南極冰藻DNA光修復酶脂質體的制備及其質量評價

李 然，陳 璐，齊 娟，金 青，繆錦來

(1.青島科技大學，山東 青島 266042；2.國家海洋局第一海洋研究所，山東 青島 266061；3.青島海洋科學與技術國家實驗室，山東 青島 266235；4.青島大學，山東 青島 266071)

南極冰藻DNA光修復酶脂質體的制備及其質量評價

李 然1，2，陳 璐1，2，齊 娟1，金 青1，繆錦來2，3，4*

(1.青島科技大學，山東 青島 266042；2.國家海洋局第一海洋研究所，山東 青島 266061；
3.青島海洋科學與技術國家實驗室，山東 青島 266235；4.青島大學，山東 青島 266071)

以包封率為評價指標，氯仿-乙醚混合溶劑(2∶3，體積比)為有機相，固態大豆卵磷脂和膽固醇為膜材，采用逆向蒸發法制備南極冰藻DNA光修復酶脂質體。經單因素實驗和正交實驗確定光修復酶脂質體的最佳制備工藝條件為：膜材比3∶1、藥脂比1∶10、油相與水相體積比4∶1、超聲時間6 min，在此條件下，光修復酶脂質體的平均包封率達到(44.13±2.90)%。所制得的光修復酶脂質體呈圓形或橢圓形，平均粒徑為(490.9±2.3) nm，Zeta電位在-30～-60 mV范圍內，制劑的質量標準符合中國藥典(2015版)要求，為DNA光修復酶在日用防曬品中的應用提供了可靠的理論依據。

脂質體；包封率；南極冰藻DNA光修復酶脂質體；正交實驗；質量評價

近年來，關于光修復酶在動物和人體細胞中的修復活性研究越來越多。Decome等[1]通過人體皮膚角質層細胞的實驗研究證實，光修復酶能夠有效地修復紫外輻射形成的CPDs產物，減少單鏈受損 DNA。Stege等[2]利用大腸桿菌表達Anacystisnidulans的光修復酶，將其應用于經過紫外輻射的皮膚上，發現光修復酶可以有效地減緩由紫外輻射引起的皮膚過敏反應。Berardesca等[3]進一步研究發現，在傳統的防曬霜中添加Anacystisnidulans光修復酶能夠增強對皮膚的保護作用，避免紫外輻射對皮膚的損害。

本實驗室研發的南極冰藻DNA光修復酶作為一種新型的生物活性成分，主要起著防護和修復紫外線損傷的功能。與一般的傳統護膚品不同，南極冰藻DNA光修復酶的防護機理是一個主動的修復過程，主動修復皮膚細胞內因紫外輻射而產生的嘧啶二聚體，從而保護皮膚，防治黑色素瘤和皮膚癌等紫外線損傷所引起的惡性疾病。傳統防曬護膚品主要對紫外線起到一個“防”的作用，而光修復酶起到了“治”的目的，即可以修復受損細胞的DNA結構。隨著人們對紫外線損傷皮膚機理研究的不斷深入，防曬護膚品從傳統的防曬逐步向基因修復方向轉型，南極冰藻DNA光修復酶成為了研究熱點。

脂質體(liposomes)是由一種或多種兩親性分子雙層膜包裹而成的具有一個或多個水性腔室的微泡，脂質體直徑一般在25～1 000 nm之間，處于膠體范圍，呈高分散均勻狀態，穩定性高，外觀色澤透明，具有“丁達爾”現象。將藥物包裹或鑲嵌在脂質體中可得到脂質體藥物，主要通過包封率、包封藥物泄露粒徑及粒度分布等評價其物理穩定性，藥物的包封率是評價脂質體制劑質量的重要指標[4]。光修復酶不同于普通藥物，在制備過程中酶活性會受溫度、pH值等因素的影響，因此，在制備光修復酶脂質體時不僅需要保證一定的包封率，還要最大限度地保證光修復酶的活性不受損失。

以包封率為評價指標，以氯仿-乙醚混合溶劑為有機相，以固態大豆卵磷脂和膽固醇為膜材，采用逆向蒸發法制備南極冰藻DNA光修復酶脂質體(以下簡稱光修復酶脂質體)，通過單因素實驗和正交實驗對光修復酶脂質體的制備工藝進行優化，并對所得光修復酶脂質體進行了質量評價。

1 實驗

1.1 材料、試劑與儀器

南極冰藻DNA光修復酶，自制。

牛血清白蛋白，索萊寶；其余試劑均購自國藥集團化學試劑有限公司。

UV2550型紫外分光光度計，日本島津公司；JEM-2100型透射電子顯微鏡，日本電子公司。

1.2 方法

1.2.1 蛋白質含量的測定[5]

采用考馬斯亮藍法測定蛋白質含量?？捡R斯亮藍染料在酸性條件下為游離狀態，呈紅色，在460 nm處有吸收；與蛋白質結合后呈深藍色，在595 nm處有吸收[6]；蛋白質濃度在一定范圍內與595 nm處吸光度呈線性關系，據此測定蛋白質含量。

標準曲線的繪制:配制0.1 mg·mL-1牛血清白蛋白標準溶液，精密移取100 μL、200 μL、300 μL、400 μL、500 μL、600 μL、700 μL、800 μL，定容，加入考馬斯亮藍G-250溶液，測定595 nm處吸光度，以牛血清白蛋白濃度為橫坐標、吸光度為縱坐標繪制標準曲線。

1.2.2 包封率的測定

因為蛋白質等大分子的包封率較低，只有部分是包封進脂質體里的，大部分是游離狀態的，直接測定藥物含量會影響檢測結果的準確性。故采用超速離心法先分離游離的蛋白質和脂質體[7]，再按照中國藥典(2015版)計算包封率。

1.2.3 光修復酶脂質體的制備工藝優化

首先以光修復酶脂質體的成膜狀態和穩定性為評價指標，選擇適宜的膜材；以有機溶劑的物理性質和溶解膜材的能力以及成膜情況為評價指標，選擇適宜的有機相；以粒徑、PDI、包封率為評價指標，選擇適宜的制備方法[8-10]；然后以包封率為評價指標，采用單因素實驗考察緩沖液pH值、膜材比(固態大豆卵磷脂與膽固醇的質量比)、藥脂比(光修復酶與固態大豆卵磷脂的質量比)、油相與水相體積比、超聲時間對包封率的影響；最后在單因素實驗的基礎上，以膜材比、藥脂比、油相與水相體積比、超聲時間為考察因素，進行L9(34)正交實驗，優化光修復酶脂質體的制備工藝。

1.2.4 光修復酶脂質體的質量評價

從形態、平均粒徑及分布、Zeta電位及分布、穩定性、包封的光修復酶活性等方面對光修復酶脂質體進行質量評價[11]。

包封的光修復酶活性參照王玉珍等[12]的DNA光修復酶活性檢測方法。單鏈核苷酸d(pT)16在265 nm處有吸收，經100 μW·cm-2紫外照射后會形成嘧啶二聚體，嘧啶二聚體在265 nm處沒有吸收，單鏈核苷酸引物的吸光度隨之減小。DNA光修復酶可以使嘧啶二聚體解聚形成單鏈核苷酸，使引物在265 nm處的吸光度增大。故可以根據嘧啶二聚體的解聚程度，即265 nm處吸光度的變化來判斷光修復酶活性大小。

2 結果與討論

2.1 蛋白質標準曲線

以牛血清白蛋白濃度(c)為橫坐標、吸光度(A)為縱坐標繪制標準曲線，如圖1所示。

圖1 牛血清白蛋白的標準曲線Fig.1 Standard curve of bovine serum albumin

對圖1曲線進行線性回歸分析，得到回歸方程：A=0.00801c+0.00486，R2=0.99928，牛血清白蛋白濃度在10～80 μg·mL-1范圍內與吸光度線性關系良好。

2.2 光修復酶脂質體的制備工藝優化

2.2.1 膜材的選擇

分別選擇液態大豆卵磷脂和固態大豆卵磷脂作為膜材制備光修復酶脂質體。從外觀上看，2種光修復酶脂質體均可溶于有機相并可形成澄清透明的淡黃色液體，旋轉蒸發有機溶劑后成膜均勻，貼于器壁上，但水化過程中固態大豆卵磷脂較易從器壁上洗脫。放置10 d后，以液態大豆卵磷脂制備的光修復酶脂質體易發生聚集融合，有少量的膽固醇析出，而以固態大豆卵磷脂制備的光修復酶脂質體呈穩定的乳白色混懸液。綜合兩者的成膜狀態和穩定性，選擇固態大豆卵磷脂作為膜材。

2.2.2 有機相的選擇

對比氯仿、乙醇、乙醚3種有機溶劑的物理性質(沸點、密度、毒性)和溶解膜材的能力以及成膜情況發現：乙醇來源方便、安全，但對膜材的溶解能力不佳并且成膜過程中會析出膽固醇，并不是理想的成膜材料；乙醚對膜材的溶解性和成膜性較好，但沸點太低，揮發太快，在旋轉蒸發過程中需要嚴格控制溫度；氯仿因密度較大，與水混溶不易形成W/O型乳劑。參考有機相的密度，氯仿與乙醚的體積比為2∶3時與水的密度相近，超聲過程中更易形成穩定的W/O型乳劑，可提高藥物的包封率，因此，選擇氯仿-乙醚(2∶3，體積比)作為有機相。

2.2.3 脂質體制備方法的選擇

以粒徑、PDI、包封率為評價指標，對3種制備方法進行比較，結果見表1。

表13種制備方法的比較

Tab.1Comparison of three preparation methods

由表1可知，根據粒徑分析，逆向蒸發法最佳，原因是逆向蒸發法制備的光修復酶脂質體的內水相體積大，導致粒徑小[13]；PDI反映了分散體系的穩定程度，根據PDI分析，逆向蒸發法制備的光修復酶脂質體最穩定，其次是薄膜分散法，最不穩定的是乙醇注入法；根據包封率分析，薄膜分散法和逆向蒸發法相差不大。鑒于逆向蒸發法適合于包封水溶性藥物和分子量較大的生物活性物質[14]，選擇逆向蒸發法作為光修復酶脂質體的制備方法。

2.2.4 單因素實驗結果

2.2.4.1 緩沖液pH值對包封率的影響

磷脂成分在pH值為6.5時最穩定，水解速率常數最小[15]。同時pH值的改變會使脂質體藥物發生相分離，膜上形成孔洞或發生膜融合，脂質體內包封的藥物會迅速滲漏，從而影響脂質體藥物的穩定性[16]。因此，適宜的pH值可以維持脂質體藥物的穩定性和減緩磷脂水解速度，故在制備脂質體藥物時常加入緩沖液，使pH值處于脂質體藥物最穩定的pH值范圍內。緩沖液pH值對包封率的影響如圖2所示。

由圖2可以看出，當緩沖液pH值為7時脂質體的包封率最高。

2.2.4.2 膜材比對包封率的影響(圖3)

由圖3可以看出，包封率隨著膜材比的增大先升高后降低，在膜材比為3∶1時包封率最高。這主要是因為：一方面當固態大豆卵磷脂量過大時，水化較困難，易凝聚，導致包封率下降[17]；另一方面當膽固醇量過大時，脂質體膜親水性增強、膜易被破壞，導致內水相的藥物滲漏[18]，包封率下降。

圖2 緩沖液pH值對包封率的影響Fig.2 Effect of pH value of buffer solution onentrapment efficiency

圖3 膜材比對包封率的影響Fig.3 Effect of membrane-material ratio onentrapment efficiency

2.2.4.3 藥脂比對包封率的影響(圖4)

圖4 藥脂比對包封率的影響Fig.4 Effect of drug-lipid ratio on entrapment efficiency

由圖4可以看出，隨著藥脂比的增大即光修復酶加入量的增加，包封率呈下降趨勢。這可能是因為，脂質體空間是有限的，載藥量是一定的，當光修復酶加入量逐漸增加時，脂質膜無法包封所有的光修復酶，導致包封率降低。

2.2.4.4 油相與水相體積比對包封率的影響(圖5)

圖5 油相與水相體積比對包封率的影響Fig.5 Effect of volume ratio of oil phase to waterphase on entrapment efficiency

由圖5可以看出，油相與水相體積比為4∶1時包封率最高。這是因為，當油相比例較小時，趨向于反相形成O/W型乳劑，不能很好形成W/O型乳劑，光修復酶不能進入脂質體中[19]，包封率相應較低；當水相比例較小時，光修復酶的濃度較大，而脂質體的容納空間是有限的，增加水相的量反而易于造成藥物滲漏，導致穩定性下降，包封率下降。

2.2.4.5 超聲時間對包封率的影響(圖6)

圖6 超聲時間對包封率的影響Fig.6 Effect of ultrasonic time on entrapment efficiency

由圖6可以看出，包封率隨著超聲時間的延長先升高后降低，在超聲時間為6 min時包封率最高。這是因為，超聲時間過短，不能形成穩定的W/O型乳劑，光修復酶不能進入脂質體內部，包封效果不理想，包封率較低；超聲時間過長，一方面包封率會下降，另一方面包封的光修復酶活性有所損失。

2.2.5 正交實驗結果

正交實驗的因素與水平見表2，結果與分析見表3。

由表3可知，各因素對包封率的影響大小依次為：藥脂比>膜材比>超聲時間>油相與水相體積比，最優組合為A2B1C2D2，即膜材比3∶1、藥脂比1∶10、油相與水相體積比4∶1、超聲時間6 min。

表2正交實驗的因素與水平

Tab.2Factors and levels of orthogonal experiment

表3正交實驗結果與分析

Tab.3Results and analysis of orthogonal experiment

在最優工藝條件下制備3批光修復酶脂質體，包封率平均值為44.13%，RSD為2.9%。表明，優化的制備工藝可靠，重復性好。

2.3 光修復酶脂質體的質量評價

2.3.1 形態

采用復染法進一步了解光修復酶脂質體的顆粒大小、形狀，通過透射電鏡觀察其形貌，如圖7所示。

由圖7可以看出，在光修復酶脂質體的染色過程中，游離的光修復酶沒有被分離開，對黑色背景造成了干擾。但還是可以看到光修復酶脂質體呈橢圓形，外觀規則，表明藥物被成功包封。

2.3.2 平均粒徑及分布

脂質體藥物的包封率和穩定性與其粒徑大小及分布相關，當其粒徑變小，粒度分布集中，有利于提高脂質體藥物的穩定性。測定了3批光修復酶脂質體的粒徑，其中一批的粒徑分布如圖8所示。

由圖8可以看出，光修復酶脂質體的平均粒徑為(490.9±2.3) nm，粒度分布均勻且集中。

2.3.3 Zeta電位及分布

Zeta電位是判斷脂質體藥物穩定性的重要指標，帶電荷的離子可以防止脂質體離子間的相互作用，避免聚集和沉降。光修復酶脂質體Zeta電位分布如圖9所示。

圖7 光修復酶脂質體的掃描電鏡和透射電鏡照片Fig.7 SEM and TEM images of photolyase liposome

圖8 光修復酶脂質體的粒徑分布Fig.8 Particle size distribution of photolyase liposome

圖9 光修復酶脂質體的Zeta電位分布Fig.9 Zeta potential distribution of photolyase liposome

由圖9可以看出，光修復酶脂質體的Zeta電位在-30～-60 mV范圍內，為-49.4 mV，表面帶負電荷，體系比較穩定。

2.3.4 穩定性

光修復酶脂質體于4 ℃、20 ℃分別放置0 d、5 d、10 d、15 d、20 d、25 d、30 d后的包封率如圖10所示。

圖10 光修復酶脂質體在不同溫度下的包封率曲線Fig.10 Entrapment efficiency curve of photolyaseliposome at different temperatures

由圖10可以看出，在不同溫度下，隨著放置時間的延長，包封率均有所下降，但4 ℃下包封率下降較緩慢。這是因為，溫度過低，光修復酶脂質體內外水相會形成冰晶，使雙分子膜的滲透能力增強，破壞了膜的正常結構且光修復酶的活性也會受到影響；溫度過高，脂質體的穩定性降低，光修復酶的活性同樣會受到影響。故一般以4 ℃左右貯存脂質體混懸液較好[20]。

2.3.5 包封的光修復酶的活性

基于光修復酶脂質體可使嘧啶二聚體(265 nm處無吸收)解聚為單鏈核苷酸(265 nm處有吸收)，在紫外照射后破壞了DNA結構的光修復酶中加入光修復酶脂質體進行修復，評價包封的光修復酶的活性。

光修復酶紫外照射0 h、1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h后的吸光度變化曲線及加入光修復酶脂質體修復0 min、5 min、10 min、15 min、20 min的吸光度變化曲線如圖11所示。

由圖11可以看出，加入光修復酶脂質體后，265 nm處吸光度逐漸增大，說明嘧啶二聚體解聚為單鏈核苷酸，DNA損傷得以修復。表明，包封的光修復酶可以使紫外照射下的嘧啶二聚體發生解聚，從而引起吸光度的增大，證明其發揮了作用。

3 結論

以包封率為評價指標，氯仿-乙醚混合溶劑(2∶3，體積比)為有機相，固態大豆卵磷脂和膽固醇為膜材，采用逆向蒸發法制備南極冰藻DNA光修復酶脂質體。通過單因素實驗和正交實驗確定了光修復酶脂質體的最佳制備工藝為：膜材比3∶1、藥脂比1∶10、油相與水相體積比4∶1、超聲時間6 min，所制得的光修復酶脂質體平均包封率為(44.13±2.90)%，平均粒徑為(490.9±2.3) nm，Zeta電位在-30～-60 mV范圍內，制劑的質量標準符合中國藥典(2015版)要求。

圖11 吸光度變化曲線Fig.11 Absorbance change curves

南極冰藻DNA光修復酶脂質體可用于抵抗紫外線輻射，具有良好的性能，為后期研究DNA光修復酶在日用防曬品中的應用提供了可靠的理論依據。

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PreparationofDNAPhotolyaseLiposomefromAntarcticIceMicroalgaeandItsQualityEvaluation

LI Ran1,2,CHEN Lu1,2,QI Juan1,JIN Qing1,MIAO Jin-lai2,3,4*

(1.QingdaoUniversityofScienceandTechnology,Qingdao266042,China;2.FirstInstituteofOceanography,StateOceanicAdministration,Qingdao266061,China;3.QingdaoNationalLaboratoryforMarineScienceandTechnology,Qingdao266235,China;4.QingdaoUniversity,Qingdao266071,China)

Using entrapment efficiency as an evaluation index,the mixed solvent of chloroform-ether(volume ratio 2∶3) as an organic phase,and solid soybean lecithin and cholesterol as membrane materials,we prepared DNA photolyase liposome from Antarctic ice microalgae by a reverse evaporation method.Through single-factor experiment and orthogonal experiment,we optimized preparation conditions as follows:the ratio of membrane to material was 3∶1,the ratio of drug to lipid was 1∶10,the volume ratio of oil phase to water phase was 4∶1,and the ultrasonic time was 6 min.Under above conditions,the average entrapment efficiency of photolyase liposome was (44.13±2.90)%.The prepared photolyase liposome was round or oval sphere,the average particle size was (490.9±2.3) nm,and Zeta potential was in the range of -30 mV to -60 mV.The quality standard of the preparation meets the requirements ofChinesePharmacopoeia(2015 edition),which provides a reliable theoretical basis for the application of DNA photolyase in the daily sun screen.

liposome;entrapment efficiency;DNA photolyase liposome from Antarctic ice microalgae;orthogonal experiment;quality evaluation

TQ461

A

1672-5425(2017)10-0025-07

國家自然科學基金項目(41576187)，中央級公益性科研院所基本科研業務費專項資金項目(2016Q10)，國家自然科學基金委員會-山東省人民政府海洋科學研究中心聯合資助項目(U1606403)，國家海洋公益性行業科研專項(201405015)，山東省自主創新及成果轉化專項(2014ZZCX06202)，青島市創業創新領軍人才計劃項目(15-10-3-15-(44)-zch)，山東省重點研發計劃(2016YYSP017，2016ZDJS06A03，2017GHY15112)

2017-04-22

李然(1991-)，女，山東滕州人，碩士研究生，研究方向：藥物新劑型與新型給藥系統，E-mail:m17806265315@163.com；通訊作者：繆錦來，研究員，E-mail:miaojinlai@fio.org.cn。

10.3969/j.issn.1672-5425.2017.10.006

李然，陳璐，齊娟，等.南極冰藻DNA光修復酶脂質體的制備及其質量評價[J].化學與生物工程，2017，34(10)：25-31.