灰葡萄孢毒素對產后蒜薹的致病性及其毒素基因的檢測

王勇，張春祥，高葦，孔慶學，閻瑞香，張娜

(1.天津市植物保護研究所，天津 300381；2. 天津農學院，天津 300384；3. 國家農產品保鮮工程技術研究中心(天津)/農業部農產品貯藏保鮮重點實驗室，天津 300381)

灰葡萄孢毒素對產后蒜薹的致病性及其毒素基因的檢測

王勇1，張春祥1，高葦1，孔慶學2，閻瑞香3，張娜3

(1.天津市植物保護研究所，天津 300381；2. 天津農學院，天津 300384；3. 國家農產品保鮮工程技術研究中心(天津)/農業部農產品貯藏保鮮重點實驗室，天津 300381)

為明確灰葡萄孢毒素對產后蒜薹的致病性及其毒素基因的檢測方法，本研究運用蒜薹灰霉病強致病菌株灰葡萄孢霉BC-3，通過蒜薹懸滴接種法、系統侵染法和毒素浸漬法，測定灰葡萄孢毒素對蒜薹薹條和薹苞組織損傷及細胞葉綠素降解的活性。結果表明，灰葡萄孢毒素是導致產后蒜薹灰霉病的重要因素，可造成蒜薹組織細胞損傷、葉綠素降解，并可由輸導組織傳導造成蒜薹組織系統侵害。同時建立了灰葡萄孢毒素BcBOT2基因特異性檢測方法，可用于其引起的蒜薹灰霉病早期檢測。

灰葡萄孢霉；蒜薹；毒素；致病性；毒素基因

由灰葡萄孢霉(Botrytiscinerea)引起的產后蒜薹灰霉病，多在蒜薹入庫2～3個月后發生，導致蒜薹爛梢、爛基、斷條[1]，已成為蒜薹貯藏保鮮的重要限制性因素之一[2]?；移咸焰呙钩Ｔ谥参锇l育早期階段侵入宿主，并在相當長時間內保持沉默，直到宿主植物生理發生變化有利于其生長時，便快速引發宿主軟腐，造成成熟或衰老組織的嚴重破壞。究其原因是由于植物病原真菌在與宿主植物相互識別、相互作用的過程中所產生的次生代謝產物——真菌毒素導致產后蒜薹灰霉病的發生，而且在致病過程中起著決定因子的作用[3,4]。由灰葡萄孢霉中分離鑒定出的二環倍半萜烯毒素Botrydial毒性最高[5]，被認為是致病的關鍵因素，可引發辣椒、菜豆等黃萎和組織細胞破裂[6]，其余多為其前體或衍生物[7]。近年來，合成Botrydial的基因簇及其編碼的蛋白序列已經鑒定出來，其中BcBOT2基因負責編碼Botrydial合成途徑中關鍵酶——倍半萜合酶[8]，敲除BcBOT2基因的灰葡萄孢霉失去合成Botrydial和相關化合物的能力，菌株毒力基本喪失[9]。因此筆者從蒜薹灰霉病菌毒素對產后蒜薹組織的致病作用及毒素BcBOT2基因檢測入手，探索灰霉病菌毒素對蒜薹的致病性及其檢測方法，為產后蒜薹灰霉病的綠色防控提供依據。

1 材料與方法

1.1供試菌株

產后蒜薹灰霉病強致病力菌株BC-3，經鑒定為灰葡萄孢霉(Botrytiscinerea)，由天津市植物保護研究所種苗室分離、鑒定和保存。

1.2產后蒜薹灰霉病菌毒素濾液的制備

試驗采用PDA培養基(馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂粉18 g，加蒸餾水至1 L)和PD培養液。在250 mL三角瓶中分別加入PD培養液150 mL，共制備30瓶。

將供試蒜薹灰霉病菌BC-3移至PDA培養基上，于25℃下培養4 d，用直徑4 mm的打孔器在長勢一致的菌落邊緣打取菌餅，接種到裝有PD培養液的三角瓶中，每瓶接種5塊菌餅，在黑暗條件下25℃、120 r/min搖床振蕩培養。培養第0、3、6、7、9、12、14、15、18、21 d分別取一瓶培養液，將培養液通過雙層滅菌濾紙過濾除去菌絲體和孢子后，用0.22 μm微孔濾膜加壓抽濾，獲得無菌濾液，即蒜薹灰霉病菌毒素濾液。4℃冰箱中保存備用。

1.3蒜薹灰霉病菌毒素對產后蒜薹組織的致病作用

1.3.1 蒜薹灰霉病菌毒素對蒜薹細胞損傷的活性 采用毒素懸滴接種法。選取同一生長期的蒜薹薹條和薹苞，將其放在鋪有兩層浸濕濾紙的大培養皿中，在蒜薹薹條和薹苞表面采用接種針制造傷口，懸滴接種20 μL毒素濾液(分別為PD培養第0、3、6、9、12、15、18、21 d菌液毒素)于傷口表面，每處理重復3次，每重復3皿，每皿放入5個蒜薹薹條或薹苞，以接種20 μL無菌水為清水對照。同時用無菌水將毒素濾液稀釋10、100倍，以1、10、100倍液分別懸滴接種蒜薹薹條。將處理的蒜薹組織，于25℃培養箱中(光周期為12 h)保濕培養3 d后，調查毒素接種點的細胞損傷情況。

1.3.2 蒜薹灰霉病菌毒素對蒜薹組織系統影響的活性 采用毒素系統侵染法。取各毒素濾液5 mL加入到20 mL燒瓶中，將采集的同一生長期的蒜薹薹條和薹苞一端浸入濾液中，每處理重復3次，以浸入5 mL無菌水為清水對照。25℃培養箱中培養3 d后(光周期為12 h)，調查蒜薹薹條和薹苞的黃變程度。蒜薹黃變程度標準為：-，薹條或薹苞無顯著變化；+，薹條或薹苞部分失綠；++，薹條或薹苞整體失綠；+++，薹條或薹苞組織變黃。

1.3.3 蒜薹灰霉病菌毒素對蒜薹細胞葉綠素降解的活性 采用毒素浸漬法。取6 mm平皿，分別加入7、14、21 d獲得的毒素濾液3 mL，將采集的同一生長期的蒜薹薹條和薹苞切成10 mm苔段，浸入3 mL毒素濾液中，每處理重復3次，以浸入3 mL無菌水為清水對照。25℃培養箱中處理24、48 h后(光周期為12 h)，每處理蒜薹組織采用濾紙吸干毒素汁液后，采用10 mL丙酮乙醇溶液(丙酮∶無水乙醇=1∶1，V/V)室溫萃取，用紫外可見分光光度計測量OD663和OD645，計算葉綠素含量。毒素會對蒜薹細胞內葉綠素產生影響，通過檢測灰霉病菌毒素作用下蒜薹葉綠素降解程度，來確定毒素對蒜薹細胞葉綠素降解的活性。葉綠素含量計算方法：

葉綠素含量(mg/g)=(8.02×OD663+2.02×OD645×V)/(100×W)。

式中：V為毒素濾液體積；W為蒜薹質量。

1.4蒜薹灰霉病菌毒素基因的檢測

以灰葡萄孢霉Botrydial毒素BcBOT2基因6 781～8 807 bp區段為模板，采用Primer Premier 5.0軟件設計特異性引物(見表1)，由金維智公司合成。采用擴增體系：總體系25 μL(Master Mix 12.5 μL，引物F 1 μL，引物R 1 μL，DNA 1 μL，ddH2O 9.5 μL)進行PCR擴增。條件為：94℃預變性5 min；94℃變性45 s，53℃退火45 s，72℃延伸45 s，32個循環后，72℃延伸10 min。PCR產物由金維智公司測序，測序結果在GenBank數據庫中進行同源序列搜索比對。同時選取PCR擴增效果較好的引物，分別以蒜薹灰霉病菌BC-3、蔥鱗葡萄孢霉、鏈格孢、青霉P1、青霉P2、粉紅單端孢、鐮刀菌的DNA為模板進行PCR擴增和電泳以檢測引物的特異性。

表1 灰葡萄孢霉Botrydial毒素BcBOT2基因6 781～8 807 bp表達區段的特異性引物

2 結果與分析

2.1蒜薹灰霉病菌毒素對產后蒜薹組織的致病作用

2.1.1 蒜薹灰霉病菌毒素對蒜薹細胞損傷的活性 由毒素懸滴接種試驗結果(表2)可知，蒜薹灰霉病菌毒素可導致蒜薹薹條和薹苞細胞損傷，自接種點位置褪綠變黃，并擴展形成病斑，隨著培養時間的延長，接種點細胞壞死、黃變、擴展程度逐漸加重，明顯造成蒜薹組織細胞損傷，且毒素對蒜薹薹苞的損傷較薹條嚴重。

由懸滴接種法測定不同稀釋濃度毒素濾液對接種點細胞損傷試驗結果(表3)可知，由PD培養液培養3～21 d獲得毒素濾液，均可導致蒜薹薹條細胞損傷，使蒜薹自接種點位置褪綠變黃，并擴展形成病斑。且隨著蒜薹灰霉病菌培養時間的延長，薹條接種點細胞壞死、黃變、擴展程度逐漸加重。毒素濾液稀釋后對接種點細胞損傷下降，培養9～21 d毒素濾液稀釋10倍仍對蒜薹接種點細胞造成損傷；稀釋100倍毒素，僅15～21 d毒素濾液對蒜薹有損傷，且隨著稀釋倍數的增加，毒素對蒜薹組織細胞損傷明顯下降。

表2 蒜薹灰霉病菌毒素對蒜薹薹條和薹苞接種點細胞損傷的情況

注：“—”，接種點無顯著變化；“+”，接種點失綠；“++”，接種點失綠變黃；“+++”，接種點失綠變黃逐步擴展；“++++”，接種點失綠變黃擴展較大。下同。

表3 蒜薹灰霉病菌毒素的濃度變化對蒜薹薹條接種點細胞損傷的情況

2.1.2 蒜薹灰霉病菌毒素對蒜薹組織系統損傷的活性 由毒素系統侵染試驗結果(表4)可知，蒜薹灰霉病菌毒素可導致蒜薹薹條和薹苞系統損傷，造成薹條和薹苞整體褪綠變黃。說明毒素可通過蒜薹輸導系統傳導使蒜薹上部發生褪綠、黃化，對蒜薹產生毒性影響。且隨著PD培養獲取毒素時間的延長，由3～21 d獲取毒素導致蒜薹薹條和薹苞系統褪綠、黃變程度逐漸加重，明顯造成蒜薹組織系統損傷，且毒素對蒜薹薹苞的損傷較薹條嚴重。

2.1.3 蒜薹灰霉病菌毒素對蒜薹組織細胞葉綠素降解的活性 由毒素浸漬法測定不同稀釋濃度毒素濾液處理蒜薹薹條組織細胞葉綠素降解試驗結果(表5)可知，PD培養液培養7、14、21 d所獲取毒素濾液與清水對照相比，均可導致蒜薹薹條細胞葉綠素下降，且隨著蒜薹灰霉病菌培養時間的延長，薹條褪綠程度逐漸提高。毒素隨著培養時間的縮短以及稀釋倍數的提高，對蒜薹薹條組織葉綠素的降解能力降低，其中培養21、14、7 d后毒素濾液原液對蒜薹薹條組織細胞葉綠素降解率分別為72.83%、59.78%和47.83%，下降顯著；培養21、14、7 d毒素稀釋100倍后，降解率分別為29.35%、27.17%和26.09%，降解無顯著差異。

表4 蒜薹灰霉病菌毒素對蒜薹組織系統損傷的情況

注：蒜薹黃變程度標準為：—，薹條或薹苞無顯著變化；+，薹條或薹苞部分失綠；++，薹條或薹苞整體失綠；+++，薹條或薹苞組織變黃。

表5 蒜薹灰霉病菌毒素對蒜薹薹條組織細胞葉綠素降解的情況

由毒素濾液對蒜薹薹苞組織細胞葉綠素降解試驗結果(表6)可知，PD培養液培養7、14、21 d所獲取毒素濾液與清水對照相比，均可導致蒜薹薹苞細胞葉綠素下降，且與對薹條影響類似，隨著蒜薹灰霉病菌培養時間的延長，所獲毒素對薹苞褪綠程度也逐漸提高。毒素隨著培養時間的縮短以及稀釋倍數的提高，對蒜薹薹苞組織葉綠素的降解能力降低，其中培養21、14、7 d后毒素濾液原液對蒜薹薹苞組織細胞葉綠素降解率為57.74%、60.18%和40.93%，21 d和14 d之間無顯著差異，降解率顯著高于7 d的處理；培養21、14、7 d毒素稀釋100倍后，降解率分別為36.95%、30.09%和23.45%，隨著培養時間的縮短毒素對薹苞細胞葉綠素的降解顯著降低。

表6 蒜薹灰霉病菌毒素對蒜薹薹苞組織細胞葉綠素降解的情況

2.2蒜薹灰霉病菌毒素基因的檢測

以灰葡萄孢霉Botrydial毒素BcBOT2基因6 781～8 807 bp區段為模板，采用特異性引物(見表1)進行PCR擴增和電泳，其中引物對BCbot2-F2和BCbot2-R2可獲得較好擴增條帶，對PCR產物進行測序和比對，所獲PCR產物長337 bp，經比對，擴增區段包括灰葡萄孢霉Botrydial毒素BcBOT2基因7 156～7 410 bp區段序列。

進一步以蒜薹灰霉病菌BC-3、蔥鱗葡萄孢霉、鏈格孢、青霉P1、青霉P2、粉紅單端孢、鐮刀菌的DNA為模板，進行PCR擴增和電泳，由圖1可知，所獲引物可以特異性擴增灰葡萄孢霉Botrydial毒素BcBOT2基因。

1：灰葡萄孢霉BC-3；2：蔥鱗葡萄孢霉；3：鏈格孢；4：青霉P1；5：青霉P2；6：粉紅單端孢；7：鐮刀菌；M：DNA Marker

3 討論與結論

灰葡萄孢霉是引起產后蒜薹灰霉病的重要病原之一，其多為田間侵染于貯藏期危害，造成蒜薹爛梢、爛基和斷條。因此灰葡萄孢霉的早期檢測，對于蒜薹灰霉病的早期監測和防控有著重要意義。以毒素BcBOT2基因[10]7 156～7 410 bp區段序列為模板，以BCbot2-F2和BCbot2-R2為引物，可以特異性地檢測灰葡萄孢霉Botrydial毒素基因。BcBOT2基因是灰葡萄孢霉Botrydial毒素表達的重要基因，通過對BcBOT2的檢測可有效監測灰葡萄孢霉Botrydial毒素的形成，為由灰葡萄孢霉引起的蒜薹灰霉病提供早期檢測依據。

本研究通過蒜薹懸滴接種法、系統侵染法和毒素浸漬法測定，蒜薹灰霉病菌毒素對蒜薹薹條和薹苞組織損傷及蒜薹細胞葉綠素降解的活性比較，說明蒜薹灰霉病菌毒素對產后蒜薹組織有較強破壞作用，可導致蒜薹薹苞和薹條組織細胞損傷、葉綠素降解，并可由輸導組織傳導造成蒜薹組織的系統危害。同時發現隨著培養時間的延長，所獲毒素對蒜薹薹條和薹苞組織的損傷均逐漸加強，且隨著毒素濃度的降低，對蒜薹組織細胞損傷顯著下降。經驗證蒜薹灰霉病菌毒素是導致產后蒜薹灰霉病的重要因素之一。

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PathogenicitytoGarlicScapeandGeneDetectionofToxinfromBotrytiscinerea

Wang Yong1，Zhang Chunxiang1, Gao Wei1, Kong Qingxue2, Yan Ruixiang3, Zhang Na3

(1.TianjinInstituteofPlantProtection,Tianjin300381,China; 2.TianjinAgriculturalUniversity,Tianjin300384,China; 3.NationalEngineeringTechnologyResearchCenterforPreservationofAgriculturalProducts/KeyLaboratoryofStorageofAgri-Products,MinistryofAgriculture,Tianjin300381,China)

To make clear the pathogenicity of toxin fromBotrytiscinereato garlic scape and the detection method to toxin gene, theBotrytiscinereastrain BC-3 with high pathogenicity was selected as target. The bioassay of mycotoxin to tissue damage and cell chlorophyll degradation activity were tested by garlic scape droplet inoculation, systemic infection and toxin dipping. The results showed that the toxin ofBotrytiscinereawas the important pathogenic factor leading to garlic gray mold. The toxin could lead to tissue injury, chlorophyll degradation and garlic conducting tissue damage. At the same time, the specific detection method to toxin geneBcBOT2 was established. The method could be used to the early detection of garlic gray mold caused byBotrytiscinerea.

Botrytiscinerea; Garlic scape; Toxin; Pathogenicity; Toxin gene

S436.33

A

1001-4942(2017)10-0076-05

10.14083/j.issn.1001-4942.2017.10.016

2017-02-06

國家科技支撐計劃課題“物流蒜薹綠色防腐與安全保鮮技術綜合示范”(2015BAD16B00)；農業部農產品貯藏保鮮重點實驗室開放基金項目“灰霉菌毒素對采后蒜薹的致病機制及檢測、控制研究”(20150901)

王勇(1971—)，女，研究員，主要從事植物病害及其生物-生態防治研究。E-mail：wangyongwb@126.com