穴位埋線對缺血再灌注損傷高脂血癥合并2型糖尿病大鼠心肌保護作用的機制研究

王一茗，張新昕，束彥頁

·論著·

·中醫·中西醫結合研究·

穴位埋線對缺血再灌注損傷高脂血癥合并2型糖尿病大鼠心肌保護作用的機制研究

王一茗1*，張新昕2，束彥頁1

目的探討穴位埋線對缺血再灌注損傷高脂血癥合并2型糖尿病(ZDF)大鼠心肌保護作用的機制，為臨床治療提供理論依據。方法2015年1月—2016年5月選取ZDF大鼠24只，隨機分為對照組、缺血再灌注組、缺血預處理組和穴位埋線組，每組6只。適應性飼養1周后第7天，對照組直接開胸取材，其余3組均結扎冠狀動脈左前降支，建立缺血再灌注損傷模型。缺血再灌注組缺血30 min，再灌注60 min；缺血預處理組缺血5 min、再灌注5 min，重復3次，之后操作同缺血再灌注組；穴位埋線組在適應性飼養1周后第1天，“內關”“膻中”“心俞”穴進行穴位埋線，之后操作同缺血再灌注組。采用透射電鏡觀察各組ZDF大鼠心肌組織超微結構及自噬水平，Western blotting法檢測心肌內質網應激相關蛋白葡萄糖調節蛋白78(GRP78)、自噬相關蛋白Beclin-1水平，酶聯免疫吸附實驗(ELISA)法檢測髓過氧化物酶(MPO)、丙二醛(MDA)水平。結果透射電鏡下對照組線粒體和心肌細胞形態結構正常，未見明顯自噬體；缺血再灌注組線粒體和心肌細胞腫脹明顯，細胞膜破裂、內容物泄漏，僅見空泡或空腔及少量自噬泡；缺血預處理組、穴位埋線組與缺血再灌注組相比，心肌細胞超微結構損傷較輕，且自噬泡數量明顯增多；缺血再灌注組心肌細胞超微結構破壞最為嚴重，且未見明顯自噬泡。缺血再灌注組、缺血預處理組、穴位埋線組GRP78、Beclin-1、MPO、MDA水平高于對照組(P<0.05)；缺血預處理組、穴位埋線組GRP78、Beclin-1水平高于缺血再灌注組，但MPO、MDA水平低于缺血再灌注組(P<0.05)。結論穴位埋線可能通過促進GRP78、Beclin-1水平升高，進而起到對再灌注損傷心肌的保護作用。

再灌注損傷；大鼠；內質網應激；自噬；缺血預處理,心肌；穴位埋線

王一茗，張新昕，束彥頁.穴位埋線對缺血再灌注損傷高脂血癥合并2型糖尿病大鼠心肌保護作用的機制研究[J].中國全科醫學，2017，20(30)：3776-3780.[www.chinagp.net]

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心肌梗死為全球范圍內患者的主要致死原因之一，心肌急性且持續性的缺血缺氧，會嚴重損傷心肌。心肌梗死面積的大小關系患者的預后，及時有效的再灌注、恢復心肌血供、縮小梗死面積，是心肌梗死的治療目標。然而，再灌注過程十分復雜，常伴隨一些適應性調控機制的作用，如內質網應激(ERS)及自噬等，是學者們一直關注的焦點[1]。

ERS是自噬的重要調控通路[2-3]。ERS與自噬作為細胞對損傷刺激的適應性反應，維持著細胞內環境穩態。ERS時未折疊蛋白反應激活自噬，而自噬則通過降解錯誤折疊或未折疊的蛋白來減輕內質網負荷，從而抑制ERS的過度激活[1]。

針灸預處理可發揮內源性保護作用，從而減輕因缺血再灌注對心肌造成的損傷[4-5]。自噬可保護再灌注損傷心肌[6]。ERS與自噬關系密切，存在交互效應。本研究通過制備心肌缺血再灌注損傷模型，觀察ERS通路相關蛋白-葡萄糖調節蛋白78(GRP78)及自噬相關蛋白Beclin-1的表達情況，探討穴位埋線對缺血再灌注損傷心肌的保護作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 Beclin-1、GRP78(Abcam公司)；髓過氧化物酶(MPO)、丙二醛 (MDA)試劑盒(DECQ上海慧穎生物科技公司)，其余試劑(如Tris-base、Tween-20、Western專用脫脂奶粉、過硫酸銨粉、甘氨酸G7126、SDS粉末、甲醇、甲叉雙丙烯酰胺、TEMED、Western bloting及缺血預處理裂解液、PMSF、20XTBS、PVDF膜等)購自Sigma公司，實驗動物由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供〔動物許可證編號SCXK(京)2012-0001〕。

1.2 實驗分組及模型制備 研究時間：2015年1月—2016年5月。

SPF級雄性高脂血癥合并2型糖尿病(ZDF)大鼠24只，8周齡，體質量220～230 g，在SPF級實驗環境適應性飼養1周，使用符合國家標準及有生產許可的誘導飼料Purina#5008，飲用無菌過濾水，空氣凈化度10 000級，氨濃度<14 mg/m2，相對濕度40%，溫度22～25 ℃，噪聲低于50 dB。本實驗符合《實驗動物管理條例》。將ZDF大鼠隨機分為對照組、缺血再灌注組、缺血預處理組和穴位埋線組，每組6只。

本文創新點：

(1)首次深入觀察穴位埋線法對高脂血癥合并2型糖尿病(ZDF)大鼠心肌缺血再灌注損傷的影響及內質網應激(ERS)-自噬機制；(2)選用ZDF大鼠作為實驗動物更接近臨床實際。

適應性飼養1周后第7天，對照組不做任何處置，直接開胸取材；其余3組制備缺血再灌注損傷模型：10%水合氯醛(0.4 ml/100 g)腹腔注射，仰臥位固定，剪毛后氣管插管，連接小動物呼吸機，開胸并暴露心臟，剪開心包，冠狀動脈左前降支位于心耳下緣約0.15 cm，繞左前降支穿線，線兩端同時穿過聚乙烯小管形成閉環，監測導聯變化，S-T段發生顯著(超過0.1 mv為顯著)抬高為缺血成功，S-T段下降1/2以上為再灌注成功。缺血再灌注組：缺血30 min，再灌注60 min。缺血預處理組：缺血5 min、再灌注5 min，反復3次，之后操作同缺血再灌注組。穴位埋線組：適應性飼養1周后第1天對“內關”“膻中”及“心俞”進行穴位埋線，之后操作同缺血再灌注組。各組造模成功后取心肌組織-80 ℃保存備用。

1.3 實驗方法

1.3.1 透射電鏡觀察心肌組織超微結構及自噬水平 沿肌纖維走向取左心室前壁心肌，將標本切成(1×1×1)mm3大小。經預固定、再固定、逐級脫水、包埋、切片等步驟，透射電鏡下觀察心肌組織超微結構及自噬水平。

1.3.2 Western blotting法檢測GRP78、Beclin-1水平 分別于各組心肌組織滴入其體積3倍量的組織裂解液，0 ℃研磨成組織勻漿，靜置10 min；經低溫(4 ℃)15 000 r/min離心10 min(離心半徑10 cm)；滴入蛋白上樣緩沖液后，置于沸水中5 min。用BCA法定量蛋白濃度。滴入相同劑量2×SDS上樣緩沖液，95 ℃靜置5 min。孔板每孔加40 μg胞質蛋白，用12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離，低溫恒壓轉膜，用5%脫脂奶粉25 ℃下封膜后靜置2 h，加入兔抗鼠抗(1∶500)或內參GAPDH(1∶800)一抗，4 ℃靜置12 h后洗膜，用辣根過氧化酶標記的羊抗兔Ig G (1∶5 000) 25 ℃靜置1 h；經漂洗后電化學發光法(ECL)常規顯影。用Gelpro4.0凝膠光密度分析軟件進行分析，以目的條帶灰度/內參條帶灰度比值表示GRP78、Beclin-1水平。

1.3.3 酶聯免疫吸附實驗(ELISA)法檢測MPO、MDA水平 各組ZDF大鼠再灌注60 min后，用含有EDTA抗凝劑采血管采血2 ml，3 000 r/min離心10 min(離心半徑10 cm)，收集分離血清后靜置于-20 ℃冰箱，測定ZDF大鼠MPO、MDA水平。

2 結果

2.1 心肌組織超微結構 透射電鏡下對照組線粒體和心肌細胞形態結構正常，未見明顯自噬體(見圖1A)；缺血再灌注組線粒體腫脹明顯，嵴突紊亂、斷裂甚至消失，心肌細胞明顯水腫，肌絲斷裂、溶解，肌小節明暗帶模糊不清，細胞器結構破壞，胞質內可見許多大小不等的空泡或空腔及少量自噬泡，細胞膜破裂，細胞內容物泄漏(見圖1B)；缺血預處理組、穴位埋線組與缺血再灌注組相比，心肌細胞超微結構損傷較輕，且自噬泡數量明顯增多；缺血再灌注組心肌細胞超微結構破壞較缺血預處理組嚴重，且未見明顯自噬泡(圖1C、D)。

2.2 4組ZDF大鼠GRP78、Beclin-1水平比較 4組ZDF大鼠GRP78、Beclin-1水平比較，差異有統計學意義(P<0.05)。缺血再灌注組、缺血預處理組、穴位埋線組GRP78、Beclin-1水平高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)；缺血預處理組、穴位埋線組 GRP78、Beclin-1水平高于缺血再灌注組，差異有統計學意義(P<0.05，見表1、圖2)。

Table1 Comparison of the levels of GRP78 and Beclin-1 among the 4 groups of ZDF rats

組別只數GRP78Beclin-1對照組60.47±0.020.77±0.04缺血再灌注組60.74±0.04a0.97±0.02a缺血預處理組60.73±0.01ab1.28±0.02ab穴位埋線組61.74±0.05ab1.29±0.05abF值816.709150.053P值<0.001<0.001

注：GRP78=葡萄糖調節蛋白78；與對照組比較，aP<0.05；與缺血再灌注組比較，bP<0.05

注：GRP78=葡萄糖調節蛋白78

圖2 4組ZDF大鼠GRP78、Beclin-1表達

Figure2 Expression levels of GRP78 and Beclin-1 among 4 groups of ZDF rats

2.3 4組ZDF大鼠MPO、MDA水平比較 4組ZDF大鼠MPO、MDA水平比較，差異有統計學意義(P<0.05)。對照組MPO、MDA水平低于缺血再灌注組、缺血預處理組、穴位埋線組，差異有統計學意義(P<0.05)；缺血預處理組、穴位埋線組 MPO、MDA水平低于缺血再灌注組，差異有統計學意義(P<0.05，見表2)。

注：圖A為對照組，圖B為缺血再灌注組，圖C為缺血預處理組，圖D為穴位埋線組

圖1 各組ZDF大鼠心肌組織透射電鏡顯示結果(×8 200)

Figure1 Results of examination of myocardium in the 4 groups of ZDF rats by transmission electron microscope

Table2 Comparison of levels of MPO and MDA among the 4 groups of ZDF rats

組別只數MPO(U/g)MDA(μmol/g)對照組62.34±0.111.98±0.26缺血再灌注組618.35±0.38a4.34±0.46a缺血預處理組65.64±0.15ab2.89±0.34ab穴位埋線組66.97±0.35ab3.23±0.88abF值1905.7338.520P值<0.0010.007

注：MPO=髓過氧化物酶，MDA=丙二醛；與對照組比較，aP<0.05；與缺血再灌注組比較，bP<0.05

3 討論

ERS是應激發生時在細胞中的最初反應[7]，是某種原因所致的細胞內質網穩態失衡，并引起生理功能紊亂的一種亞細胞器上的病理過程[8]。目前研究已證實，ERS參與多種心血管疾病的病理生理過程，并發揮著非常重要的作用，其在細胞內介導保護性反應和凋亡反應[9],而GRP78是其介導這兩種反應的關鍵信號因子。在一定程度上，GRP78水平反應了細胞ERS保護性反應水平[10]。Beclin-1作為細胞自噬的關鍵調控因子，其是形成自噬體不可或缺的因素，通過與配體結合來調節細胞內自噬活性[11]。

ERS可通過多條信號通路調節自噬，與維持內質網正常功能關系密切[12-14]。ERS誘導細胞發生自噬[15-21]，而自噬可減輕內質網負擔，這可能與細胞抗凋亡的代償機制有關[22]。ERS時未折疊蛋白反應激活自噬，而自噬通過降解錯誤折疊或未折疊蛋白，減輕內質網負荷，抑制過度激活的ERS；但過度激活的ERS-自噬又會造成細胞損傷的加重，甚至導致細胞死亡。

臨床將透射電鏡觀察自噬體囊泡作為判定自噬的金標準[23-25]。本研究制備ZDF大鼠心肌缺血再灌注損傷模型，透射電鏡觀察示：除對照組外，其余3組ZDF大鼠心肌組織均表現出不同程度的梗死以及梗死后的缺血壞死，提示心肌缺血再灌注損傷模型成功建立；與缺血再灌注組相比，缺血預處理 組及穴位埋線組的心肌超微結構損傷較輕，且自噬泡數量增多；穴位埋線組與缺血預處理組的損傷相對較輕，提示穴位埋線與缺血預處理具有近似的心肌保護作用。

心肌缺血再灌注期間，缺血預處理組及穴位埋線組GRP78、Beclin-1水平明顯高于缺血再灌注組，提示缺血預處理組和穴位埋線組可通過調控ERS-自噬通路對細胞凋亡發揮抑制作用，從而對損傷心肌起到保護作用。

MPO、MDA是反映機體氧化應激情況的重要指標[26-27]。本實驗結果顯示，缺血再灌注組MPO、MDA水平明顯升高，說明缺血區發生炎性反應，自由基增多，進而誘導心肌組織損傷加劇。而缺血預處理組及穴位埋線組的MPO、MDA水平雖高于對照組，但較缺血再灌注組明顯降低，說明兩種預處理手段均可減輕缺血再灌注損傷。

本研究采用經典的中醫外治法——穴位埋線，通過可吸收縫合線的持久性刺激與穴位功效相結合，具有實用性及易操作等優點。俞募配穴是治療心臟疾病的常用配穴，可調暢氣機、寬胸理氣。膻中穴是心包的募穴，八會穴之一；心俞穴是心經背俞穴；內關穴是心包經的絡穴，也是八脈交會穴之一，與心經相通，因而也常配合應用。無菌操作下，將可吸收縫合線(聚乙醇酸PGA縫線)剪成1 cm左右，放入0.7×30 TWLB一次性無菌注射針針頭中。確定刺入上述穴位前，用愛爾碘局部皮膚常規消毒，一次性無菌注射針刺入穴位后用特制平頭針將縫合線推入穴位中，縫合線埋入穴位后迅速出針并用無菌棉球按壓止血。該法既簡便易行，又彌補針灸治療結束后療效衰減的不足，在治療慢性疾病方面優勢突出。

本實驗通過多水平、多角度對缺血再灌注損傷心肌ERS-自噬通路機制進行研究發現，穴位埋線與缺血預處理作用近似，可能是其可發揮內源性保護。對ERS-自噬通路的激活，可能是穴位埋線通過促進GRP78、Beclin-1水平升高，維持內質網正常功能并減輕其負擔，以及適度調節自噬活性、抗凋亡及抑制過度ERS，從而起到對再灌注損傷心肌的保護作用。對于穴位埋線治療心肌缺血再灌注損傷的作用機制，仍需深入研究。

作者貢獻：王一茗進行研究設計與實施、資料收集整理、撰寫論文并對文章負責；張新昕、束彥頁進行研究實施、資料收集；王一茗進行質量控制及審校。

本文無利益沖突。

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MechanismofCatgutImplantationatAcupointsfortheProtectionofMyocardiumfromIschemia-reperfusionInjuryinHyperlipidemiaRatswithType2DiabetesMellitus

WANGYi-ming1*，ZHANGXin-xin2，SHUYan-ye1

1.DepartmentofAcupunctureandMoxibustion,AffiliatedHospitalofJiangsuUniversity，Zhenjiang212001,China2.JiangsuUniversityHospitalWorkers，Zhenjiang212013，China

ObjectiveTo explore the mechanism of catgut implantation at acupoints for the protection of myocardium from ischemia-reperfusion injury in hyperlipidemia zucker diabetic fatty (ZDF)rats,models of type 2 diabetes mellitus,in order to provide a theoretical basis for clinical treatment.MethodsThis study was conducted during January 2015 to May 2016.Twenty-four ZDF rats were selected and randomly divided into control group,ischemia reperfusion (IR) group,ischemic pretreatment (IP) group and catgut implantation (CI) group，with 6 in each.On the 7th day after one week of adaptive feeding,myocardial tissues of the control group were taken out via thoracotomy,the other three groups were used for establishing IR models after ligation of the left anterior descending coronary artery.IR group first

myocardial ischemia treatment for 30 min,then received reperfusion for 60 min.IP group received 3 rounds of 5-min myocardial ischemia treatment and 5-min reperfusion,then received 30-min myocardial ischemia treatment and 60-min reperfusion.CI group received the same treatment given to IR group except on the first day after one week of adaptive feeding,they received catgut implantation at Neiguan,Danzhong,and Xinshu acupoints.The ultrastructure and level of autophagy of myocardium of ZDF rats were observed by transmission electron microscope.Western blotting was used to detect the levels of myocardial endoplasmic reticulum stress-related protein glucose-regulated protein 78 (GRP78) and autophagy-related protein Beclin-1.The levels of myeloperoxidase (MPO) and malondialdehyde (MDA) were measured by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).ResultsTransmission electron microscope observation showed that,the control group demonstrated normal mitochondria and cardiomyocytes without many autophagysomes;IR group presented significantly swollen mitochondria and cardiomyocytes with ruptured cell membrane and leaked contents,leaving vacuoles or cavities and a small amount of autophagic vacuoles.Compared with IR group,the myocardial cell ultrastructural damage in IP and CI groups was lighter and the number of autophagic vacuoles was significantly increased.The myocardial cell ultrastructural damage in IR group was the most serious,even there were no many autophagic vacuoles.The levels of GRP78,Beclin-1,MPO and MDA were significantly lower in the control group than in the other three groups (P<0.05).IR group had lower levels of GRP78 and Beclin-1 but higher levels of MPO and MDA compared with IP and CI groups (P<0.05).ConclusionCatgut implantation at Neiguan,Danzhong,and Xinshu acupoints may play a role in the protection of myocardium from ischemia-reperfusion injury by increasing the levels of GRP78 and Beclin-1.

Reperfusion injury;Rats;Endoplasmic reticulum stress;Autophagy;Ischemic pretreatment,myocardium;Catgut implantation at acupoints

R 619.9

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2017.00.074

2017-03-15；

2017-08-12)

(本文編輯：崔莎)

國家自然科學基金青年科學基金項目(81303037)

1.212001江蘇省鎮江市，江蘇大學附屬醫院針灸科 2.212013江蘇省鎮江市，江蘇大學職工醫院

*通信作者：王一茗，主治中醫師；E-mail:kingonetea@163.com

*Correspondingauthor:WANGYi-ming，AttendingTCMdoctor；E-mail:kingonetea@163.com