Frederick國家癌癥研究實驗室(Maryland，美國)，保存于含有10%胎牛血清(fetal bovine serum， FBS)的RPMI 1640(Gibco公司，California，美國)和谷氨酰胺中。小鼠內皮細胞系MS1由中國科學院的樣品培養保藏中心細胞庫提供。所有細胞系均培養于5%CO2的37℃加濕器培養箱中。

1.1.2 建立C57BL/6小鼠原位胰腺癌模型 將15只6～8周齡、體質量18～22 g的雌性C57BL/6小鼠以1%戊巴比妥腹腔注射麻醉。參照Jiang等[4]的方法建立原位胰腺癌荷瘤C57BL/6小鼠模型。局部備皮、消毒后，于腹腔左上部位處行1.5 cm長的縱向切口。將脾臟掀起并暴露胰腺尾部，將含1×106個Pan02細胞的20 μL懸浮液用27號針頭注射器注入胰腺實質，將脾臟和胰腺放回腹腔，并以連續2層絲線縫合封閉腹腔。在1周內每天監測小鼠的術后狀態和傷口愈合情況。

1.1.3 p32蛋白免疫熒光染色 將人胰腺癌、正常胰腺組織、原位小鼠胰腺癌和小鼠正常組織(均購自上海斯萊克實驗動物有限公司)切除后立即放入4%多聚甲醛，浸泡15 min，后放入10%蔗糖溶液中連續浸泡1 h，并在30%蔗糖溶液中浸泡至過夜。將組織放入OCT復合液中，于-20℃冷凍并進行4 μm組織切片。使用以下一抗：兔抗-p32(CST公司，美國)、山羊抗EpCAM(Santa-Cruz公司，美國)、Cy2-耦聯的驢抗兔(Jackson Immuno Research公司，美國)和Cy3-耦聯的驢抗山羊抗體(Jackson Immuno Research公司，美國)。二抗用于在熒光顯微鏡下與一抗交聯發光。DAPI復染用于檢測細胞核位置。

1.1.4 p32表達在細胞系和組織提取的總蛋白和膜蛋白檢測 獲得細胞系并用PBS漂洗2次后，用16 000 G離心力裂解細胞系并測得總蛋白。通過具有原位胰腺癌的C57BL/6小鼠獲得新鮮腫瘤組織、胰腺、心臟、肝、脾、肺、腎，并在裂解液中進行勻漿，再用16 000 G離心力離心并測得總蛋白。使用跨膜蛋白提取試劑盒(Merck公司，德國)提取細胞系和組織的膜蛋白。按照BCA蛋白濃度測定試劑盒所測的蛋白質濃度，將總蛋白和被提取的膜蛋白用SDS-PAGE分離并轉移至PVDF膜。對p32的檢測：采用兔抗-p32(1∶1 000稀釋)的一抗在4℃下孵育過夜，洗膜后加入辣根過氧化氫酶標記的羊抗兔IgG二抗繼續孵育。最后，用增強型ECL發光試劑盒檢測信號。

1.2 LyP-1靶向性磁共振—熒光雙模態分子探針的合成和表征 所有化學試劑在使用前均被進一步純化，實驗中使用去離子水。

1.2.1 Fe3O4@SiO2-FITC@mSiO2探針的合成 根據Liang等[5]的方法合成均勻的磁性探針。將5 ml的磁鐵礦正己烷分散體(約20 mg/mL)通過超聲波處理10 min使其均勻分布。再將10 ml的乙醇與10 ml的曲拉通X-100的混合物加入50 ml的環己烷。后加入0.5 ml氫氧化銨溶液(28%重量濃度比)，以形成穩定的逆微乳液。在連續機械攪拌下加入0.04 ml正硅酸乙酯(tetraethyl orthosilicate， TEOS)，并反應24 h，以形成二氧化硅包被的磁性探針，即Fe3O4@SiO2分散體。同時，將0.02 g的3-氨丙基三乙氧基硅烷(aminopropyltriethoxysilane， APTS)溶解于包含有0.01 g異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate， FITC)的5.0 ml乙醇。在暗箱中攪拌12 h后將所得溶液與TEOS(0.02 ml)一起加入Fe3O4@SiO2分散體，然后將其放于暗處連續反應12 h。對產物經磁分離技術進行純化和分離，用乙醇洗滌3次，并在30℃真空干燥過夜，獲得鑲嵌有FITC的磁性二氧化硅探針，即Fe3O4@SiO2-FITC。收集獲得的Fe3O4@SiO2-FITC@mSiO2探針并在磁性分離的乙醇溶液中洗滌后，重新分散于30 ml乙醇中備用。固體重量約為總重量的0.6%。

圖1 p32在胰腺癌組織和細胞系中的表達 A.人和小鼠的胰腺癌和癌旁胰腺細胞中p32表達的熒光染色(綠色)，同時標有EpCAM(紅色)，細胞核用DAPI復染(藍色)，比例尺為50 mm(×40)； B、C.Western Blot檢測p32總蛋白(B)表達和在提取細胞、組織中的膜蛋白表達(C)

1.2.2 LyP-1在Fe3O4@SiO2-FITC@mSiO2探針上的耦聯 為進一步將功能性LyP-1分子黏附于Fe3O4@SiO2-FITC@mSiO2探針，將0.02 ml γ-巰丙基三乙氧基硅烷(γ-mercaptopropyltriethoxysilane， MPTS)加入20 ml含Fe3O4@SiO2-FITC@mSiO2探針的乙醇分散液(重量濃度比0.6%)。經12 h反應后，被—SH基團(巰基)修飾過的探針經磁場3次分離純化以去除多余的MPTS后，將其分散到乙醇(40 ml)與馬來酰亞胺-LyP-1的化合物中以備進一步反應。將2 ml馬來酰亞胺-LyP-1肽(0.01 g)溶液加入乙醇分散探針溶液，反應6 h。通過離心收集樣品，并用乙醇洗滌3次，于30℃真空干燥，最終獲得Fe3O4@SiO2-FITC@mSiO2-LyP-1探針。

1.2.3 表征 采用BrukerD8高級X線衍射儀，通過Ni過濾Cu-Kα射線(40 kV，40 mA)記錄粉末X線衍射(XRD)圖像。采用Micromeritics ASAP 2420分析儀在77K下測量氮吸附等溫線。在測量前，將探針樣品于50℃下真空脫氣4 h。用布魯諾爾-埃米特-特勒(Bruknoll-Emmett Tler， BET)方法在吸附數據c表面積為0.05至0.35內計算特定網絡連接中的相對壓力范圍。通過Barrett-Joyner-Halenda(BJH)模型，在相對壓力P/P0為0.992時由吸附量估計總孔體積，計算來自等溫線的吸附分支的孔體積和孔徑分布。在200 kV下操作JEOL 2011透射電子顯微鏡拍攝探針圖像。將探針樣品首先分散于乙醇中，而后用覆碳銅柵進行分析。在20 kV時采用Philips XL30電子顯微鏡，記錄掃描電子顯微鏡(scanning electron microscope， SEM)圖像。在細金屬薄膜上噴涂探針樣品，以激光共聚焦顯微鏡拍攝玻片上Fe3O4@SiO2-FITC@mSiO2樣品的熒光圖像，激發波長為480 nm，發射波長的濾色片為515～565 nm。采用Vario ELⅢ元素分析儀測量C、H、N和S元素的含量。

1.3 與細胞系結合的探針數量測算 將Pan02及MS1細胞以1×106個/孔接種于6孔板，每孔加入2 ml完全培養基。過夜培養使細胞融合后，更換新鮮的細胞培養基，其中含有單一PBS、Fe3O4@SiO2-FITC@mSiO2-LyP-1或Fe3O4@SiO2-FITC@mSiO2(并按照梯度濃度5、10、20、40、80 μg/ml配制)。再次培養4 h，去除培養基。PBS洗滌細胞3次后用胰蛋白酶處理，2%多聚甲醛固定、離心，并懸浮于1 ml PBS中。采用Becton Dickinson FACS Calibur流式細胞儀分析進行檢測，每個濃度設置3個重復測量。

1.4 細胞系的體外MRI 對6孔板濃度梯度培養的Fe3O4@SiO2-FITC@mSiO2-LyP-1或Fe3O4@SiO2-FITC@mSiO2探針細胞系(5、10、20、40 μg/ml)進行消化、離心后，細胞懸浮于1%的瓊脂糖。采用Siemens Magnetom Trio 3.0T MR掃描儀，八陣列環形線圈。掃描序列與參數：T2WI，TE 13.8 ms，TR 4 000 ms，層厚2 mm，層間距1 mm，FOV 120 mm×120 mm，矩陣128×128，NEX 1。

圖2 磁共振-熒光雙模態分子探針的形態特征 A.透射電子顯微鏡圖像； B.掃描電子顯微鏡圖像 圖3 流式細胞術和體外磁共振成像的分析 A.平均熒光強度的比較； B.Pan02和MS1細胞與不同濃度的探針溫育后的T2WI信號變化 (1：Pan02+Fe3O4@SiO2-FITC@mSiO2-LyP-1； 2：Pan02+Fe3O4@SiO2-FITC@mSiO2； 3：MS1+Fe3O4@SiO2-FITC@mSiO2-LyP-1； 4：MS1+Fe3O4@SiO2-FITC@mSiO2)

1.5 C57BL/6小鼠全身給藥后觀察探針在原位胰腺癌組織內的分布 對原位胰腺癌荷瘤C57BL/6小鼠于建模3周后腹腔注射1%戊巴比妥鈉(70 mg/kg體質量)，經尾靜脈注射含Fe3O4@SiO2-FITC@mSiO2-LyP-1或Fe3O4@SiO2-FITC@mSiO2探針的分散PBS(鐵濃度0.1 mM)，共0.2 ml。4 h后，處死12只小鼠，并同時切除腫瘤、胰腺、肝、脾、腎、心、肺，固定、切片(厚度4 μm)，熒光顯微鏡下觀察。

1.6 C57BL/6小鼠原位胰腺腫瘤的體內MR成像 麻醉剩余的3只小鼠模型，進行MR掃描。經尾靜脈注入含Fe3O4@SiO2-FITC@mSiO2-LyP-1或Fe3O4@SiO2-FITC@mSiO2探針的PBS 0.2 ml(鐵濃度0.1 mM)。掃描序列與參數：T2WI，TR 2 000 ms，TE 22.5 ms，層厚1 mm，層間距1 mm，FOV 120 mm×120 mm，矩陣256×160，NEX 1。在Fe3O4@SiO2-FITC@mSiO2-LyP-1或Fe3O4@SiO2-FITC@mSiO2探針注射前、注射后1、2、4、24 h獲取MR圖像。

2 結果

2.1 p32在胰腺癌組織和細胞系中的表達 p32蛋白在C57BL/6衍生的胰腺癌細胞系和其相應的腫瘤組織中有表達。免疫組化染色可見胰腺癌組織中的p32蛋白表達；標記的EpCAM可區分癌細胞與基質細胞。多數p32表達細胞為上皮來源(EpCAM雙陽性染色)，少數表皮細胞來源于間質細胞，見圖1A。

蛋白免疫印跡結果顯示，小鼠胰腺癌細胞系Pan02和小鼠內皮細胞系MS1的總蛋白p32表達量相同，而Pan02膜表面的p32含量高于MS1。在腫瘤組織提取的膜蛋白中p32的表達水平也高于荷瘤C57BL/6小鼠正常器官中的相應部位，而在腫瘤組織和正常組織的全蛋白中p32表達水平相似，見圖1B。

2.2 LyP-1靶向性磁共振-熒光雙模態分子探針的特征 多功能探針表示為Fe3O4@SiO2-FITC@mSiO2,平均直徑45 nm且具有良好的核-殼結構(圖2A)。投射電子顯微鏡(transmission electron microscopy， TEM)圖像可見暗的磁芯被灰色多孔二氧化硅殼包圍，且孔隙直徑約2.0 nm(圖2A)。SEM圖像顯示多功能核-殼探針均有良好的分散性，其平均直徑約45 nm，與TEM結果一致(圖2B)。

2.3 流式細胞術測定和體外MR成像 與Fe3O4@SiO2-FITC@mSiO2-LyP-1探針共同培養4 h后，Pan02細胞平均熒光強度急劇增加(即使濃度低至5 μg/ml)，見圖3A。隨濃度的增加，熒光強度略有增加，達平臺期的濃度為40 μg/ml。而非靶向Fe3O4@SiO2-FITC@mSiO2探針培養的Pan02細胞的熒光強度僅為LyP-1探針培養的50%左右。

隨Fe3O4@SiO2-FITC@mSiO2-LyP-1探針濃度增加，Pan02的T2WI信號明顯減低，即越來越多的磁性探針與Pan02細胞結合。而Pan02細胞與Fe3O4@SiO2-FITC@mSiO2共培養后并未觀察到明顯的MR對比度變化，即兩者結合不佳。MS1細胞組中無明顯信號減低(圖3B)。

2.4 多功能探針在帶有原位胰腺癌的C57BL/6小鼠系統給藥后的組織分布 在注射Fe3O4@SiO2-FITC@mSiO2-LyP-1探針的小鼠腫瘤組織中有FITC標記的探針積聚。雖然探針呈不均勻分布，但其分布與p32蛋白高度重疊。除幾個粗熒光顆粒殘留在肝臟和脾臟，在心臟、肺或腎中幾乎均未檢測到熒光探針。在注射Fe3O4@SiO2-FITC@mSiO2探針的荷瘤C57BL/6小鼠中，因缺乏高度分散的探針和腫瘤細胞的特異性相互作用，在腫瘤組織中無明顯的熒光探針積累(圖4)。

2.5 體內MRI 比較Fe3O4@SiO2-FITC@mSiO2-LyP-1探針給藥前后的T2WI信號發現，給藥后1 h在腫瘤區域的T2WI信號逐漸減少，4 h達到最低強度。即使在給藥24 h后，由于二氧化硅殼的保護，磁性探針的穩定性仍良好，腫瘤區域的信號降低仍然存在(圖5)。在注入Fe3O4@SiO2-FITC@mSiO2探針的小鼠腫瘤組織中未觀察到明顯的MRI信號變化。

3 討論

本研究表明特有的p32蛋白在C57BL/6衍生的胰腺癌細胞系和其相應的腫瘤組織中均有表達，且p32在小鼠C57BL/6原位胰腺癌中的表達遠多于其在癌旁胰腺組織中的表達。

在磁性探針的二氧化硅殼中摻入FITC有利于體外利用流式細胞術定量研究功能性探針與細胞的結合[6-7]。本研究結果證實，即使被固定于多功能探針的表面，LyP-1也可以特異結合Pan02細胞。由于MS1缺乏p32的表達，無論探針是否與LyP-1肽連接，MS1幾乎不能捕獲探針，產生的熒光強度也非常低。基于熒光標記和P32受體免疫組化染色，本研究表明LyP-1與其相應的p32受體結合具有高度靶向性。

MRI強度主要由探針的濃度決定[6-11]。本研究中，采用MRI用于研究測量Pan02和MS1細胞與不同濃度的探針孵育后的T2WI信號變化，體內實驗進一步證實超微超順磁性Fe3O4@SiO2-FITC@mSiO2-LyP-1探針因其具有超順磁性，可用于MR成像，且耦聯的LyP-1可實現其在胰腺癌的高度靶向性，從而在分子水平上實現MR成像。

本研究發現p32在小鼠胰腺癌細胞系Pan02及其同系原位移植瘤中膜異常表達。p32配體(LyP-1)與FITC標記的磁性介孔二氧化硅探針結合，可精確檢測胰腺癌，為設計多功能LyP-1耦聯的探針用于胰腺癌的早期診斷奠定了基礎。此外，本研究胰腺癌模型建立于有免疫活性的C57BL/6小鼠，相信LyP-1耦聯的磁性探針也可為胰腺癌免疫治療的研究提供新的思路。

圖4 多功能探針在帶有原位胰腺癌的C57BL/6小鼠系統給藥后的組織分布(×200) A.被注射Fe3O4@SiO2-FITC@mSiO2-LyP-1探針的小鼠; B.被注射Fe3O4@SiO2-FITC@mSiO2探針的荷瘤C57BL/6小鼠

圖5 MRI比較載有胰腺癌的C57BL/6小鼠給藥前后T2WI信號的變化 A.注入Fe3O4@SiO2-FITC@mSiO2-LyP-1探針后即刻(A)、1 h(B)、2 h(C)、4 h(D)、24 h(E)；注入Fe3O4@SiO2-FITC@mSiO2探針后即刻(F)、1 h(G)、2 h(H)、4 h(I)、24 h(J)

[1] Siegel R, Naishadham D, Jemal A. Cancer statistics, 2013. CA Cancer J Clin, 2013,63(1):11-30.

[2] Paulson AS, Tran Cao HS, Tempero MA, et al. Therapeutic advances in pancreatic cancer. Gastroenterology, 2013,144(6):1316-1326.

[3] Liu Y, Hughes TC, Muir BW, et al. Water-dispersible magnetic carbon nanotubes as T2-weighted MRI contrast agents. Biomaterials, 2014,35(1):378-386.

[4] Jiang Y, Liu S, Zhang Y, et al. Magnetic mesoporous nanospheres anchored with LyP-1 as an efficient pancreatic cancer probe. Biomaterials, 2017,115:9-18.

[5] Liang X, Wang X, Zhuang J, et al. Synthesis of nearly monodisperse iron oxide and oxyhydroxide nanocrystals. Advanced Functional Materials, 2006,16(14):1805-1813.

[6] Li J, Zheng L, Cai H, et al. Polyethyleneimine-mediated synthesis of folic acid-targeted iron oxide nanoparticles for in vivo tumor MR imaging. Biomaterials, 2013,34(33):8382-8392.

[7] Li X, Li H, Yi W, et al. Acid-triggered core cross-linked nanomicelles for targeted drug delivery and magnetic resonance imaging in liver cancer cells. Int J Nanomedicine, 2013,8:3019-3031.

[8] Yang L, Mao H, Wang YA, et al. Single chain epidermal growth factor receptor antibody conjugated nanoparticles for in vivo tumor targeting and imaging. Small, 2009,5(2):235-243.

[9] Guo Q, Liu Y, Xu K, et al. Mouse lymphatic endothelial cell targeted probes: Anti-LYVE-1 antibody-based magnetic nanoparticles. Int J Nanomedicine, 2013,8:2273-2284.

[10] Zhang L, Gong F, Zhang F, et al. Targeted therapy for human hepatic carcinoma cells using folate-functionalized polymeric micelles loaded with superparamagnetic iron oxide and sorafenib in vitro. Int J Nanomedicine, 2013,8:1517-1524.

[11] Cheng Z, Dai Y, Kang X, et al. Gelatin-encapsulated iron oxide nanoparticles for platinum (Ⅳ) prodrug delivery, enzyme-stimulated release and MRI. Biomaterials, 2014,35(24):6359-6368.

MR-fluorescentdual-modalitymolecularprobesanchoredwithLyP-1forpancreaticcancer

SHIZhang1,SONGChang'en1,SHIRuifeng1,LUJianping1,DENGYonghui2*,JIANGTao1*
(1.DepartmentofRadiology,ChanghaiHospital,theSecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai200433，China； 2.DepartmentofChemistry,FudanUniversity,Shanghai200433，China)

ObjectiveTo construct the LyP-1 targeted MR fluorescence dual-modality molecular probe for pancreatic cancer, and to observe its features and MRI charicteristics.MethodsThe 50 nm MR-fluorescent dual-modality molecular probe with surface modified with cyclic nine-amino acid peptide LyP-1 (Cys-Gly-Asn-Lys-Arg-Thr-Arg-Gly-Cys) was rationally designed. Whether the molecular probe could specifically recognize the pancreatic cancer cells were validated by the combination of fluorescent imaging and MR T2WI.ResultsThe new MR-fluorescent dual-modality molecular probe anchored with LyP-1 could be used for the fluorescent imaging and MR T2WI of pancreatic cancer in mouse. And the molecular probe was demonstrated to be effective in conjugating with pancreatic cancer cells on fluorescent images and caused obvious MR signal reduction under T2 relaxometry in vitro. In vivo experiment, the molecular probe could be used for fluorescent labeling tumor tissue and detecting orthotopic pancreatic cancer in C57BL/6 mouse as MR contrast agent.ConclusionThe LyP-1 immobilized MR-fluorescent dual-modality molecular probe can actively target to mouse orthotopic xenograft of pancreatic cancer, which is hopeful to the application in early probing and diagnosis of pancreatic cancer by multimodal imaging.

Pancreatic neoplasms; Molecular probe; Dual-modality; Magnetic resonance imaging; Fluorescent imaging

10.13929/j.1003-3289.201704043

R-332; R445.2

A

1003-3289(2017)10-1447-06

國家自然科學基金(81402680、81371551)、長海醫院1255科學創新基金(CH125541000)。

史張(1987—)，男，陜西渭南人，在讀碩士。研究方向：分子影像及血管成像。E-mail： shizhang2080007@126.com

鄧勇輝，復旦大學化學系，200433。E-mail： yhdeng@fudan.edu.cn 蔣濤，第二軍醫大學附屬長海醫院放射科，200433。E-mail： laijiangtaotao@ 163.com

2017-04-10

2017-08-03