紅景天苷對乳鼠缺氧/復氧心肌細胞及線粒體損傷的保護作用*

田 心 王淵博 馮嘉豪 劉超峰

（1.陜西省中醫醫院，陜西 西安710003；2.第四軍醫大學基礎醫學部生理學教研室，陜西 西安710032）

紅景天苷對乳鼠缺氧/復氧心肌細胞及線粒體損傷的保護作用*

田 心1，2王淵博2馮嘉豪2劉超峰1△

（1.陜西省中醫醫院，陜西 西安710003；2.第四軍醫大學基礎醫學部生理學教研室，陜西 西安710032）

目的觀察紅景天苷對乳鼠缺氧/復氧后心肌細胞及線粒體損傷的保護作用并探討其機制。方法將乳鼠心肌細胞分為對照組、對照加紅景天苷組、缺氧/復氧組、缺氧/復氧加紅景天苷組，分別用CCK8試劑盒檢測細胞活力，流式細胞儀檢測細胞凋亡、線粒體膜電位情況，激光共聚焦顯微鏡觀察細胞線粒體形態，并采用蛋白免疫印跡〔Western blot〕法分別檢測線粒體和胞漿細胞色素C（Cytochrome C）蛋白的表達。結果紅景天苷能使缺氧/復氧心肌細胞凋亡減少，增加細胞活力，升高線粒體膜電位，減少線粒體分裂，減少線粒體細胞色素C的釋放，實現缺氧/復氧心肌細胞及線粒體損傷的保護作用。結論紅景天苷可減輕心肌細胞缺氧/復氧損傷，減少心肌細胞的凋亡，保護心肌細胞線粒體功能。

紅景天苷 缺氧/復氧損傷 線粒體 保護作用

心肌缺血再灌注誘導的損傷是急性心肌梗死溶栓和介入治療的過程中經常伴隨的一種病理、生理過程，其損傷機制復雜沒有明確的治療方法[1-2]。近年來，中藥紅景天的一些有效成分對其作用的機制研究較多，相關證據[3-4]顯示紅景天苷對在體和離體心肌有明確的保護作用，并有抗氧化應激損傷的效果。本研究擬在細胞水平模擬心肌缺血再灌注損傷建?；A上，通過細胞活性和凋亡的測定探討紅景天苷的保護作用。現報告如下。

1 材料與方法

1.1材料

H9C2（2-1）大鼠胚胎心肌細胞，購自中科院上海生命科學研究院；1～3 d日齡的SD乳鼠，第四軍醫大學實驗動物中心提供。高糖DMEM培養液購自美國Gibco公司，胎牛血清購自美國Gibco公司，Ⅱ型膠原酶、胰蛋白及酶基質膠與Mdivi-1購自美國Sigma公司；JC-1試劑盒，小鼠抗β-actin、兔抗Cytochrome C抗體購自美國abcam公司；MitoTracker-Red熒光探針購自碧云天公司；CCK8試劑盒購自上海貝博生物公司；流式細胞儀為美國BD Immunocytometry Systems產品；酶標儀為美國Molecular Devises公司；電泳系統及凝膠成像系統均為Bio Rad公司產品；紅景天苷購于中國藥品生物制品檢定所，藥品純度≥98.0%（HPLC），藥品批號：110818-201206。

1.2方法

1.2 .1 H9C2（2-1）大鼠胚胎心肌細胞系的培養[5]將含10%胎牛血清的高糖培養基的培養液孵育細胞，當細胞生長至互相接近時，用胰酶消化按照1∶3～1∶5開始傳代，在實驗前1 d，更換為含2%胎牛血清的培養基，使其向心肌細胞分化。

1.2 .2心肌細胞的分離培養和鑒定[5]無菌條件下取1～3 d SD乳鼠心臟，剪碎，加入含1.0 g/L的膠原酶消化液中，3～5min 37℃水浴中反復吹打后棄上清液，沉淀中再加消化液，再于37℃水浴中3～5 min，反復吹打后取上清液，置于含100 mL/L的高糖培養基中（加100U/mL青霉素及0.1mg/mL鏈霉素）。重復以上操作，離心后取沉淀重懸于培養基中，差速貼壁90～120min，將細胞懸液移至培養皿中，間斷觀察細胞形態，必要時換液，若由圓形變成不規則形或梭狀，由靜止變為有規律地收縮時進行實驗。

1.2 .3建立缺氧/復氧模型 將培養的心肌細胞置于37℃缺氧孵箱內孵育3 h，即為模擬缺血。更換正常培養液，37℃5%CO2孵箱內復氧2 h即為模擬再灌注處理組給藥選擇在復氧階段，紅景天苷給藥濃度為5μmol/L[6]。

1.2 .4試驗分組 將心肌細胞分為對照組、對照加紅景天組，缺氧/復氧組、缺氧/復氧加紅景天苷組，對照組及缺氧/復氧組給予等體積的無菌PBS溶液。

1.2 .5細胞活力檢測 將心肌細胞均勻接種于96孔板中，每孔加培養液100μL，同時設置空白孔，置于37℃5%CO2孵箱中過夜，按照前述實驗分組進行缺氧造模，統一在復氧時進行給藥，復氧結束后各組細胞每孔加入10μL CCK-8溶液，37℃孵育1～2 h，酶標儀450 nm下依據吸光度測定各孔吸光值，細胞活力=（OD實驗孔-OD空白孔）/（OD對照孔-OD空白孔）×100%，結果為細胞活力的比率（相對于常氧對照組）。

1.2 .6流式法檢測心肌細胞的細胞凋亡率 將心肌細胞均勻接種于直徑6 cm培養皿中，前述缺氧、復氧操作同上，給藥復氧結束后，將所有各組培養皿中的細胞消化下來重懸于15mL離心管中低速離心3min后棄上清液，無菌PBS液加入重懸，再次低速離心后棄上清液，將沉淀細胞移至流式專用管中，加入10μL的FITC-conjugated-Annexin V和5μL的碘化吡啶（PI），搖勻后室溫下避光反應15 min，經流式細胞儀檢測。

1.2 .7流式法檢測心肌細胞線粒體膜電位 將心肌細胞均勻接種于6孔板中，前述缺氧、復氧操作同上，給藥復氧結束后，按照JC-1試劑盒規范操作，將培養板中的細胞消化下來重懸于15mL離心管中低速離心3 min后棄上清液，無菌PBS液洗滌1遍后，加入JC-1工作液染色，于37℃恒溫箱中避光反應30 min后，再次用無菌PBS液洗滌1遍后，將沉淀細胞移至流式專用管中，經流式細胞儀分析檢測。

1.2 .8激光共聚焦顯微鏡觀察 將培養傳代后的細胞鋪于激光共聚焦皿中，進行處理同上，將無水DMSO溶劑配置MitoTracker-Red為100μmol/L的工作液，然后按照1 mL培養基加入1μL的工作液進行線粒體染色，37℃細胞培養箱內孵育30 min，立即用激光共聚焦顯微鏡觀察細胞線粒體形態。

1.2 .9蛋白免疫印跡（Western blot）法檢測Cytochrome C蛋白在線粒體及胞漿中的表達 心肌細胞經過處理后由線粒體/胞漿蛋白提取試劑盒提取蛋白，并進行蛋白定量，用SDS-PAGE進行電泳，并將其轉膜到硝酸纖維素 （NC）膜上，100 g/L的脫脂牛奶室溫封閉1 h后，滴加1∶1000的抗Cyto C和β-actin一抗孵育過夜，PBST洗膜（5 min×5次），再用1∶5000的辣根過氧化物酶（HRP）標記的二抗室溫孵育1 h，再次洗膜（5 min×5次），后于膜上滴加顯影液，進入發光儀器后曝光后觀察結果，并利用該系統軟件對目的條帶進行分析獲取統計數據。

1.3統計學處理

2 結 果

2.1紅景天苷對心肌細胞缺氧/復氧損傷的影響

見表1。與對照組比較，缺氧/復氧組細胞活力明顯降低（P＜0.01）；與缺氧/復氧組比較，缺氧/復氧加紅景天苷組細胞活力明顯提升（P＜0.01）。

表1 各組心肌細胞活力、心肌細胞凋亡、心肌細胞線粒體膜電位及心肌細胞線粒體及胞漿的Cytochrome C表達的比較（±s）

表1 各組心肌細胞活力、心肌細胞凋亡、心肌細胞線粒體膜電位及心肌細胞線粒體及胞漿的Cytochrome C表達的比較（±s）

與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與缺氧復氧組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

組 別 細胞活力比率 灰度比值（Mito/Cyto）細胞凋亡率（%） 相對紅染率（%）對照組0.99±0.01 2.07±0.15對照加紅景天苷組0.99±0.01 1.93±0.12缺氧/復氧組0.56±0.04**0.46±0.04*4.52±0.49 98.00±1.00 4.80±0.30 96.33±1.53 39.80±3.48**68.33±2.52**缺氧/復氧加紅景天苷組0.87±0.03△△1.43±0.15△15.13±2.40△△88.33±2.52△△

2.2紅景天苷對心肌細胞缺氧/復氧凋亡的影響

見圖1，表1。與對照組比較，缺氧/復氧組細胞凋亡率明顯增高（P＜0.01）；與缺氧/復氧組比較，缺氧/復氧加紅景天苷組細胞凋亡率明顯降低（P＜0.01）。

2.3紅景天苷對心肌細胞線粒體的膜電位的影響

圖1 心肌細胞凋亡圖

見圖2，表1。與對照組比較，缺氧/復氧組細胞線粒體膜電位明顯下降（P＜0.01）與缺氧/復氧組比較，缺氧/復氧加紅景天苷組細胞線粒體膜電位明顯上升（P＜0.01）。

圖2 心肌細胞線粒體膜電位圖

2.4紅景天苷對缺氧/復氧心肌細胞線粒體分裂的影響

見圖3，表1。激光共聚焦顯微鏡觀察細胞線粒體，對照組、對照加紅景天苷組線粒體呈網管狀結構，而缺氧復氧組細胞線粒體呈點狀、碎片化，提示分裂增加；對比缺氧/復氧組，缺氧/復氧加紅景天苷組的分裂明顯減少。

圖3 紅景天苷對心肌細胞線粒體形態的影響（600倍）

2.5紅景天苷對心肌細胞線粒體內Cytochrome C表達的影響

見圖4，表1。與對照組比較，缺氧/復氧組細胞線粒體內Cytochrome C表達降低，而胞漿內Cytochrome C表達升高（P＜0.05）；與缺氧/復氧組比較，缺氧/復氧加紅景天苷組的線粒體內Cytochrome C表達升高，而胞漿內Cytochrome C表達降低（P＜0.05）。

3 討 論

圖4 心肌細胞線粒體及胞漿的Cytochrome C表達電泳條帶

急性心梗是由于冠脈斑塊破裂入血阻塞血管引發，過程往往伴隨著缺血/再灌注損傷心肌細胞，而線粒體為細胞能量代謝保證有效供氧、ATP，以及有效的離子交換，線粒體結構和功能的改變對心血管系統的生理和病理起著關鍵作用[7]。線粒體膜電位是由內膜兩側質子及其他離子的不對稱分布而形成，在缺血再灌注時，氧化磷酸化功能障礙，在此過程中，可伴隨線粒體裂解增加，DNA碎片化，線粒體膜電位升高，線粒體膜通透孔開放，并釋放細胞色素C從線粒體進入細胞質[8]。如何有效采用藥物干預保護心肌細胞線粒體，減少心肌細胞的損傷是心血管領域研究的熱點?；谝陨显?，本研究通過細胞活性、凋亡、線粒體膜電位、線粒體形態學改變以及細胞色素C蛋白表達水平的測定，證實了紅景天苷具有減輕缺氧/復氧導致的心肌細胞線粒體損傷，實現抗心肌細胞損傷的保護作用。

傳統中藥紅景天的有效活性成分為紅景天苷，紅景天苷是一種苯乙醇類化合物，心血管系統藥理研究較多[9]。其具有抗缺氧、抗疲勞、抗衰老等功效，亦在神經系統、內分泌系統等疾病方面具有顯著的療效[10-11]。龍怡等研究發現紅景天在心肌細胞中有明顯抗缺氧作用，其5種單體成分對缺氧缺糖心肌細胞損傷具有明顯的保護作用，與上調HIF-1αmRNA的表達有關[12]。付金容等證實在慢性間斷性缺氧中，紅景天苷通過減少凋亡相關因子的表達，抑制Caspase-3的活性，從而保護心功能[13]。朱寧等認為紅景天苷對缺氧誘導心肌細胞損傷具有保護作用，與其減輕氧自由基損傷及提高肌漿網鈣泵活性有關[14]。

線粒體呼吸氧化過程是轉換底物的氧化還原勢能為質子電化學勢能，質子電化學勢能再轉為ATP的高磷酸鍵的過程[15]。其呼吸氧化過程伴隨著膜電位的除極和復極，最早被發現用來染線粒體的染色劑是rhodamine 123（Rh 123），能被活細胞攝取，與膜電位成正比，之后陸續出現各種染色劑，如MitoTracker系列染料等，此類熒光染料常用于需要固定的情況，如免疫細胞化學、TUNEL染色等，而JC-1被認為對線粒體膜電位具有較高的敏感性和辨識度，其特性是490 nm激發光則為綠色，隨著膜電位上升，590 nm激發光時則為橙色，因此，JC-1是電壓依賴性熒光染料，能夠用流式細胞儀或熒光顯微鏡做定性定量分析[16]。

本研究采用體外心肌細胞缺氧/復氧模擬心肌缺血再灌注損傷，從細胞水平觀察紅景天苷能否抑制缺氧復氧心肌細胞損傷，并對心肌細胞線粒體產生保護作用，可見紅景天苷對缺氧復氧所致心肌細胞損傷、凋亡具有抑制作用，并闡述紅景天苷能夠維持缺氧復氧心肌細胞線粒體膜電位、抑制線粒體分裂。Western blot結果顯示，紅景天苷能夠抑制細胞色素C的釋放，升高線粒體內細胞色素C的濃度，減少胞漿中細胞色素C的濃度這可能跟其有效減少線粒體膜通透孔的開放的機制有關，表明紅景天苷能夠保護缺氧復氧心肌細胞線粒體功能。但其調控的具體信號通路，是如何抑制缺血再灌注損傷心肌細胞損傷，實現保護線粒體作用，有待于進一步研究。

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Protective Effects of Salidroside in Cardiomyocyte and Mitochondria Injury Induced by Hypoxia/Reoxygenation

TIAN Xin，WANG Yuanbo，FU Feng，et al.Department of Cardiology，Traditional Chinese Medical Hospital of Shanxi Province，Shanxi，Xian 710003，China.

Objective：To study the protective effects of Salidroside in cardiomyocyte and mitochondria induced by hypoxia/reoxygenation.Methods：Cardiomyocyte were divided into the control group，the control and Salidroside group，hypoxia/reoxygenation group，hypoxia/reoxygenation and Salidroside group.Cell viabilitieswere detected by cell counting kit（CCK-8）；apoptotic cells were detected by flow cytometry；mitochondria membrane potentials were measured by JC-1 kit.The morphology of cell mitochondria was observed by laser scanning confocal microscopy.The expression of cytochrome C protein in mitochondria and cytoplasm was detected with Western blot.ResultsSalidroside could decrease hypoxia/reoxygenation myocardial cells apoptosis，increase cell viability，increase mitochondrial membrane potential，reduce mitochondrial fission，reduce mitochondrial cytochrome C release and protect cardiomyocyte and mitochondria against hypoxia/reoxygenation injury.Conclusions：Salidroside can alleviate hypoxia/reoxygenation injury，reduce cardiomyocyte apoptosis and protect cell mitochondrial function.

Salidroside；Hypoxia/reoxygenation injury；Mitochondria；Protective effect

R285.5

A

1004-745X（2017）10-1714-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2017.10.007

陜西省科技統籌創新工程計劃項目（2016KTZDSF01-03-02）

△通信作者（電子郵箱：Liu.reld@aliyun.com）

2017-06-15）